李 辰，陳顥明，，胡亦舒，賴韋唯，盧雨琦，娜扎發(fā)提·穆罕麥提江，閔芳芳，李 真

(1．南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094；2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210094)

銅是一種生物微量元素，在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，隨著采礦、工業(yè)加工等人類活動(dòng)的增加，銅的過(guò)度使用已經(jīng)造成了污染[1-2]，且Cu容易集中在土壤表層[3]，導(dǎo)致其對(duì)作物和地表水有直接危害。人體內(nèi)的銅含量失衡會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼疾病和中性粒細(xì)胞減少癥產(chǎn)生不利影響[4-5]。

微生物修復(fù)技術(shù)是最具潛力的修復(fù)技術(shù)之一，其具備無(wú)毒、無(wú)污染和持久性等特點(diǎn)。在眾多具備修復(fù)功能的微生物中，利用溶磷微生物修復(fù)重金屬已經(jīng)取得顯著成效。溶磷微生物能夠依靠自身的代謝產(chǎn)物(有機(jī)酸、磷酸酶等)將難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化，從而和重金屬結(jié)合，改變重金屬的形態(tài)，提高修復(fù)效率[6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，溶磷細(xì)菌(Enterobactersp.)能夠促進(jìn)重金屬磷酸鹽礦物形成，從而成功去除重金屬Pb(>90%)。Teng等[8]發(fā)現(xiàn)，溶磷細(xì)菌(Leclerciaadecarboxylata、Pseudomonasputida)能夠通過(guò)形成羥基磷灰石和磷氯鉛礦修復(fù)Pb污染。

雖然溶磷微生物經(jīng)常用于重金屬污染的修復(fù)，但它們本身在這個(gè)過(guò)程中會(huì)受到重金屬的威脅。在一定程度上，重金屬濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生抑制作用[9]。特別是銅離子具有螯合巰基的能力，干擾細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或酶的活性[10-11]。游離的銅離子參與活性氧的形成，從而危害微生物[12]。因此，面對(duì)重金屬污染(尤其是銅離子污染)，微生物有必要與其他技術(shù)相結(jié)合。課題組的前期研究證明生物炭能夠成功保護(hù)溶磷細(xì)菌免受高濃度Pb和Cd的脅迫[13-14]。生物炭的高比表面積和孔隙度使其具有較高的吸附能力[15]。同時(shí)，生物炭對(duì)微生物的親和性和保護(hù)性也使其成為重金屬脅迫下最優(yōu)的微生物負(fù)載材料[14]。

因此，利用生物炭協(xié)助溶磷微生物修復(fù)Cu污染將會(huì)是一種具有潛力的方法。然而，在Cu脅迫下，生物炭如何對(duì)溶磷細(xì)菌進(jìn)行保護(hù)還有待深入探討。為了探討生物炭與溶磷細(xì)菌聯(lián)合修復(fù)重金屬Cu的機(jī)制，本研究假設(shè)生物炭能夠通過(guò)改變Cu的價(jià)態(tài)和礦物形態(tài)減少Cu2+對(duì)溶磷細(xì)菌的脅迫。采用電感耦合等離子光譜發(fā)射儀(ICP-OES)、X線衍射(XRD)、衰減全反射紅外光譜(ATR-IR)、電化學(xué)、X線光電子能譜技術(shù)(XPS)和掃描電子顯微鏡及能譜分析(SEM/EDS)等技術(shù)定性和定量分析修復(fù)過(guò)程中生物炭上礦物的形成和形態(tài)。這項(xiàng)研究將物理修復(fù)方法與生物修復(fù)耦聯(lián)起來(lái)，為多方法聯(lián)合修復(fù)Cu污染提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料制備

本研究以干化后的城市污泥為原材料(浙江永康市城市污水處理廠,密西西比國(guó)際水務(wù)公司)，在600 ℃下高溫?zé)峤庵苽涑扇跛嵝陨锾?SB)，對(duì)比其他種類的生物炭，其磷含量十分高(表1)。

表1 不同類型生物炭基本性質(zhì)和磷含量對(duì)比

溶磷細(xì)菌采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院從大豆根部(黃棕壤)篩選出的強(qiáng)溶磷功能菌株(腸桿菌,Enterobactersp.,菌株的保藏號(hào)為 CGMCC17428)。將菌種在30 ℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3 d，然后從菌落中切下接種基塊(直徑6 mm)，并轉(zhuǎn)接入100 mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中。在30 ℃、180 r/min下孵育24 h后，大腸桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行Cu修復(fù)試驗(yàn)。

