查 萌, 田志強(qiáng), 李建成, 路子云, 李 貞, 張松斗, 劉小俠*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京 100193; 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 保定 071000)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)作為多食性害蟲,嚴(yán)重為害棉花、小麥和玉米等多種糧食和經(jīng)濟(jì)作物,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失[1]。傳統(tǒng)化學(xué)藥劑防治帶來了環(huán)境污染、害蟲抗藥性等一系列問題[2]。生物防治是棉鈴蟲綠色防控的重要手段之一[3-4]。中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator(Halidag)是一種獨(dú)居性內(nèi)寄生蜂,可寄生棉鈴蟲低齡幼蟲,通過抑制幼蟲取食而使其失去為害能力,是田間害蟲生物防控的重要因子[5-8]。棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus, HearNPV)作為一種重要的害蟲病原微生物,由于其安全、高效,且對(duì)非靶標(biāo)生物低毒等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲防治[9-11]。

寄生性天敵與微生物源農(nóng)藥協(xié)同應(yīng)用,在害蟲綜合治理中仍然面臨著較多挑戰(zhàn)。有研究表明,寄生蜂攜帶并傳播病毒對(duì)病毒在宿主種群中的流行以及對(duì)害蟲種群的控制起到重要作用。例如繭蜂科寄生蜂Microplitiscroceipes(Cresson)可以傳播3種野生型昆蟲病毒,有效提高煙芽夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius)的感毒率[12];黑腿絨繭蜂Apantelesmelanoscelus(Ratzeburg)先在感毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵再寄生健康寄主時(shí),能夠?qū)⑽瓒径旰诵投嘟求w病毒(Lymantriadisparnecleopolyhydrovirus, LdNPV)傳播至健康宿主種群;黑唇姬蜂Campoletissonorensis(Cameron)通過產(chǎn)卵器傳播煙芽夜蛾核型多角體病毒的效率高達(dá)40%[13];菜粉蝶絨繭蜂Apantelesglomeratus(Linnaeus)傳播菜粉蝶顆粒體病毒(Pierisrapaegranulovirus, PrGV)的效率能達(dá)到81%～95%[14]。此外,對(duì)于一些不能經(jīng)口感染的病毒,如囊泡病毒(Ascovirus, AV),只能依賴于寄生蜂的產(chǎn)卵行為將病毒注射到宿主血淋巴來進(jìn)行侵染[15-16]。

寄生蜂的傳毒方式對(duì)傳毒效率有重要影響,例如寄生蜂在感染病毒的寄主體內(nèi)產(chǎn)卵使產(chǎn)卵器攜帶病毒,隨后通過產(chǎn)卵將病毒傳播至健康宿主體內(nèi),從而實(shí)現(xiàn)病毒的水平傳播[17]。同時(shí)寄生蜂通過爬行等活動(dòng)將體表攜帶的病毒沾染到寄主昆蟲的生境內(nèi),也能夠使病毒在宿主種群中水平傳播[18]。此外,給寄生蜂飼喂含有病毒的蜂蜜水或用病毒懸浮液浸泡蜂繭也能傳播一定量的病毒,但具體的傳毒機(jī)制尚不明確[19-20]。

中紅側(cè)溝繭蜂與棉鈴蟲核型多角體病毒均能夠?qū)γ掴徬x的種群數(shù)量起到較好的控制作用。但當(dāng)二者同時(shí)使用時(shí),中紅側(cè)溝繭蜂能否充當(dāng)病毒的傳播載體,在棉鈴蟲種群內(nèi)部傳播病毒尚未見相關(guān)研究報(bào)道。探究不同方式下中紅側(cè)溝繭蜂對(duì)HearNPV的傳毒效率以及具體的傳播機(jī)制,將會(huì)為協(xié)同利用寄生蜂和昆蟲病毒防治棉鈴蟲提供一定的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棉鈴蟲:來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有害生物綜合治理實(shí)驗(yàn)室。幼蟲、蛹、成蟲均飼養(yǎng)在人工光照培養(yǎng)箱中,光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(70±10)%。幼蟲用人工飼料飼喂[21]。羽化為成蟲后每天用10%蜂蜜水飼喂,雌成蟲產(chǎn)卵后使用0.5% 84消毒液對(duì)卵布進(jìn)行消毒處理,隨后使用清水沖洗干凈。

