楊秀芹，張 倩，李佳欣，郝婉君，張曉涵，何鑫淼，龐 宇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

嵌合RNAs（chimeric RNAs）是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立基因融合產(chǎn)生的新RNAs。這種嵌合RNA常常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，已發(fā)現(xiàn)大量腫瘤特有嵌合RNA，其中一些嵌合RNA 可作為腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)記物[1]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展，越來(lái)越多研究表明，正常生理?xiàng)l件下也存在嵌合RNA，其廣泛參與各項(xiàng)生命活動(dòng)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞活力和生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用[2-3]。

相鄰基因間順式剪接（cis-splicing of adjacent genes，cis-SAGe）是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上產(chǎn)生嵌合RNA 的主要方式之一。cis-SAGe 是同一條染色體上兩個(gè)相鄰基因間發(fā)生轉(zhuǎn)錄通讀，再通過(guò)內(nèi)含子剪接將不同基因外顯子連接成一個(gè)嵌合RNA 過(guò)程[4]。內(nèi)含子剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控重要手段，cis-SAGe 和經(jīng)典內(nèi)含子剪接機(jī)制相同，均由剪接位點(diǎn)（Splice sites，SS）、小分子核糖核蛋白等共同參與完成。剪接時(shí)，在剪接增強(qiáng)子、沉默子等剪接調(diào)控元件（Splicing regulatorycis-elements，SRE）調(diào)控下，pre-mRNA 上 SSs 與小分子核糖核蛋白共同裝配成RNA 剪接復(fù)合體，形成套索結(jié)構(gòu)，切除內(nèi)含子，將外顯子連接[5]。根據(jù)SRE 相對(duì)位置和作用，可分為外顯子剪接增強(qiáng)子（Exonic splicing enhancer，ESE）、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子（Intronic splicing enhancer，ISE）、外顯子剪接沉默子（Exonic splicing silencer，ESS）及內(nèi)含子剪接沉默子（Intronic splicing silencer，ISS）。這些順式作用元件通過(guò)招募剪接因子影響剪接位點(diǎn)選擇，調(diào)控剪接過(guò)程。目前有關(guān)cis-SAGe 剪接調(diào)控機(jī)制研究較少，親本基因外顯子被剪接的決定因素尚不清楚。

B-細(xì)胞淋巴瘤因子2 樣蛋白2（B-cell lymphoma 2-like 2 protein，BCL2L2）是細(xì)胞凋亡重要調(diào)控因子，抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化[6-7]。核多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1（poly（A）binding protein nuclear 1，PABPN1）是一種普遍存在的多聚腺苷酸化因子，對(duì)真核細(xì)胞多聚（A）尾延伸至關(guān)重要[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)室前期在豬脂肪組織中鑒定一個(gè)cis-SAGe產(chǎn)物——BCL2L2-PABPN1（BP）[10]。為進(jìn)一步分析嵌合子BP 剪接調(diào)控機(jī)制，試驗(yàn)利用minigene、半定量RT-PCR技術(shù)、結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定影響嵌合子生成的SRE；同時(shí)比較分析BP 和親本基因組織表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況，研究結(jié)果進(jìn)一步揭示BP轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，為探究BP功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆的BP cDNA 序列（GenBank No.MH795109）及其Blat（http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgBlat）分析結(jié)果，設(shè)計(jì)引物M1F/R 和M2F/R，分別用于擴(kuò)增豬 BCL2L2 外顯子 3～4 和 PABPN1 外顯子 1～2 基因組 DNA 片段，在 M1R 和 M2F 引物 5'末端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn)。同時(shí)設(shè)計(jì)引物用于對(duì)BCL2L2 內(nèi)含子3 的5'端、3'端及PABPN1 外顯子4 的5'端序列進(jìn)行缺失突變。此外，設(shè)計(jì)引物MAR 與T7F 引物配合使用，對(duì)minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量RT-PCR 鑒定。本研究中所有引物均使用Primer premier 5.0 軟件自行設(shè)計(jì)，由北京華大基因科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 核酸提取

