血清循環(huán)游離DNA聯(lián)合HE4、CA15-3、CYFRA21-1對(duì)卵巢癌診斷和分期評(píng)估的價(jià)值▲

朱玉鳳 歐陽(yáng)海紅 羅浩明 王小鳳 陳建設(shè)

(1 湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南省邵陽(yáng)市 422000； 2 湘南學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省郴州市 423000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，是致死率最高的婦科腫瘤，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[1]。由于卵巢腫瘤早期癥狀不明顯，僅有少數(shù)卵巢癌患者在Ⅰ期獲得診斷，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，其惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者5年生存率低[2]。因此，早期診斷對(duì)于及時(shí)治療和改善卵巢癌患者的預(yù)后具有重要意義[3]。循環(huán)游離 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外的高度片段化DNA，cf-DNA在甲狀腺癌、食管癌等多種腫瘤中的表達(dá)水平升高，對(duì)腫瘤具有一定的診斷價(jià)值[4-5]。人附睪蛋白4(human epididymal protein 4，HE4)是一種腫瘤標(biāo)志物，其在卵巢癌組織中呈高水平表達(dá)，在鑒別診斷良惡性卵巢腫瘤和不同分期卵巢癌中具有一定價(jià)值[6]。糖蛋白抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)是一種常用的腫瘤標(biāo)志物，可用于診斷早期卵巢癌[7]。細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)存在于腫瘤細(xì)胞的上皮胞質(zhì)中，當(dāng)組織發(fā)生癌變時(shí)，角蛋白被降解，血液中CYFRA21-1水平升高[8]。有研究表明，卵巢癌患者血清CYFRA21-1水平明顯升高，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)[9]。本研究以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，探討血清cf-DNA聯(lián)合HE4、CA15-3、CYFRA21-1在卵巢癌診斷和分期評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年7月至2020年10月在湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院就診的91例卵巢癌患者為卵巢癌組，年齡20～73(47.20±7.50)歲，其中國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)分期Ⅰ～Ⅱ期37例(早期組)、Ⅲ～Ⅳ期54例(中晚期組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均接受手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為卵巢癌；(2)初次發(fā)病；(3)術(shù)前未接受放化療；(4)患者對(duì)本研究知情同意并配合完成相關(guān)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫性疾病、嚴(yán)重精神病等其他嚴(yán)重疾病者；(2)伴有其他類(lèi)型腫瘤或者卵巢癌復(fù)發(fā)患者；(3)臨床資料不全者。另選取同期88例卵巢良性腫瘤患者作為卵巢良性腫瘤組，其中成熟性畸胎瘤25例、黏液性囊腺瘤35例、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫28例，年齡 22～72(47.50±7.30)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理診斷為卵巢腫瘤良性病變；(2)無(wú)其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并精神疾病或不能配合完成相關(guān)檢查。選取同期健康體檢女性90例為對(duì)照組，年齡23～72(47.30±7.20)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)任何惡性腫瘤疾病史或家族史；(2)無(wú)免疫性疾病或其他疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)感染性疾病、精神疾病等其他疾病患者；(2)卵巢疾病患者。3組研究對(duì)象的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過(guò)湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：20180019)，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的檢測(cè)方法

1.2.1 主要試劑與儀器： cf-DNA快速提取試劑盒(Epigenetics公司，批號(hào)：QE0905T)，人類(lèi)基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Promega公司，批號(hào)：D1521)，HE4 ELISA試劑盒(R&D systems公司， 批號(hào)：DHE400)，CYFRA21-1 ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd，批號(hào)：E-EL-H2077c),CA15-3檢測(cè)試劑盒(上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：329583)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E601型電化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司。

1.2.2 樣品采集及保存：采集所有觀察對(duì)象清晨空腹靜脈血4 mL，在室溫條件下靜置30 min后，以3 000 r/min離心15 min收集血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清cf-DNA水平：使用cf-DNA快速提取試劑盒提取血清總cf-DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶短片段基因?yàn)榘行蛄校?采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列為5′-AGCCGTGTTCTTTGCACTTT-3′，下游引物序列為5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGC-3′。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清cf-DNA水平。PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括SYBR? Premix Ex Taq 10 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、上下游引物各0.2 μL、模板cf-DNA 1 μL、血清cf-DNA 2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火95 ℃ 5 s，延伸60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以人類(lèi)基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，按10倍梯度進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度由PCR儀自動(dòng)分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算cf-DNA水平。

1.2.4 檢測(cè)血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平：采用ELISA檢測(cè)血清HE4、CYFRA21-1水平，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CA15-3水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 [M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本的比較采用 Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清cf-DNA聯(lián)合HE4、CA153、CYFRA21-1診斷卵巢癌和評(píng)估分期的價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較 對(duì)照組、卵巢良性腫瘤組、卵巢癌組的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較[M(P25，P75)]

2.2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較 與早期組比較，中晚期組患者的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較[M(P25，P75)]