中紅側(cè)溝繭蜂:由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。將200頭中紅側(cè)溝繭蜂的蜂繭置于指形管中羽化,羽化后的成蟲放入樹脂蜂箱(80 cm×80 cm×80 cm)中飼養(yǎng)并進(jìn)行交配,將蜂箱放在人工氣候培養(yǎng)箱里,培養(yǎng)條件為:光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(70±10)%。每天提供10%蜂蜜水作為成蟲營養(yǎng)源。成蜂羽化并自由交配2～3 d后進(jìn)行寄生繁育子代。

病毒:棉鈴蟲核型多角體病毒(Helicoverpaarmigeranucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HearNPV)干粉,每克含包涵體數(shù)量為5×1011個(gè)(5×1011OBs/g),購買于河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 中紅側(cè)溝繭蜂不同帶毒方式的傳毒效率測定

1.2.1體表噴灑病毒的寄生蜂傳毒試驗(yàn)

選取羽化后2～3 d的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂(羽化后2～3 d是中紅側(cè)溝繭蜂的交尾高峰期),用小噴瓶均勻噴灑2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液至寄生蜂體表,每頭蜂單頭處理,噴灑3泵的量。自然晾干10 min后讓其寄生健康棉鈴蟲,具體方法為:將蜂引入放有單頭3齡初棉鈴蟲的培養(yǎng)皿(d=10 cm),觀察到寄生蜂有產(chǎn)卵行為后將棉鈴蟲取出單頭飼養(yǎng),繼續(xù)放入下一頭棉鈴蟲,每只寄生蜂寄生5頭健康棉鈴蟲,連續(xù)寄生3 d,觀察50頭帶毒寄生蜂在帶毒第1天(處理當(dāng)天)、第2天、第3天的寄生行為,分別統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的染毒率。棉鈴蟲蟲體發(fā)白、行動(dòng)遲緩、最終液化死亡為典型的染毒死亡癥狀,據(jù)此可判定棉鈴蟲死亡由病毒引起。染毒率=染毒棉鈴蟲/處理的棉鈴蟲總數(shù)×100%。

1.2.2在染毒棉鈴蟲體內(nèi)產(chǎn)卵的寄生蜂傳毒試驗(yàn)

讓棉鈴蟲2齡初幼蟲取食滴加有2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液的小塊飼料,取食24 h后更換紫外照射30 min的新鮮人工飼料,取食帶毒飼料3 d后讓充分交配的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂寄生染毒的棉鈴蟲幼蟲,方法為:將10頭染毒的棉鈴蟲放入培養(yǎng)皿(d=10 cm),再引入1頭雌蜂,觀察到寄生蜂產(chǎn)卵1次后立即取出,繼續(xù)引入下一頭雌蜂。共引入50頭雌蜂作為染毒蜂用于后續(xù)試驗(yàn)。讓寄生過染毒棉鈴蟲的寄生蜂連續(xù)3 d寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1。統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的染毒率。

1.2.3飼喂含毒蜂蜜水的寄生蜂傳毒試驗(yàn)

用10%的蜂蜜水配制HearNPV懸浮液,濃度為2.5×107OBs/mL,讓充分交配3 d的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂取食1 d后寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1,連續(xù)寄生3 d,統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的染毒率。

1.2.4蜂繭浸毒的寄生蜂傳毒試驗(yàn)

取1日齡的中紅側(cè)溝繭蜂蜂繭,于2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液中浸泡10 s,自然晾干后單個(gè)繭放入指形管中,置于人工氣候箱[光周期L∥D=14 h∥10 h, 溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(70±10)%]中羽化,羽化后蜂放到一起充分交配3 d,然后讓雌蜂寄生健康3齡初棉鈴蟲。寄生方法同1.2.1,連續(xù)寄生3 d,統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲染毒率。

1.2.5從染毒棉鈴蟲體內(nèi)發(fā)育而來的寄生蜂傳毒試驗(yàn)

