繁萍，魏聰聰，李茹，駱寅梅，張瑞強

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青海省是我國少數(shù)以生態(tài)立省的省份[1]，因其區(qū)域地理環(huán)境特點，擔(dān)負(fù)著我國乃至亞洲的主要地理與生態(tài)安全屏障功能[2，3]。青海省內(nèi)不僅已經(jīng)建成和在建多個國家公園，而且也發(fā)展了國內(nèi)最大的天然有機牧場[4]，有機畜牧業(yè)已經(jīng)成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)。以牧草為主要食物的放牧動物，從原生牧草逐步更替為退化草場，再逐步發(fā)展為有機牧場的變化過程中，極有可能帶動消化道微生物多樣性發(fā)生變化。已有的一些相對廣泛的研究報道，多集中于單一種類動物，如藏羊[5]或牦牛[6，7]等，而對于同一牧場區(qū)域內(nèi)的不同放牧動物間的比較研究少見。此外，盡管認(rèn)為有機牧場良性發(fā)展有利于促進(jìn)畜牧業(yè)健康及提高畜產(chǎn)品質(zhì)量，但是食物品質(zhì)的變化對微生物的影響并不能以推測為依據(jù)。基于此，本論文采用宏基因組測序方法，對來自青海祁連縣的藏羊和牦牛的新鮮糞便樣本進(jìn)行了物種多樣性的比較分析。

1 材料與方法

1.1樣本 2020年8月采自青海祁連縣境內(nèi)牧場內(nèi)的藏羊和牦牛的新鮮糞便樣本，干冰保溫寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，完成宏基因組測序及物種注釋。

1.2數(shù)據(jù)整理 用Excel對注釋結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，美吉在線平臺做多樣性數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果

2.1 兩種糞便樣本中微生物分類多樣性對比

經(jīng)高通量測序及序列優(yōu)化后，獲得的藏羊有效的物種注釋序列17 343 250條，在NR庫中共注釋物種數(shù)10 786種。牦牛有效物種序列數(shù)19 108 126條，共注釋物種數(shù)8 774種。微生物種分細(xì)菌、古菌、真核微生物與病毒四種，各自有關(guān)注釋數(shù)據(jù)見表1和圖1-圖4。藏羊糞便中的細(xì)菌、古菌和病毒的物種數(shù)都高于牦牛，而真核微生物則相反。牦牛糞便中的細(xì)菌、古菌和真核微生物的有效物種序列數(shù)都高于藏羊，只有病毒的有效序列數(shù)相反。兩種動物糞便中都有unclassfiied的物種被檢出，可能物種數(shù)較小，但兩種糞便間的序列數(shù)相差較大，藏羊糞便中的共有微生物序列數(shù)顯著多于牦牛的共有微生物序列數(shù)(p<0.05)。兩種動物糞便中的細(xì)菌差異物種序列數(shù)和病毒的共有物種序列數(shù)則是極顯著的差異(P<0.01)。其它數(shù)據(jù)盡管數(shù)值上有差距，但不存在顯著差異(P>0.05)。

圖1 牦牛糞便微生物群落餅圖

圖2 藏羊糞便微生物群落餅圖

圖3 牦牛、藏羊糞便微生物群落對比柱狀圖

圖4 牦牛、藏羊糞便微生物群落對比熱圖圖

2.2 兩種動物糞便中微生物各分類水平情況對比

藏羊糞便細(xì)菌79個門、130個綱、244個目、455個科、1 783個屬和9 684個種，在種水平上含有297種未培養(yǎng)細(xì)菌種，1個未鑒定細(xì)菌種和351個其它水平未分類細(xì)菌種。古菌9個門、18個綱、30個目、47個科、115個屬、342個種，在種水平上還有12種未培養(yǎng)古菌，9種其它水平為分類古菌。真核微生物27個門、77個綱、179個目、285個科、387個屬、478個種，種水平全部為確認(rèn)真核微生物。病毒有1個目、1個科、34個屬、261個種，在種水平上有1種未鑒定噬菌體，還有6種未培養(yǎng)病毒。