2.3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)或聯(lián)合診斷卵巢癌的價(jià)值 采用約登指數(shù)最大法確定單一指標(biāo)的診斷臨界值，采用Logistic模型的預(yù)測(cè)概率得到4個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷的標(biāo)準(zhǔn)。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯(lián)合診斷卵巢癌的敏感度、特異度、曲線下面積(area under the curve,AUC)高于或大于單一指標(biāo)診斷(均P<0.05)，見(jiàn)表3、表4和圖1 。

表3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)或聯(lián)合診斷卵巢癌的價(jià)值

表4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯(lián)合診斷與單獨(dú)診斷卵巢癌效能的比較

圖1 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)診斷及聯(lián)合診斷卵巢癌的ROC曲線

2.4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)或聯(lián)合評(píng)估卵巢癌分期的價(jià)值 采用約登指數(shù)最大法確定單一指標(biāo)的診斷臨界值，采用Logistic模型的預(yù)測(cè)概率得到4個(gè)指標(biāo)聯(lián)合診斷的標(biāo)準(zhǔn)。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯(lián)合診斷早期卵巢癌的AUC為0.970，敏感度為89.19%，特異度為98.15%，AUC與特異度均大于或高于單一指標(biāo)診斷，見(jiàn)表5、表6、圖2。

表5 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)診斷或聯(lián)合診斷早期卵巢癌的效能

表6 血清cf-DNA、HE4、CA153、CYFRA21-1水平聯(lián)合診斷與單獨(dú)診斷早期卵巢癌效能的比較

圖2 血清 cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨(dú)診斷或聯(lián)合診斷早期卵巢癌的ROC曲線

3 討 論

卵巢腫瘤是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)腫瘤，卵巢癌早期癥狀不明顯或缺乏特異癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。由于卵巢癌侵襲力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、缺乏有效治療方法，患者的預(yù)后較差，其是導(dǎo)致婦科癌癥患者死亡的主要原因，因此有效鑒別卵巢腫瘤的良惡性并盡早治療，對(duì)提高患者生存期具有重要意義[10-12]。

cf-DNA是一種游離DNA，主要來(lái)源于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞，健康人血液中的cf-DNA水平較低，在腫瘤患者血液中cf-DNA 水平增高，因此cf-DNA 在腫瘤的診斷中具有重要意義[13-14]。有研究表明，與良性卵巢腫瘤組和健康卵巢組相比，卵巢癌組的cf-DNA水平顯著升高，與Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者相比，Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的cf-DNA水平顯著升高[15]。胡秋博等[16]的研究表明，卵巢癌患者血漿cf-DNA水平高于健康女性，且與腫瘤體積的對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)，將其用于區(qū)分卵巢癌患者與健康女性有一定價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，與健康女性比較，卵巢良性腫瘤患者和卵巢癌患者血清cf-DNA水平均升高，而卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于卵巢良性腫瘤患者，且中晚期卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，與既往研究結(jié)果[16]相似，這提示血清cf-DNA水平有助于卵巢癌的診斷及其分期的評(píng)估。

HE4屬于乳清酸性蛋白家族成員，其在卵巢癌患者血清中的表達(dá)水平較高，是卵巢癌臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的理想腫瘤標(biāo)志物，但是其診斷早期卵巢癌的敏感性與特異性不高[17]。CA15-3為臨床最常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，在女性惡性腫瘤中的表達(dá)顯著升高，如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等，其表達(dá)組織特異性較高，被認(rèn)為是乳腺癌特異性最高的標(biāo)志物，在乳腺腫瘤的鑒別診斷中應(yīng)用廣泛[18]。CYFRA21-1是一種新發(fā)現(xiàn)的上皮來(lái)源性質(zhì)的腫瘤標(biāo)志物，在乳腺癌中表達(dá)水平較高，且與乳腺癌的臨床分期有關(guān)，CYFRA21-1在胃癌與肺癌患者血清中的表達(dá)水平也較高，其對(duì)惡性腫瘤的診斷具有一定價(jià)值[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，卵巢良性腫瘤組和卵巢癌組的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高；與卵巢良性腫瘤組比較，卵巢癌組的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高，且中晚期卵巢癌患者的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，表明血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高對(duì)卵巢癌的診斷及分期評(píng)估可能均有一定指示作用。

繪制ROC曲線進(jìn)一步評(píng)價(jià)4個(gè)指標(biāo)的診斷效能，結(jié)果提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平在診斷卵巢癌和評(píng)估卵巢癌分期中均具有一定的效能，但單獨(dú)診斷效能不高，且敏感度、特異度不高；而血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯(lián)合診斷卵巢癌和評(píng)估卵巢癌分期的AUC均>0.95，診斷效果好，且四者聯(lián)合診斷卵巢癌的AUC、敏感度與特異度大于或高于單一指標(biāo)診斷，四者聯(lián)合診斷早期卵巢癌的AUC、特異度大于或高于單一指標(biāo)診斷(均P<0.05)。這提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯(lián)合檢測(cè)在卵巢癌的診斷和分期評(píng)估中均具有較高的價(jià)值。

綜上所述，卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高，在中晚期患者中四者明顯升高，血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯(lián)合檢測(cè)對(duì)卵巢癌的診斷和分期評(píng)估均有較高的效能，具有一定的臨床應(yīng)用意義。