讓羽化后充分交配的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂寄生棉鈴蟲2齡末幼蟲。方法為:將1頭雌蜂引入放有10頭健康2齡初棉鈴蟲幼蟲的培養(yǎng)皿(d=10 cm)中,共寄生100頭棉鈴蟲,寄生2 d后給棉鈴蟲飼喂滴加有10 μL 104OBs/mL的HearNPV懸浮液的小塊人工飼料,收集棉鈴蟲體內(nèi)發(fā)育而來的寄生蜂蜂繭,單個(gè)置于指形管中羽化,羽化后充分交配3 d,再讓其寄生健康的3齡初棉鈴蟲幼蟲。寄生方法同1.2.1,連續(xù)寄生3 d,統(tǒng)計(jì)棉鈴蟲的染毒率。

對(duì)照組(CK)采用不進(jìn)行任何病毒處理的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂,羽化后充分交配3 d再進(jìn)行試驗(yàn)。處理組和對(duì)照組的寄生蜂每頭寄生5頭健康的棉鈴蟲幼蟲。采用單頭觀察法,將寄生蜂和單頭未染毒的棉鈴蟲幼蟲同時(shí)放入培養(yǎng)皿(d=10 cm)中,觀察到寄生蜂產(chǎn)卵后立即將棉鈴蟲幼蟲取出,單頭放入指形管中加入新鮮人工飼料飼養(yǎng),供試的健康棉鈴蟲幼蟲為體型基本一致的3齡初幼蟲,每種帶毒方式測試50頭中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂。處理組和對(duì)照組的50頭雌蜂寄生的棉鈴蟲主要表現(xiàn)為染毒、被寄生、未被寄生(正常狀態(tài))、不明原因(非染毒和寄生的癥狀),統(tǒng)計(jì)每種情況的比例。

1.3 不同帶毒方式下寄生蜂體內(nèi)病毒量檢測

1.3.1構(gòu)建HearNPV拷貝數(shù)與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

給2齡棉鈴蟲飼喂滴加10 μL 2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液的小塊飼料,待棉鈴蟲發(fā)育至3齡時(shí)提取DNA。以提取的DNA樣品為模板,用HearNPV的polyhedrin基因引物(序列:F:5′-CAAACCGAACCGTTGTTACC-3′,R:5′-TGCAA-GTTCATAACGGGAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[21],polyhedrin基因片段連接到載體pMD18-T上,再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,挑取單克隆提取質(zhì)粒,以10倍梯度稀釋為1.21×104～1.21×109拷貝/μL的質(zhì)粒作為模板,以polyhedrin基因的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,每濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),生成Ct值與拷貝數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以求出待測樣品的拷貝數(shù)。

1.3.2不同傳毒方式下中紅側(cè)溝繭蜂攜帶的病毒量檢測

取1.2中不同帶毒方式處理的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂,提取單頭蜂的DNA,以提取的DNA為模板,用病毒polyhedrin基因引物進(jìn)行熒光定量PCR,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算寄生蜂攜帶的病毒含量[20]。每組處理分別檢測10頭。

1.3.3飼喂含毒蜂蜜水的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂卵巢病毒檢測

由1.2中不同帶毒方式下的中紅側(cè)溝繭蜂傳毒效率結(jié)果得出,飼喂含毒蜂蜜水的方式寄生蜂的傳毒效率較高,為了進(jìn)一步探究寄生蜂是否經(jīng)消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)進(jìn)行傳毒,解剖了飼喂含毒蜂蜜水1 d后的寄生蜂的卵巢,并提取DNA檢測病毒量,對(duì)照組為未接觸病毒的中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂卵巢。病毒陽性對(duì)照為2.5×107OBs/mL HearNPV懸浮液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用Duncan氏多重比較法對(duì)不同傳毒方式處理下寄生蜂攜帶的病毒含量、卵巢病毒含量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中紅側(cè)溝繭蜂不同帶毒方式的傳毒效率