牦牛糞便中細(xì)菌注釋77個門、84個綱、12個目、380個科、1 488個屬、8 099個種，在種水平上含有237種未培養(yǎng)細(xì)菌種，在其它水平上未分類菌種有294種。古菌種注釋7個門、16個綱、28個目、40個科、76個屬、184個種，在種水平上有3種已確定屬未分類種的古菌種，以及12種未培養(yǎng)古菌。真核微生物注釋25個門、65個綱、129個目、187個科、245個屬、292個種。在門和綱水平上都有2個unclassifiede的真核微生物。病毒注釋與藏羊的結(jié)果類似，沒有門與綱的明確分類，有3個目、9個科、24個屬、182個種。

表2中列出了兩種動物糞便中的四種微生物的最優(yōu)勢分類。兩種動物糞便中的細(xì)菌和古菌在屬及以上分類的最優(yōu)勢生物分類一致，只有種水平不同。病毒的目和科水平也一致，但屬和種有差異，這個差異僅是噬菌體的分型同。真核微生物的優(yōu)勢生物是區(qū)別最大的，從門到種都不同。

圖5中展示了兩種動物糞便中的主要共有微生物種在糞便樣本中的豐度對比，圖中這些注名的微生物種是共有菌種序列數(shù)較多且差異較小的種，但在各自的微生物群落結(jié)構(gòu)上卻展現(xiàn)出不同的豐度，如Comamonas_aquatica是藏羊糞便中的最優(yōu)勢菌，但在圖5中沒有顯示，表明牦牛中的這種菌的序列數(shù)與豐度都低。而圖中展示的Acinetobactersp.SFC是牦牛的最優(yōu)勢菌，在藏羊糞便中含量也不低?？傮w來看，圖中展示的這些已注名微生物在牦牛糞便中的豐度大于在藏羊的糞便中的豐度，而others部分則是藏羊的豐度高于牦牛的豐度。

表1 兩種動物糞便中的已確認(rèn)物種與有效序列數(shù)據(jù)

表2 不同微生物域在不同分類水平的優(yōu)勢微生物

圖5 兩種動物糞便中微生物與功能的circos圖

3 討論

青海省已經(jīng)建成國內(nèi)最大的有機牧場，藏羊和牦牛是主要的地區(qū)放牧家畜[4]。已有的研究中多以單種動物為研究對象，如王循剛等[5]采用16S擴增測序的方法，分析了藏羊瘤胃與糞便中的細(xì)菌,厚壁菌門是糞便中豐富度最大細(xì)菌門類，結(jié)果與本研究不同。兩份研究的樣本均來自青海海北地區(qū)，不存在時空和食物的顯著差異，最大的區(qū)別是采用的研究方法。盡管16 S擴增測序在微生物多樣性分析工作中應(yīng)用相對較多，但不能說明是影響結(jié)果的主要原因，而有機草場的成熟度或許是可能原因之一。在牦牛樣本的結(jié)果中，變形菌門屬于最優(yōu)勢菌門，與聶遠(yuǎn)[5]、馬力等[6]的研究略有差異。他們的研究中，變形菌門屬于次優(yōu)勢菌。

本研究還分析了兩種動物糞便中的微生物群結(jié)構(gòu)特點(圖5和表2)，藏羊的最優(yōu)勢細(xì)菌Comamonas_aquatica在牦牛中豐度極低，而牦牛的最優(yōu)勢細(xì)菌Acinetobacter sp.SFC則是兩種動物共有且序列數(shù)相對接近，這種特點可能反映出在細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)上牦牛的多樣性更豐富。比較兩種動物糞便中的古菌，均為廣古菌門的系列甲烷桿菌為主，僅在種水平有差異，分析可能是反芻動物消化系統(tǒng)古菌的基本特點[7]，也可能與同地區(qū)有關(guān)聯(lián)。需要注意的是牦牛糞便中的優(yōu)勢病毒是一種人獸共患性寄生蟲[8]，以優(yōu)勢種被檢測到可能提示有致病的風(fēng)險。