許時(shí)鴻，王菡穎，張智煒，王玉剛，劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)(徐州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，江蘇省免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州 221004；通訊作者,E-mail:liouzhuanzhuan12@163.com)

肥胖是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題，威脅人類的健康[1]。全球約有21億人受到肥胖影響，每年超過300萬人死于肥胖或其相關(guān)疾病。肥胖以脂肪組織增生為特征，主要由于能量攝入與消耗之間的不平衡造成[2]。人體包含3種類型的脂肪細(xì)胞，即棕色脂肪細(xì)胞、米黃色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞。棕色脂肪細(xì)胞由小脂滴組成，含有大量線粒體，通過消耗葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)提供熱量。白色脂肪細(xì)胞由大脂滴組成，含線粒體較少，是貯能細(xì)胞。米黃色脂肪細(xì)胞是白色脂肪細(xì)胞棕色化的產(chǎn)物[2-4]。棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞是小鼠適應(yīng)性非顫抖產(chǎn)熱反應(yīng)的重要細(xì)胞，調(diào)節(jié)全身的能量代謝，是預(yù)防和治療肥胖的重要靶標(biāo)[2,5]。

線粒體通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞代謝活動(dòng)提供動(dòng)力，該過程需要呼吸鏈的蛋白質(zhì)復(fù)合物參與。OXPHOS復(fù)合物包括復(fù)合物I(complex Ⅰ，CⅠ)、復(fù)合物Ⅱ(complex Ⅱ，CⅡ)、復(fù)合物Ⅲ(complex Ⅲ，CⅢ)、復(fù)合物Ⅳ(complex Ⅳ，CⅣ)、復(fù)合物Ⅴ(complex Ⅴ，CⅤ)。它們?cè)诰€粒體內(nèi)膜上可以獨(dú)立定位，也可以相互作用形成超級(jí)復(fù)合體，例如超級(jí)復(fù)合體Ⅰ+Ⅲ2+Ⅳ、超級(jí)復(fù)合體Ⅲ2+Ⅳ等[6]。線粒體超級(jí)復(fù)合體(supercomplexes，SCs)具有提高呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移效率、減少電子或質(zhì)子漏、提高線粒體復(fù)合體穩(wěn)定性等功能[7,8]。SCs還可以減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[9-11]，ROS被認(rèn)為是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因[12,13]，糖尿病患者體內(nèi)增多的ROS會(huì)影響SCs組裝并影響線粒體功能[14,15]。此外，線粒體SCs減少可能會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起肥胖及其代謝綜合征[16]。因此，建立脂肪組織線粒體SCs的分析方法，對(duì)于評(píng)估線粒體的功能具有一定價(jià)值。

線粒體SCs的傳統(tǒng)研究是通過抗體對(duì)單個(gè)亞基的量化[17]。盡管線粒體SCs是高度保守的，在植物、動(dòng)物和藻類等均有發(fā)現(xiàn)，但其具有動(dòng)態(tài)性和可塑性，在不同生物、不同組織和不同疾病模型下，其組裝不盡相同[18]。因此，Jha等[19]建立藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE)，客觀地反映了線粒體SCs在自然狀態(tài)的分子量和組裝情況。然而，該方法仍存在成本高昂、研究材料制備困難等弊端，本研究將進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，并用來檢測(cè)棕色脂肪線粒體SCs的表達(dá)和活性變化，為肥胖及其代謝性疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用小鼠為C57BL6/J小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，并于本校動(dòng)物屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXF(蘇)2020-0011。所用試劑如下：Ⅰ型膠原酶、PVDF膜(Sigma公司，美國)；考馬斯亮藍(lán)R-250、羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，HEPES)(北京索萊寶科技有限公司，中國)；BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，中國)；Ⅱ型膠原酶、5%洋地黃皂苷、4%～16%非變性聚丙烯酰胺凝膠、5%考馬斯亮藍(lán)G-250添加劑、電泳緩沖液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、BN-PAGE陽極緩沖液、深藍(lán)色和淺藍(lán)色陰極緩沖液等(Thermo Fisher公司，美國)；適用于BN-PAGE的線粒體氧化磷酸化混合抗體(Abcam公司，英國)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，中國)；線粒體分離緩沖液、CI、CⅡ、CⅣ的底物液(見試劑配制，各組分均購于生工生物，中國)；化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(翌圣生物科技股份有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 工作流程 本研究的操作流程如圖1所示，收集小鼠的棕色脂肪組織，獲取棕色脂肪細(xì)胞，然后分離線粒體并檢測(cè)線粒體蛋白濃度。將線粒體用含有洋地黃皂苷的上樣緩沖液充分溶解，加入考馬斯亮藍(lán)G-250，完成樣品的制備。樣品加入凝膠孔內(nèi)，進(jìn)行BN-PAGE或無色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(clear native-PAGE，CN-PAGE)。BN-PAGE在室溫下進(jìn)行，然后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色或免疫印跡分析線粒體復(fù)合體的表達(dá)情況；CN-PAGE應(yīng)在冰上進(jìn)行，進(jìn)一步分析線粒體復(fù)合體的活性。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程示意圖Figure 1 Diagram of experimental procedure

