張 倩，張?zhí)炷?，劉歡歡,2，劉史佳，張先林，楊 靜，姚 毅

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210038)

經(jīng)典名方清胃散源于金代李東垣的《蘭室秘藏》和《脾胃論》，是常用清熱劑，主治胃火牙痛之證，在臨床上被廣泛使用[1]，現(xiàn)作為重點研究的經(jīng)方之一被收錄在2018年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中[2]。目前，關(guān)于清胃散的研究多見文獻考證及臨床應(yīng)用報道，近兩年有研究報道清胃散水煎液的特征圖譜、煎煮工藝和物質(zhì)基準(zhǔn)的量值傳遞[2-4]，但尚未見清胃散配方顆粒的相關(guān)研究。

中藥配方顆粒是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用現(xiàn)代科技手段將中藥飲片提取、濃縮、干燥、制粒，并定量分裝成統(tǒng)一的規(guī)格和劑量，供臨床調(diào)劑使用，具有質(zhì)量穩(wěn)定、方便調(diào)劑、劑量準(zhǔn)確、衛(wèi)生以及貯存攜帶方便等特點[5]。但是，中藥配方顆粒與傳統(tǒng)飲片湯劑的主要物質(zhì)基礎(chǔ)及溶出程度是否相同，藥效和安全性是否等效，目前仍缺乏公認可行的一致性評價方式和標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。標(biāo)準(zhǔn)湯劑是按照臨床湯劑煎煮流程的規(guī)范化操作，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮的方法干燥制得[5]，具備臨床中藥湯劑的物質(zhì)基準(zhǔn)。清胃散配方顆粒市場應(yīng)用前景廣泛，因此有必要開展其配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性評價研究，為其臨床的合理化應(yīng)用提供參考。

本研究擬制備15批清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立高效液相色譜(HPLC)特征指紋圖譜及指標(biāo)性成分含量測定的分析方法，以HPLC特征指紋圖譜相似度，以及指標(biāo)性成分(沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、異阿魏酸、表小檗堿、升麻素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，運用多變量統(tǒng)計分析方法，評價清胃散配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分的一致性，以期為后續(xù)評價生物效應(yīng)的一致性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent1260型高效液相色譜儀(配G1322A脫氣機、G1312B二元泵、G1367E自動進樣儀、G1316D柱溫箱和G4212B二極管陣列檢測器)，美國Agilent公司；AX224ZH/E型電子天平，常州市奧豪斯儀器有限公司；KQ-1000型醫(yī)用超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-601型超級電熱恒溫水浴箱，金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；80-2型臺式低速離心機，常州市國華電器有限公司；Eppendorf 5430R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

對照品鹽酸小檗堿(批號：Y31J9H67024、純度≥98%)，丹皮酚(批號：D1619066、純度≥98%)，阿魏酸(批號：H27J7L16718、純度≥98%)，異阿魏酸(批號：A11M9L61182、純度≥98%)，沒食子酸(批號：C13O9C72105、純度≥98%)，鹽酸巴馬汀(批號：Z16J10X79792、純度≥98%)，升麻素(批號：Y11O9H72162、純度≥98%)，上海市源葉生物科技有限公司；表小檗堿(批號：C10743482、純度≥98%)，上海市麥克林生物科技有限公司；芍藥苷(批號：lw19010908、純度≥98%)，南京市良瑋生物科技有限公司；甲醇為色譜純，德國Merck公司；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

不同批次的中藥材由安徽萬生中藥飲片有限公司、安徽馬鞍山井泉中藥飲片有限公司、安徽協(xié)和成中藥飲片有限公司、貴州同德中藥飲片有限公司幫助，從道地產(chǎn)區(qū)收集并加工成飲片，其中黃連11批、牡丹皮15批、升麻13批、當(dāng)歸14批、生地黃12批，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院朱育鳳主任中藥師鑒定為毛茛科黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖，毛茛科牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，毛茛科大三葉升麻CimicifugaheracleifoliaKom.的干燥根莖，傘形科當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根和玄參科地黃的RehmanniaglutinosaLibosch.干燥塊根。隨機組成15批清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，詳細信息見表1。