1.2 Cu修復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以細(xì)菌培養(yǎng)專用有機(jī)環(huán)境為試驗(yàn)背景(LB培養(yǎng)基:1 000 mL蒸餾水、10.0 g胰蛋白胨、5.0 g酵母提取物和10.0 g NaCl)。使用0.1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.2～7.4。然后，將1 mL溶磷細(xì)菌菌液或者2.5 g生物炭加入50 mL LB培養(yǎng)基與1 000 mg/L Cu2+[(Cu(NO3)2]的混合污染溶液(處理:PSB+Cu、SB+Cu)。同時(shí)將2.5 g的生物炭與PSB混合加入Cu污染溶液(處理:SB+PSB+Cu)，并用無(wú)Cu的同樣條件作為細(xì)菌對(duì)照(處理:SB+PSB)。將所有處理的燒瓶在黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d(37 ℃、125 r/min)。將反應(yīng)完成的菌液進(jìn)行離心(7 000 r/min、3 min)和過(guò)濾(0.22 μm濾膜)。采用2.5%的戊二醛對(duì)生物炭上的微生物進(jìn)行固定(4 ℃儲(chǔ)存)。利用Agilent 710型ICP-OES分析了濾液中的總P和Cu2+濃度，固體在45 ℃下烘干后通過(guò)ATR-IR、XRD、XPS、SEM和電化學(xué)等技術(shù)進(jìn)行分析。

1.3 分析方法

生物炭聯(lián)合細(xì)菌吸附Cu2+后的電化學(xué)特性，利用CHI-660D型電化學(xué)工作站(中國(guó)上海辰華儀器)對(duì)不同處理吸附Cu2+后進(jìn)行了循環(huán)伏安法研究。循環(huán)伏安法采用鉑絲輔助電極(PFE)、飽和甘汞參比電極(SCE)和修飾后的玻碳電極(GCE)工作電極組成的三電極體系。適配傳感器制備：使用0.3和0.05 μm粒徑的α-Al2O3混合液體(0.25 g/mL)依次拋光GCE電極(直徑5 mm)，然后在乙醇和超純水中超聲清洗，并用N2干燥。將生物炭/生物炭+菌的溶液(50 μL,20 mg/mL)分別包裹在GCE電極上，然后干燥成型(65 ℃,2 h)。將10 μL 0.5% Nafion溶液覆蓋在帶有樣品的GCE電極上并在空氣中干燥。SCE和PFE分別用作參比電極和對(duì)電極。在-0.8～0.8 V的掃描范圍內(nèi)，以10 mV/s的掃描速率研究了各個(gè)處理的電化學(xué)行為。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，評(píng)價(jià)不同處理之間的差異(顯著性水平P<0.05)。采用Thermo Scientific OMNIC軟件進(jìn)行紅外數(shù)據(jù)分析，JADE 6.0進(jìn)行XRD數(shù)據(jù)分析。XPS、SEM和電化學(xué)采用Origin 8.0進(jìn)行分析和圖形處理。

2 結(jié)果和討論

2.1 生物炭聯(lián)合溶磷細(xì)菌修復(fù)Cu的結(jié)果分析

生物炭聯(lián)合溶磷細(xì)菌對(duì)重金屬Cu的去除量和溶液磷含量如圖1所示。由圖1可知：與Cu脅迫處理相比，生物炭和溶磷細(xì)菌處理(SB+PSB)的磷含量最低(107.84 mg/L)，比SB+Cu(331.11 mg/L)釋放的磷含量低了2倍多，因此證實(shí)溶磷微生物在無(wú)Cu脅迫和養(yǎng)分充足情況下，能夠充分利用環(huán)境中的磷源，加速自身繁殖和生長(zhǎng)。在Cu脅迫下，生物炭處理(SB+Cu)后，磷含量最高，溶磷細(xì)菌處理(PSB+Cu)效果比生物炭處理的低，對(duì)Cu的去除量最低，這證實(shí)溶磷細(xì)菌在Cu脅迫下會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[9]，加速磷的釋放。此外，結(jié)合ATR和XRD結(jié)果分析，推斷磷可能被用于溶磷細(xì)菌繁殖和自身修復(fù)而不是用于和Cu結(jié)合固定。當(dāng)生物炭協(xié)助溶磷細(xì)菌的時(shí)候(SB+PSB+Cu)，其磷含量明顯降低，比溶磷細(xì)菌單獨(dú)處理的降低27.9%，比生物炭單獨(dú)處理的降低54.2%。而Cu的去除量比溶磷細(xì)菌單獨(dú)修復(fù)高12 012.1%(約120倍)，比生物炭單獨(dú)修復(fù)高123.9%，這表明溶磷細(xì)菌在生物炭保護(hù)情況下，將生物炭中的磷充分釋放，從而降低環(huán)境中Cu的脅迫。

圖1 生物炭協(xié)助溶磷細(xì)菌修復(fù)的反應(yīng)體系中P含量和Cu含量Fig.1 Content of P and Cu in the reaction system assisted by biochar in phosphorus-soluble bacterial remediation