1.2.2 棕色脂肪細(xì)胞獲取 取6～8周齡小鼠，CO2麻醉后脫臼處死。小心分離肩胛部棕色脂肪組織，盡可能剝離表面結(jié)締組織和白色脂肪組織。將棕色脂肪組織置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中清洗3次，轉(zhuǎn)移至無菌1.5 ml離心管中剪碎。50 mg組織加入500 μl消化液(Ⅰ型膠原酶1 mg/ml、Ⅱ型膠原酶1 mg/ml、牛血清白蛋白20 g/L、HEPES 1.2 g/L)，置于37 ℃水浴箱中消化1 h，每隔10 min搖晃一次。4 ℃，300g離心10 min。收集上層脂肪層，即為成熟的棕色脂肪細(xì)胞。沉淀部分含有血管基質(zhì)組分，經(jīng)過濾洗滌后，可用于原代棕色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)。

1.2.3 線粒體分離與純化 收集上述脂肪細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌并稱取細(xì)胞濕重，取10～30 mg細(xì)胞沉淀，加入200 μl預(yù)冷的分離緩沖液(isolation buffer，IB)(6.846 g蔗糖，0.121 g Tris，1 ml 0.1 mol/L EGTA/Tris溶于80 ml水中，用1 mol/L HEPES將pH調(diào)節(jié)至7.4，定容至100 ml)。線粒體分離之前，添加1×蛋白酶抑制劑。對(duì)于肝臟組織，取30 mg組織置于2 ml離心管中，加入200 μl預(yù)冷的IB。經(jīng)組織勻漿器勻漿，勻漿時(shí)間4 s，間歇6 s，持續(xù)6～8次，至肉眼無明顯可見大塊顆粒。勻漿后補(bǔ)加1.8 ml預(yù)冷的IB并混勻。將勻漿物于4 ℃，600g離心10 min，上清液含線粒體，沉淀為細(xì)胞碎片。收集上清液，4 ℃，7 000g離心10 min。棄去上清，沉淀重懸于2 ml預(yù)冷的IB中。經(jīng)離心洗滌后，將線粒體重懸于0.25 ml預(yù)冷的IB中。使用BCA試劑盒檢測(cè)線粒體蛋白質(zhì)濃度，然后按50 μg每管分裝，儲(chǔ)存于-80 ℃。使用前于4 ℃，7 000g離心10 min，使用移液器小心棄去上清，沉淀用于BN-PAGE。

1.2.4 藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 每50 μg蛋白加入20 μl樣品緩沖液(含5%洋地黃皂苷8 μl)，輕輕吹打溶解沉淀，在冰上孵育20 min。4 ℃，20 000g離心10 min，取上清15 μl，加入2 μl考馬斯亮藍(lán)G-250樣品添加劑后，置于冰上備用。將4%～16%非變性凝膠放入電泳槽中，用深藍(lán)色陰極緩沖液洗滌凝膠孔，并檢查內(nèi)槽是否泄漏。每孔上樣15 μl樣品，內(nèi)槽加入深藍(lán)色陰極緩沖液，外槽加電泳液，150 V電泳30 min。將內(nèi)槽更換為淺藍(lán)色的陰極緩沖液，250 V電泳60 min。小心取下凝膠，用ddH2O洗滌后，在轉(zhuǎn)膜液中輕輕搖動(dòng)15 min。PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，以激活PVDF膜。使用Bio-Rad小型垂直電泳裝置在冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，首先電流130 mA轉(zhuǎn)膜180 min，然后25 V轉(zhuǎn)膜30 min。隨后將PVDF膜放入8%的醋酸中，振搖5 min，以固定蛋白。用ddH2O洗滌2次，每次5 min，然后夾住膜的一側(cè)風(fēng)干。