表1 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑中藥飲片信息

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

飲片隨機組合后打粉，按照文獻[4]的煎煮工藝條件，取處方量飲片粗粉共24 g至鍋中，加288 mL水，浸泡30 min后，大火煮沸后再小火煎煮60 min，重復(fù)煎煮2次，濃縮至200 mL，過濾即得。取適量標(biāo)準(zhǔn)湯劑，混勻后以4 000 r/min離心3 min，移取上清液過0.45 μm濾膜，取過濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 配方顆粒溶液的制備

取換算后處方量的中藥配方顆粒共12.8 g至鍋中，加200 mL熱水溶解，過濾即得中藥配方顆粒溶液。取適量中藥配方顆粒溶液，混勻后以4 000 r/min離心3 min，移取上清液過0.45 μm濾膜，取過濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、異阿魏酸、表小檗堿、升麻素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚對照品適量，用甲醇溶解后定容，即得各對照品母液。

精密移取各對照品母液一定量，混合后，用體積分?jǐn)?shù)30%甲醇水溶液定容至同一容量瓶內(nèi)，配制成已知質(zhì)量濃度的混合對照品溶液(含沒食子酸333.33 μg/mL、芍藥苷444.44 μg/mL、阿魏酸333.33 μg/mL、異阿魏酸444.44 μg/mL、表小檗堿333.33 μg/mL、升麻素55.56 μg/mL、鹽酸小檗堿333.33 μg/mL、鹽酸巴馬汀333.33 μg/mL及丹皮酚222.22 μg/mL)，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.4 HPLC特征指紋圖譜

色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：磷酸二氫銨緩沖液(A)，pH=3；甲醇(B)，梯度洗脫如下：0～15 min，1%(體積分?jǐn)?shù)，下同) B ；15～20 min，1%～10% B；20～30 min，10%～14% B；30～40 min，14%～15% B；40～55 min，15%～22% B；55～65 min，22%～30% B；65～90 min，30%～40% B；90～100 min，40%～70% B；100～110 min，70% B；110～120 min，70%～1% B；120～125 min，1% B；流速1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。取對照品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品湯劑和配方顆粒溶液進樣分析，記錄峰面積。

1.2.5 清胃散主要物質(zhì)基礎(chǔ)的含量測定

1.2.5.1 樣品溶液和對照品溶液的制備

同1.2.1、1.2.2和1.2.3項中的方法，制備樣品和對照品溶液。

1.2.5.2 單味藥溶液的制備

隨機選擇黃連、牡丹皮、升麻、當(dāng)歸和地黃飲片，按處方量分別稱取每味藥，按1.2.1項中方法制備黃連、牡丹皮、升麻、當(dāng)歸和地黃的5份單味藥供試品溶液。

1.2.5.3 方法學(xué)的考察

1)專屬性和線性關(guān)系。按照文獻[4]的方法，精密吸取上述1.2.3項中混合對照品溶液適量，用體積分?jǐn)?shù)30%甲醇水溶液稀釋混合均勻后，倍比稀釋得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按1.2.4項中色譜條件進樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，線性回歸得到主要物質(zhì)基礎(chǔ)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。

2)精密度。按1.2.1項中方法，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑10 μL，按1.2.4中色譜條件連續(xù)進樣6次，以峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

3)重復(fù)性。按1.2.1項中方法，平行制備6份標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按1.2.4項中色譜條件進樣分析，以峰面積計算RSD。

4)穩(wěn)定性。取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑6份，于室溫25 ℃放置，分別于 0、6、12、24、36 h精密吸取10 μL，按1.2.4項中色譜條件進樣分析并記錄峰面積；再取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑6份存放于4 ℃冰箱，分別測定0、3、5和7 d的各成分峰面積，以峰面積計算RSD。

5)加樣回收率。分別精密吸取平行制備的已測定濃度的6份標(biāo)準(zhǔn)品湯劑，每份100 μL，分別精密添加相當(dāng)于已知含沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、異阿魏酸、表小檗堿、升麻素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚的混合對照品適量，按1.2.4項中色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算各成分的加樣回收率。

6)主要物質(zhì)基礎(chǔ)的含量測定。取對照品溶液、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒溶液和單味藥溶液，按1.2.4項中色譜條件進樣分析，記錄保留時間和峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC特征圖譜的分析結(jié)果