2.2 生物炭和細(xì)菌修復(fù)Cu的重金屬礦化機(jī)制分析

ATR-IR紅外光譜顯示SB+PSB處理沒(méi)有明顯的碳酸鹽(676 cm-1)[13]和磷酸鹽(565和598 cm-1)[7,20]的峰存在，說(shuō)明沒(méi)有Cu脅迫時(shí)，溶磷細(xì)菌所分解的磷多用于自身繁殖。PSB+Cu處理組存在碳酸鹽和磷酸鹽礦物，而有機(jī)質(zhì)類峰(1 550 cm-1)[14]和代表蛋白/糖類峰[9]十分明顯，結(jié)合ICP-OES結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Cu對(duì)PSB脅迫十分明顯，PSB只能夠進(jìn)行自我保護(hù)，而不能對(duì)Cu進(jìn)行固定修復(fù)。

本研究中，在SB+PSB+Cu的沉淀物中存在碳酸鹽和磷酸鹽的多個(gè)峰(圖2)，SB+Cu處理組的碳酸鹽峰(676、876、1 421 cm-1)更加明顯，由此表明生物炭自身可以對(duì)Cu起到一定的礦化固定作用，但還是以不夠穩(wěn)定的碳酸鹽Cu礦物形式為主(Ksp=1.4×10-10～2.4×10-10)[21]。而生物炭聯(lián)合溶磷細(xì)菌后不僅起到保護(hù)溶磷細(xì)菌的作用，還為溶磷細(xì)菌提供了充足的磷源，二者聯(lián)合促進(jìn)生成更加穩(wěn)定的磷酸鹽Cu礦物(Ksp=1.3×10-37～1.4×10-37)[21]。XRD結(jié)果與紅外結(jié)果一致，通過(guò)圖2(b)可以明顯分析得出，生物炭與溶磷細(xì)菌聯(lián)合比二者單獨(dú)修復(fù)Cu污染的礦物晶體特性更明顯且數(shù)量更多。同時(shí)，在沉淀物中發(fā)現(xiàn)可能同時(shí)存在不同價(jià)態(tài)礦物[22-23]，這說(shuō)明生物炭表面可能是Cu價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化的平臺(tái)。

圖2 生物炭和溶磷微生物聯(lián)合修復(fù)Cu的ATR-IR(a)與XRD(b)圖譜Fig.2 ATR-IR spectra(a) and XRD(b) patterns of Cu remediation by biochar and phosphorus-soluble microorganisms

圖3為生物炭和溶磷細(xì)菌修復(fù)Cu的SEM照片。由圖3可見(jiàn)，生物炭表面溝壑縱橫，孔隙豐富(圖3(a))，細(xì)菌能夠藏匿在生物炭的孔隙中(圖3(b))。這證實(shí)生物炭能夠?yàn)槲⑸锾峁┏浞值亩ㄖ晨臻g，并且EDS分析進(jìn)一步表明在生物炭表面有明顯的Cu礦物存在，充分說(shuō)明生物炭表面是重金礦物的平臺(tái)(圖3(c)、3(d))，這與筆者先前的研究結(jié)果一致[13]。

圖3 生物炭和溶磷微生物修復(fù)Cu的SEM與EDS圖Fig.3 SEM images and EDS patterns of biochar and phosphorus-soluble microorganisms for Cu remediation

2.3 生物炭對(duì)微生物的保護(hù)和協(xié)助作用機(jī)制分析

具有多孔隙結(jié)構(gòu)和大比表面積的污泥生物炭能夠從環(huán)境中吸附并滯留微生物所需的氮、磷等元素，同時(shí)生物炭的孔隙也為微生物提供了生長(zhǎng)繁殖的場(chǎng)所(圖3(a))。本研究證實(shí)生物炭的存在，減少了約90 mg/L的Cu對(duì)微生物群落的脅迫(圖1)，從而維持了微生物生命系統(tǒng)的穩(wěn)定。而生物炭與微生物聯(lián)合共同起到了加速鈍化重金屬的作用(圖2)。雖然本研究發(fā)現(xiàn)，重金屬礦物的形成是生物炭保護(hù)微生物的主要機(jī)制之一，但是在微生物層面的剖析仍需要進(jìn)一步研究證明。