用甲醇洗PVDF膜3次以去除考馬斯亮藍(lán)。然后經(jīng)ddH2O清洗PVDF膜3次，每次5 min。PVDF膜放入20 ml封閉液(含5%脫脂奶粉)中，室溫輕搖孵育1 h。用ddH2O清洗膜2次，每次5 min。PVDF膜與線粒體氧化磷酸化混合抗體孵育，4 ℃過夜。用洗滌緩沖液(Tris 1.21 g，氯化鈉5.84 g，吐溫-20 1 ml，定容至1 000 ml，調(diào)pH至7.5)洗滌2次，每次5 min。ddH2O洗滌2次，每次5 min。PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)孵育，室溫1 h。洗滌后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光液中，輕輕搖動(dòng)使之充分反應(yīng)，經(jīng)Bio-Rad掃描儀掃描圖像。使用ImageLab 5.2.1軟件處理圖像。

1.2.5 考馬斯亮藍(lán)染色 BN-PAGE后，可以用考馬斯亮藍(lán)染色顯示線粒體復(fù)合物和SCs。將凝膠放入100 ml固定液(40%甲醇，10%醋酸)中，用高功率微波(950～1 100 W)加熱45 s，室溫輕搖孵育30 min，棄掉固定液，重復(fù)此步驟一次。加入100 ml考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(0.02%考馬斯亮藍(lán)R-250，30%甲醇，10%醋酸)，微波爐加熱45 s，室溫輕搖孵育30 min，棄掉染色液。加入100 ml脫色液(8%醋酸)，微波爐加熱45 s，室溫輕搖脫色，直到條帶清晰可見。使用凝膠掃描儀或其他裝置進(jìn)行拍照。

1.2.6 線粒體復(fù)合體的凝膠內(nèi)活性測(cè)定 整個(gè)CN-PAGE過程應(yīng)在冰上進(jìn)行，電泳時(shí)使用兩塊凝膠，分別用于免疫印跡和凝膠內(nèi)酶活性測(cè)定。按1.2.4所述的方法制備樣品，置于冰上待用。使用淺藍(lán)色陰極緩沖液洗滌凝膠孔并檢查內(nèi)槽是否泄漏。樣品上樣15 μl，內(nèi)槽加入200 ml淺藍(lán)色陰極緩沖液，外槽加600 ml電泳緩沖液。150 V電泳30 min。將內(nèi)槽更換為電泳緩沖液，250 V電泳60 min。將凝膠放入預(yù)冷的ddH2O中。

將凝膠置于線粒體復(fù)合體對(duì)應(yīng)的底物溶液中進(jìn)行酶活性染色，約1 h后，棄染色底物溶液，加入10%醋酸終止反應(yīng)。CⅣ+CⅠ活性可以在同一凝膠上進(jìn)行，首先將凝膠放入CⅣ底物中孵育，出現(xiàn)適當(dāng)?shù)淖厣蚝稚盘?hào)后，用冰冷的ddH2O洗滌凝膠，然后在CⅠ底物中孵育。底物溶液配方如下：①CⅠ底物液：1 mol/L Tris·HCl(pH 7.4)40 μl，還原型輔酶Ⅰ 2 mg，氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NTB)50 mg，加ddH2O定容至20 ml；②CⅡ底物液：1 mol/L琥珀酸鈉200 μl，NTB 25 mg，250 mmol/L吩嗪硫酸甲酯8 μl，1 mol/L Tris·HCl 50 μl，ddH2O 9.742 ml；③CⅣ底物液：ddH2O 10 ml，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)50 mg，細(xì)胞色素C 100 mg，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)90 ml。

2 結(jié)果

2.1 小鼠棕色脂肪線粒體SCs和復(fù)合物的表達(dá)檢測(cè)