按照1.2.1和1.2.2項中所述制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒溶液的方法，并按照1.2.4項中色譜的條件進樣，記錄色譜圖。按照文獻[4]的方法，采用對照品比對，共確定了30個共有峰(圖1)，由圖1可知：9個共有峰分別為沒食子酸(5號峰)、芍藥苷(16號峰)、阿魏酸(18號峰)、異阿魏酸(19號峰)、表小檗堿(21號峰)、升麻素(22號峰)、鹽酸小檗堿(25號峰)、鹽酸巴馬汀(26號峰)和丹皮酚(29號峰)。黃連的特征峰分別為2、14、15、20、21、22、23、25和26號峰，其中第21號峰為表小檗堿，第25號峰為鹽酸小檗堿，第26號峰為鹽酸巴馬??；升麻的特征峰分別為3、4、6、7、12、13、18、19、24、27和28號峰，其中第18號峰為阿魏酸，第19號峰為異阿魏酸，第22號峰為升麻素；牡丹皮的特征峰分別為5、8、10、11、16、17、29和30號峰，其中第5號峰為沒食子酸，第16號峰為芍藥苷，第29號峰為丹皮酚；當(dāng)歸的特征峰分別為9和18號峰，其中第18號峰為阿魏酸。

圖1 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒和單味藥及各指標(biāo)性成分對照品的HPLC Fig.1 HPLC chromatogram and characteristic peak assignment of the formula granules,the standard and single decoction and mixed reference compounds

將文件導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012A版)》軟件進行分析。剪切5 min圖譜，以S1樣品圖譜為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.4，通過中位數(shù)法生成對照圖譜及清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的HPLC特征指紋圖譜(圖2和表2)，計算特征指紋圖譜相似度。由圖2和表2可知：15份標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品(S1～S15)中有12份的相似度大于0.900，其余2份大于0.800，1份大于0.600。以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為對照，3份配方顆粒樣品(S16～S18)的相似度為0.870～0.888，說明質(zhì)量相對穩(wěn)定。

表2 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒的特征指紋圖譜相似度

圖2 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的HPLC特征指紋圖譜Fig.2 Characteristic fingerprint chromatograms of the standard decoction and the formula granules of Qingweisan

2.2 主要物質(zhì)基礎(chǔ)的含量測定結(jié)果

2.2.1 專屬性和線性關(guān)系的考察結(jié)果

通過比對全方及單味藥溶液的HPLC特征指紋圖譜，對清胃散中各味藥的特征色譜峰進行指認，發(fā)現(xiàn)專屬性良好。以對照品進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進行線性回歸，得到各指標(biāo)性成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，結(jié)果見表3。由表3可知：各成分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性都比較好。

表3 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各主要物質(zhì)基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 9種成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率

2.2.2 方法學(xué)的考察結(jié)果

沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、異阿魏酸、表小檗堿、升麻素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率結(jié)果見表4。由表4可知：該方法精密度、重復(fù)性和平均加樣回收率良好，樣品在25 ℃存放36 h，或在4 ℃存放7 d均穩(wěn)定，符合定量分析要求。

2.2.3 主要物質(zhì)基礎(chǔ)的含量測定結(jié)果

根據(jù)線性回歸方程，計算標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒溶液樣品中沒食子酸、芍藥苷、阿魏酸、異阿魏酸、表小檗堿、升麻素、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀以及丹皮酚的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)(表5)。由表5可知：標(biāo)準(zhǔn)湯劑中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為沒食子酸(0.107 0±0.030 0)%，芍藥苷(0.226 2±0.087 3)%，阿魏酸(0.030 7±0.007 5)%，異阿魏酸(0.089 5±0.032 0)%，表小檗堿(0.019 3±0.007 1)%，升麻素(0.009 3±0.003 0)%，鹽酸小檗堿(0.058 3±0.027 0)%，鹽酸巴馬汀(0.028 0±0.011 6)%，丹皮酚(0.056 3±0.017 9)%；配方顆粒中平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為沒食子酸(0.094 2±0.004 4)%，芍藥苷(0.117 5±0.002 2)%，阿魏酸(0.013 5±0.000 9)%，異阿魏酸(0.054 6±0.004 5)%，表小檗堿(0.045 9±0.003 9)%，升麻素(0.004 5±0.000 7)%，鹽酸小檗堿(0.214 5±0.020 2)%，鹽酸巴馬汀(0.072 8±0.004 6)%，丹皮酚(0.033 4±0.005 9)%。