為了進(jìn)一步探究生物炭協(xié)助下微生物學(xué)的自我保護(hù)機(jī)制，本研究采用電化學(xué)和XPS分析證明Cu是否有價(jià)態(tài)變化以及變化差異，結(jié)果如圖4所示。電化學(xué)分析(循環(huán)伏安法)研究了4種材料(SB、SB+Cu、SB+PSB+Cu、PSB+Cu)在Cu脅迫下在0.1 mol/L磷酸鹽平衡溶液(pH=7.0)中的電化學(xué)性質(zhì)(圖4(a))。由(圖4(a))可知：在10 mV/s的掃描速率下，樣品的光譜顯示出明確的氧化還原峰，分別位于-0.5～-0.35 V(還原)和-0.02～0 V(氧化)處，對(duì)應(yīng)于Cu2+/Cu+的可逆價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)變。電化學(xué)結(jié)果證實(shí)，吸附Cu2+后，細(xì)菌中存在明顯將Cu2+轉(zhuǎn)化為Cu+的電位，證實(shí)細(xì)菌具有還原性的生物學(xué)功能，而其氧化性電位十分低，因此證實(shí)其在Cu脅迫下主要是以還原性占主導(dǎo)。這就導(dǎo)致Cu2+往Cu+轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的毒性抑制了細(xì)菌的生存和繁殖，這與筆者先前的研究一致[9]。

由圖4(b)可知：在SB+PSB+Cu處理的固體表面發(fā)現(xiàn)了2種不同價(jià)態(tài)的Cu離子存在，并且氧化和還原電位十分明顯(圖4(a))，這說(shuō)明生物炭和細(xì)菌聯(lián)合可以顯著提高Cu價(jià)態(tài)變化，尤其是氧化性。而SB+Cu處理和SB處理的電化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，生物炭自身具備一定的氧化效果，因此可以確定這一現(xiàn)象主要由細(xì)菌和生物炭聯(lián)合引起的。對(duì)比單獨(dú)細(xì)菌受脅迫時(shí)，細(xì)菌只有還原性功能，說(shuō)明誘導(dǎo)細(xì)菌氧化功能提升主要源自于生物炭對(duì)Cu脅迫的降低。結(jié)合筆者先前的研究發(fā)現(xiàn)微生物體外分泌物具有氧化功能，可以得出：生物炭除了能夠減少游離的Cu2+含量以外，還可能將微生物含有的Cu的分泌物吸引到生物炭上，增加細(xì)菌新分泌物的產(chǎn)生，從而減少微生物受到的毒害。

圖4 生物炭復(fù)合細(xì)菌吸附Cu2+后的CV曲線(a)和XPS曲線(b)Fig.4 CV curve(a) and XPS curve(b) of biochar composite bacteria after adsorption of Cu2+

XPS結(jié)果表明在SB+Cu處理中Cu2+占67.5%，Cu+占32.5%。而在PSB+Cu中Cu+數(shù)量明顯增多，占62.7%。這也進(jìn)一步證明細(xì)菌對(duì)Cu的還原作用。此外SB+PSB+Cu實(shí)驗(yàn)表明Cu2+的比例高于Cu+，說(shuō)明生物炭可以對(duì)Cu2+進(jìn)行有限固定，而微生物的生物氧化作用促進(jìn)了Cu+往Cu2+轉(zhuǎn)變，從而進(jìn)一步降低Cu脅迫。綜上所述，生物炭首先能夠減少細(xì)菌和Cu2+接觸，降低Cu進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生氧化還原作用引起的致毒性，從而最有效地保護(hù)微生物；然后，生物炭對(duì)Cu進(jìn)行吸附+礦化結(jié)合，即使有部分Cu被微生物表面分泌物所氧化，但是生物炭能夠?qū)⑵錉?zhēng)奪并固定，減少Cu離子和·OH進(jìn)入細(xì)胞的概率，所以降低了Cu在微生物體內(nèi)的脅迫效應(yīng)。

3 結(jié)論

1)當(dāng)生物炭協(xié)助溶磷細(xì)菌應(yīng)對(duì)Cu2+脅迫的時(shí)候，二者聯(lián)合對(duì)Cu2+去除量比溶磷細(xì)菌單獨(dú)對(duì)Cu2+去除量提高12 012.1%(約120倍)，磷含量比生物炭單獨(dú)降低54.2%，證實(shí)生物炭能夠成功協(xié)助細(xì)菌提高生物功能，將P轉(zhuǎn)化并與Cu結(jié)合，降低環(huán)境中Cu的危害。

2)生物炭具有豐富的孔隙，能夠減少細(xì)菌和Cu2+接觸，從而降低Cu2+進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生氧化還原作用引起的致毒性，以此保護(hù)微生物在生物炭上先定植。

3)生物炭對(duì)Cu2+具有礦化結(jié)合功能，其能提前將Cu2+從環(huán)境中固定，減少被微生物還原的機(jī)會(huì)。

4)即使有部分Cu被微生物表面分泌物氧化成不同價(jià)態(tài)，但是生物炭能夠?qū)⑵錉?zhēng)奪并固定，減少Cu離子和·OH進(jìn)入細(xì)胞的概率，從而降低其在微生物體內(nèi)的脅迫效應(yīng)。