將小鼠棕色脂肪組織和肝臟組織的線粒體進(jìn)行BN-PAGE，免疫印跡或考馬斯亮藍(lán)染色均清晰地呈現(xiàn)了小鼠線粒體SCs的表達(dá)(見圖2)。由于在SCs形成過程中起主要作用的超復(fù)合體組裝因子Ⅰ Cox7a2l的突變，C57BL/6小鼠不能形成含有多個(gè)復(fù)合體Ⅳ的SCs，即缺乏SC3(Ⅰ+Ⅲ2+Ⅳ2)、SC4(Ⅰ+Ⅲ2+Ⅳ3)和復(fù)合體Ⅲ2+Ⅳ1[17,18]。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色后，棕色脂肪的線粒體SCs(SC1：Ⅰ+Ⅲ2+Ⅱn，SC2：Ⅰ+Ⅲ2+Ⅳ1，SC5：Ⅰ2+Ⅲ2)均清晰可見，分子量在720～1 236 kDa之間；而其余的線粒體復(fù)合體則分布于242～1 048 kDa之間，與預(yù)期分子量相符。棕色脂肪Ⅲ2+Ⅳ2、Ⅳ1表達(dá)較高，而Vn表達(dá)較低(見圖2A)。線粒體氧化磷酸化混合抗體，含有5種不同組分，即抗CⅠ-NDUFA9、CⅡ-70 kDa亞基(SDHA)、CⅢ-核心蛋白2(UQCRC2)、CⅣ-亞基Ⅳ(COX Ⅳ)和CⅤ-α亞基(ATP5A)的單克隆抗體，可檢測(cè)到復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和ATP合成酶。免疫印跡結(jié)果顯示棕色脂肪的SCs及單個(gè)復(fù)合體均可被檢測(cè)出，其中Ⅲ2+Ⅳ2、Ⅳ1表達(dá)較高，而SC2、Vn表達(dá)較低(見圖2B)。

A.考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果 B.免疫印跡檢測(cè)結(jié)果圖2 棕色脂肪線粒體復(fù)合物和肝臟線粒體各組分的表達(dá)Figure 2 Expression of mitochondrial complexes in brown adipose tissue and liver tissue

2.2 小鼠棕色脂肪線粒體復(fù)合體活性檢測(cè)

線粒體通過定位于內(nèi)膜上的5種蛋白復(fù)合體傳遞電子，完成氧化磷酸化，并生成ATP。我們用含有洋地黃皂苷的溶液溶解線粒體，采用CN-PAGE聯(lián)合酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，分析了棕色脂肪線粒體呼吸鏈CⅠ、CⅡ和CⅣ活性。CⅠ活性檢測(cè)反應(yīng)以NTB為顯色底物，有活性的CI及含CI的SCs呈紫色條帶。與肝臟不同的是，棕色脂肪在接近CⅡ的位置(約242 kD)也顯示有一條具有CⅠ酶活性的條帶(見圖3A)。CⅣ活性檢測(cè)反應(yīng)以細(xì)胞色素C為酶反應(yīng)底物，DAB為顯色底物，有酶活性的CⅣ及其超級(jí)復(fù)合體呈棕色。棕色脂肪CⅣ活性較肝臟高(見圖3B)。CⅡ活性檢測(cè)反應(yīng)以琥珀酸鈉為酶反應(yīng)底物、NTB為顯色底物，具有琥珀酸脫氫酶活性(主要是SDHA亞基活性)的位置呈紫色。與肝臟不同的是，棕色脂肪在Ⅳ1的下方也顯示有一個(gè)具有CⅡ活性的條帶(見圖3C)。另外，CⅠ和CⅣ活性可以在同一塊凝膠中檢測(cè)(見圖3D)。

A. CⅠ活性測(cè)定(紫色條帶為含CⅠ的蛋白復(fù)合物和SCs的酶反應(yīng)活性條帶) B. CⅣ活性測(cè)定(棕色條帶為含CⅣ的蛋白復(fù)合物和SCs的酶反應(yīng)活性條帶) C. CⅡ活性測(cè)定(紫色條帶為含CⅡ的蛋白復(fù)合物和SCs的酶反應(yīng)活性條帶) D. CⅣ與CⅠ活性測(cè)定(棕色和紫色分別為含CⅣ和CI的蛋白復(fù)合物和SCs的酶活性)圖中所有藍(lán)色條帶均為考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白條帶；SC1:Ⅰ+Ⅲ2+Ⅱn；SC2:Ⅰ+Ⅲ2+Ⅳ1; SC5:Ⅰ2+Ⅲ2圖3 棕色脂肪線粒體復(fù)合物酶活性檢測(cè)Figure 3 Enzyme activity in mitochondrial complex of brown adipocytes