如圖1所示,中紅側(cè)溝繭蜂體表帶毒(圖1a)和飼喂含毒蜂蜜水(圖1b)的方式下,處理組和對(duì)照組80%左右的棉鈴蟲表現(xiàn)為被寄生的癥狀,在寄生蜂連續(xù)傳毒的3 d內(nèi),處理組均有棉鈴蟲染毒死亡,且隨著寄生蜂攜毒時(shí)間的延長,染毒率呈下降趨勢。在染毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵、蜂繭浸毒、繁育寄主帶毒方式下,除了蜂繭浸毒在傳毒第1 天和繁育寄主帶毒后傳毒第1 天棉鈴蟲染毒率分別為1.2%、5.7%以外,其余傳毒時(shí)間棉鈴蟲的染毒率均為0(圖2)。表明在上述3種情況下中紅側(cè)溝繭蜂不能傳播病毒。

圖1 寄生蜂體表帶毒(a)、飼喂含毒蜂蜜水(b)傳毒方式下棉鈴蟲癥狀的比例

圖2 在染毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵、蜂繭浸毒、繁育寄主帶毒方式下棉鈴蟲癥狀的比例

統(tǒng)計(jì)分析顯示(表1),中紅側(cè)溝繭蜂體表噴灑病毒以及飼喂含毒的蜂蜜水2種帶毒方式下的傳毒效率相對(duì)較高,在傳毒的第1、2、3天分別為15.1%、9.1%～9.3%、2.4%～4%,隨著傳毒時(shí)間的延長,傳毒效率逐漸降低。其他方式下的傳毒效率幾乎為0。

表1 不同帶毒方式下中紅側(cè)溝繭蜂寄生后棉鈴蟲的染毒率

2.2 不同帶毒方式下寄生蜂攜帶的病毒量檢測

由Ct值與HearNPV拷貝數(shù)得出Ct值與HearNPV拷貝數(shù)對(duì)數(shù)的線性關(guān)系為y=-3.4254x+ 39.786(x表示Ct值,y表示HearNPV拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)),圖中(圖3)數(shù)據(jù)顯示,處理組中紅側(cè)溝繭蜂雌蜂的病毒拷貝數(shù)顯著高于對(duì)照組(F=9.271,df=5,P<0.05)。其中寄生蜂體表噴灑病毒的處理方式攜帶病毒量最多[lg(HearNPV拷貝數(shù))≥3],在染毒棉鈴蟲體內(nèi)產(chǎn)卵的寄生蜂攜帶病毒量相對(duì)較少[lg(HearNPV拷貝數(shù))為2.3]。為探究飼喂含毒蜂蜜水時(shí)中紅側(cè)溝繭蜂是否通過生殖系統(tǒng)進(jìn)行傳播,檢測了飼喂含毒蜂蜜水的中紅側(cè)溝繭蜂卵巢中的病毒含量,得出病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為0.27(圖4),對(duì)照組病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為0.34,同對(duì)照組無顯著差異,說明取食含毒蜂蜜水后,卵巢中基本不含有病毒。

圖3 不同帶毒方式下的寄生蜂病毒含量

圖4 飼喂含毒蜂蜜水的中紅側(cè)溝繭蜂卵巢病毒含量

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明,幾種不同的帶毒方式下,中紅側(cè)溝繭蜂對(duì)HearNPV的傳播效率均較低,為0～15%。其中,飼喂含有病毒的蜂蜜水、蜂體表噴灑病毒懸浮液的傳毒效率相對(duì)較高,在傳毒的第1天達(dá)到15.1%。而蜂繭帶毒、繁育寄主帶毒和在染毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵的方式幾乎不能傳播病毒,傳毒效率第1天不超過6%,后2 d傳毒效率為0。

本研究得出寄生蜂通過不同的處理方式能夠攜帶部分病毒,但帶毒量與傳毒效率并非成正相關(guān),例如雌蜂從感染病毒寄主體內(nèi)發(fā)育而來、蜂繭浸毒的攜毒量與飼喂含毒蜂蜜水的攜毒量相當(dāng),但是傳毒效率卻相差較大,原因可能是:從感毒棉鈴蟲體內(nèi)發(fā)育而來的雌蜂以及蜂繭浸毒的雌蜂雖然攜帶一定量病毒,但其攜帶的病毒無法直接傳播至棉鈴蟲體內(nèi)或周圍的環(huán)境,導(dǎo)致傳毒效率低,飼喂含毒蜂蜜水是將雌蜂直接暴露于含有病毒蜂蜜水的棉球,蜂體表易沾染上病毒,在寄生時(shí)可以將病毒傳播至寄主的體表或周圍的環(huán)境和食物中,更容易經(jīng)口攝入,增加了染毒的概率。