表5 清胃散配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑各主要物質(zhì)基礎(chǔ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果

表6 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒成分含量的OPLS-DA分析

2.2.4 單因素方差分析結(jié)果

顯著性分析采用SPSS 22進行單因素方差(ANOVA)分析，清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒成分含量OPLS-DA分析見表6。由表6可知：配方顆粒溶液中指標(biāo)性化合物表小檗堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值極顯著(P<0.01)，高于標(biāo)準(zhǔn)湯劑；而阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值極顯著(P<0.01)，低于標(biāo)準(zhǔn)湯劑；升麻素和芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著(P<0.05)，低于標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2.5 多變量統(tǒng)計分析結(jié)果

將清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和配方顆粒組中各指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-14.0軟件，進行多變量統(tǒng)計分析。采用主成分分析(PCA)得分圖直觀表示組與組之間的差異；使用正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)分析，將標(biāo)準(zhǔn)湯劑組和配方顆粒組進行比對分析。通過PCA分析得到4個主成分的模型和反映各組離散程度的得分圖(圖3)。由圖3可知：這4個成分分別為鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、阿魏酸，能夠反映清胃散配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的差異，并能明顯區(qū)分清胃散配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑。OPLS-DA圖顯示清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑與顆粒劑區(qū)分明顯，根據(jù)OPLS-DA分析的變量重要性投影VIP>1和ANOVA的P<0.05，篩選出清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑組與配方顆粒劑組主要差異性成分為鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、阿魏酸和升麻素。

圖3 清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒PCA與OPLS-DA Fig.3 PCA and OPLS-DA diagram of the standard decoction and formula granules of Qingweisan

由表5～6和圖3可知：清胃散配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要指標(biāo)性成分含量不一致。鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和表小檗堿是黃連的專屬性成分，且含量較高，在配方顆粒中的含量極顯著(P<0.01)，高于標(biāo)準(zhǔn)湯劑，提示配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的差異主要體現(xiàn)在黃連這味藥。

黃連生物堿合煎時轉(zhuǎn)移率低可能是清胃散湯劑在臨床使用時需添加劑量的原因之一。清胃散在《蘭室秘藏》和《脾胃論》中都有記載：“如連不好，更加2分，夏月倍之”[8-9]。姚杭琦等[10]報道了黃連用藥劑量也會依據(jù)臨床患者的實際情況而有所增減。黃連作為清胃散的君藥，主要發(fā)揮清胃熱解火毒的主要作用[11]，小檗堿類生物堿成分如：表小檗堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀等為主要藥效物質(zhì)。前期實驗中筆者發(fā)現(xiàn)：在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑后，表小檗堿、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的轉(zhuǎn)移率較低，和黃嘉怡等[3]報道巴馬汀在清胃散物質(zhì)基準(zhǔn)中轉(zhuǎn)移率較低的結(jié)論相似。由此推測：黃連生物堿在合煎時，轉(zhuǎn)移率較低可能與有機酸生成沉淀，影響溶出有關(guān)[12-14]，升麻、牡丹皮和當(dāng)歸中富含有機酸成分，如：沒食子酸等成分可能影響黃連生物堿的溶出。依據(jù)本實驗結(jié)果，清胃散配方顆粒中黃連的小檗堿類成分含量較標(biāo)準(zhǔn)湯劑更高，原因可能是配方顆粒是單味藥提取干燥后所得，可保留更多生物堿成分，配方顆?；蚋m合發(fā)揮清胃散清胃熱的藥效。

3 結(jié)論

目前針對清胃散配方顆?；驑?biāo)準(zhǔn)湯劑的主要物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不夠全面系統(tǒng)，僅有少量文獻涉及成分，如：阿魏酸、小檗堿、巴馬汀、丹皮酚和芍藥苷。本研究指認了清胃散標(biāo)準(zhǔn)湯劑中30個主要特征色譜峰的歸屬，以HPLC特征圖譜相似度和主要物質(zhì)基礎(chǔ)的含量為指標(biāo)，運用多變量統(tǒng)計分析方法評價了清胃散配方顆粒和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分的一致性，為后續(xù)評價清胃散配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑生物效應(yīng)的一致性研究提供了參考，并為經(jīng)典名方配方顆粒的臨床合理應(yīng)用提供了示范性研究。