3 討論

棕色脂肪的線粒體功能影響著肥胖與代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展。傳統(tǒng)研究線粒體的方法只能研究單一復(fù)合體的活性和表達(dá)，不能用于線粒體SCs的研究，而且多采用比色法檢測(cè)線粒體復(fù)合體活性，其結(jié)果不夠直觀。BN-PAGE操作簡單，使蛋白質(zhì)復(fù)合體在近似天然的狀態(tài)下分離，且不受樣本來源限制，同時(shí)分離可溶性、難溶性膜蛋白質(zhì)復(fù)合體。本研究成功構(gòu)建了棕色脂肪線粒體SCs的分析方法，研究了小鼠棕色脂肪細(xì)胞線粒體SCs的組成狀況并進(jìn)行了凝膠內(nèi)酶活性分析。

本研究選用C57BL/6J小鼠作為棕色脂肪組織來源，采用Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶混合消化，上層為棕色脂肪細(xì)胞。棕色脂肪細(xì)胞含脂滴，不易吸取，可用注射器吸去脂肪層下的液體和沉淀，進(jìn)一步洗滌獲得棕色脂肪細(xì)胞。不建議用年老小鼠分離棕色脂肪細(xì)胞或培養(yǎng)原代棕色脂肪細(xì)胞，因?yàn)樾∈笾厩绑w細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化的能力隨著年齡的增加而逐漸減退，棕色脂肪的產(chǎn)熱活性也逐漸降低[21,22]。另外，在提取線粒體時(shí)，先加少量的IB進(jìn)行勻漿，待勻漿結(jié)束后再補(bǔ)足IB，可使勻漿更充分且減少樣本的損耗。測(cè)定線粒體蛋白濃度前，沉淀需用適量的IB重懸，需根據(jù)沉淀量而調(diào)整，以免蛋白濃度過低。分裝好的線粒體可儲(chǔ)存在-80 ℃數(shù)年。

BN-PAGE可根據(jù)蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子大小分離完整的多亞單位復(fù)合物。電泳之前，在蛋白質(zhì)樣品中加入考馬斯亮藍(lán)G-250使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，同時(shí)不會(huì)破壞蛋白質(zhì)復(fù)合體天然結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)技術(shù)由Sch?gger建立，最初是為了研究哺乳動(dòng)物和細(xì)菌線粒體中的蛋白質(zhì)復(fù)合體[23]。BN-PAGE使用范圍廣、高效可靠、且不需要昂貴的儀器設(shè)備。在考馬斯亮藍(lán)染色和脫色過程中，要注意處理時(shí)間，避免染色時(shí)間或脫色時(shí)間過短致使條帶不清晰。采用免疫印跡檢測(cè)時(shí)，注意控制轉(zhuǎn)膜的電流和溫度。此外，棕色脂肪組織和棕色脂肪細(xì)胞所得的條帶不如肝臟清晰，即使加大樣本量至100 μg，仍不能得到類似肝臟的SCs條帶，這可能與棕色脂肪的SCs形成較少有關(guān)。

BN-PAGE分析所需的樣品量很小，該方法指示酶活性的改變可用于線粒體酶活性的鑒定和定量[24]。BN-PAGE和線粒體復(fù)合物的凝膠內(nèi)活性是測(cè)定SCs化學(xué)計(jì)量的一種有效、簡便的方法。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)免疫印跡相比，BN-PAGE允許在自然條件下分離蛋白質(zhì)，并保留了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，這對(duì)研究SCs具有重要意義[19]?；诒壬ǖ脑噭┖兄荒軐?duì)某一特定線粒體復(fù)合體的活性進(jìn)行定量分析，結(jié)果也不夠直觀；而BN-PAGE可以同時(shí)對(duì)多個(gè)線粒體SCs的表達(dá)和單個(gè)線粒體復(fù)合物的活性進(jìn)行定性和定量分析。此外，由于棕色脂肪中脂質(zhì)較多，在分析過程中很難完全去除這些脂質(zhì)，而這些脂質(zhì)會(huì)嚴(yán)重影響樣品OD值，使比色法試劑盒檢測(cè)的結(jié)果不準(zhǔn)確，BN-PAGE則幾乎不受其影響。

在分析線粒體復(fù)合物的表達(dá)情況時(shí)，利用實(shí)驗(yàn)室常用電泳系統(tǒng)進(jìn)行線粒體各組分的分離，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，以及ECL顯影。本研究優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作流程；對(duì)于操作者而言，技術(shù)門檻較低；對(duì)于實(shí)驗(yàn)室而言，可以節(jié)約有限的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，為研究棕色脂肪細(xì)胞功能特性提供了有利的實(shí)驗(yàn)手段。