通常情況下,寄生蜂在田間傳播病毒有兩種方式,一種是通過產(chǎn)卵行為將病毒注射到寄主血淋巴內(nèi);另一種是寄生蜂體表攜帶病毒,在寄主搜尋和寄生過程中將病毒帶到宿主生存的環(huán)境或宿主體表使宿主染毒[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)體表噴灑病毒和飼喂含毒蜂蜜水的傳毒效率較高,且在連續(xù)傳毒的3 d內(nèi),這2種方式的傳毒效率幾乎相等,并無顯著差異。飼喂含毒蜂蜜水的雌蜂卵巢中的病毒量與對(duì)照無顯著差異,說明病毒不是經(jīng)過寄生蜂的生殖系統(tǒng)進(jìn)行傳播。給中紅側(cè)溝繭蜂飼喂含有病毒的蜂蜜水、蜂體表噴灑病毒懸浮液表現(xiàn)較高的傳毒效率,說明很可能是通過體表沾染病毒來傳播,寄生蜂在取食含毒蜂蜜水的過程中體表沾染了病毒,在寄生過程中將體表的病毒帶到棉鈴蟲體表或生境中,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病毒的傳播。Stoianova等將病毒懸浮液噴灑在寄生蜂體表,病毒的傳播率明顯高于在染毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵而帶毒的方式,主要原因?yàn)轶w表沾染病毒后,寄生蜂既可以通過產(chǎn)卵將病毒引入寄主體內(nèi),也可以將病毒傳播至寄主昆蟲的食物上使其取食染毒,增加了病毒進(jìn)入寄主體內(nèi)的途徑,因此傳毒率相對(duì)較高[25]。Young等也認(rèn)為通過體表帶毒將病毒引入寄主體內(nèi)的概率要高于在染毒寄主體內(nèi)產(chǎn)卵的傳毒方式[18]。

在不同的寄生蜂-病毒-寄主系統(tǒng)中,寄生蜂能否傳播病毒以及具體的傳毒效率均有差異[19]。Zhang等測試了淡足側(cè)溝繭蜂Microplitispallidipes(Szepligeti)4種不同的帶毒方式——在染毒主體內(nèi)產(chǎn)卵、繁育寄主帶毒、蜂體表帶毒、給寄生蜂飼喂含毒蜂蜜水下對(duì)甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodopteraexiguamultiple necleopolyhydrovirus, SeMNPV)的傳播效率,結(jié)果表明不同帶毒方式傳毒效率相差較大,體表帶毒方式下傳毒效率顯著高于其他幾種方式[20]。影響病毒傳播效率的因素還包括供毒寄主本身攜帶的病毒載量。有研究結(jié)果表明寄生蜂只有在寄主染毒癥狀表現(xiàn)十分明顯時(shí)才能將其體內(nèi)的病毒傳播到健康的寄主,且傳毒效率隨著供毒寄主感染病毒濃度的升高而增加[26-28]。本研究只是初步統(tǒng)計(jì)了單一病毒濃度下的中紅側(cè)溝繭蜂傳毒效率,且采用的供毒寄主是染毒2 d的棉鈴蟲,可能棉鈴蟲體內(nèi)病毒量不高導(dǎo)致寄生蜂產(chǎn)卵器上未攜帶足量病毒,限制了傳毒效率。因此,還可以進(jìn)一步探究以飼喂不同濃度病毒或染毒不同天數(shù)的棉鈴蟲作為供毒寄主時(shí)中紅側(cè)溝繭蜂的傳毒效率。

本研究明確了給中紅側(cè)溝繭蜂飼喂含毒蜂蜜水和體表噴灑病毒方式下傳毒效率相對(duì)較高,中紅側(cè)溝繭蜂在染毒宿主體內(nèi)產(chǎn)卵、從染毒宿主體內(nèi)發(fā)育、蜂繭浸泡病毒3種方式幾乎不能傳播病毒。總體來說,中紅側(cè)溝繭蜂對(duì)HearNPV的傳播效率有限,后續(xù)可以探索開發(fā)新的寄生蜂傳播病毒的策略。