民豬耳組織樣采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，利用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA。利用 TRIzol（Invitrogen，CA，USA）提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸質(zhì)量及完整性，利用Nanodrop 2000（IMPLEN，CA，USA）測(cè)量核酸濃度。

1.3 半定量RT-PCR

利用 Vazyme 公司（Nanjing，China）HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription，RT）反應(yīng)，合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。PCR 反應(yīng)總體系為10 μL，含有2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.7 μL。目的基因和內(nèi)參退火溫度分別為56 和60 ℃，循環(huán)數(shù)均為24個(gè)。

1.4 minigene構(gòu)建

以基因組DNA 為模板，分別利用引物M1F/R和M2F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，通過(guò)EcoRⅠ（TaKaRa）酶切位點(diǎn)連接，克隆入pMD18-T 載體（TaKaRa）中，測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建的克隆載體和pcDNA3.1+分別用KpnⅠ和XbaⅠ（TaKaRa）雙酶切后，利用T4DNA連接酶（Ta-KaRa）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性菌落經(jīng)菌液PCR 初篩后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序驗(yàn)證。在此步驟中，PCR 反應(yīng)利用2×TaqMaster Mix進(jìn)行催化，酶切和連接反應(yīng)均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書操作。

1.5 缺失突變

利用重疊延伸PCR方法對(duì)minigene上片段進(jìn)行缺失突變[11]。該方法由兩輪PCR反應(yīng)組成，第一輪反應(yīng)（反應(yīng)a 和b）通過(guò)引物設(shè)計(jì)在兩個(gè)小片段末端引入缺失，再通過(guò)PCR 反應(yīng)（反應(yīng)c）將兩個(gè)片段拼接，將缺失引入到擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部。各缺失片段引物見(jiàn)表1，缺失突變反應(yīng)方案見(jiàn)表2。在反應(yīng)a和b 利用高保真DNA 聚合酶催化，反應(yīng)總體系為25 μL，含有 2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，野生型 minigene 質(zhì)粒 DNA 25 ng。反應(yīng) c 利用 2×TaqMaster Mix 進(jìn)行催化，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物末端引入A，方便后續(xù)T-A 克隆，模板為反應(yīng)a 和b 擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋物。

表2 重疊延伸PCR中引物配對(duì)使用方案Table 2 Pairing scheme of primers in overlapped-extension PCR

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

豬腎上皮細(xì)胞PK-15 按照常規(guī)方法培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，利用Lipofectamine 2000TM試劑（Invitrogen，CA，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書操作。24 h后收集細(xì)胞。

1.7 剪接元件鑒定

RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，分析缺失突變對(duì)minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的影響。利用在線工具regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）鑒定潛在的剪接元件。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）方法分析BP、BCL2L2 和 PABPN1 在不同發(fā)育時(shí)期脂肪組織中表達(dá)情況，模板cDNA合成方法見(jiàn)1.3，qPCR 反應(yīng)利用Vazyme 公司AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行，嚴(yán)格按照該試劑盒說(shuō)明書操作。以β-actin 作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

1.9 亞細(xì)胞定位

將BP、BCL2L2 和PABPN1 基因全長(zhǎng)編碼區(qū)分別克隆入pEGFP-N1載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。其中BP 插入到HindⅢ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)間，BCL2L2 和PABPN1 利用EcoRⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行克隆。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞，利用DAPI 染色，在熒光顯微鏡（Zeiss Axiovert 200 M）下觀察重組熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布情況，拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)t檢驗(yàn)分析野生型對(duì)照組和片段缺失組差異顯著性。各試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 minigene構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驗(yàn)證

BP 兩個(gè)親本基因——BCL2L2 和 PABPN1 分別含有4 個(gè)和7 個(gè)外顯子，串聯(lián)排列于豬7 號(hào)染色體上，中間間隔小于10 kb。BP通過(guò)cis-SAGe典型方式剪接形成：除BCL2L2 最后一個(gè)外顯子和PABPN1第一個(gè)外顯子外，兩個(gè)親本基因其他外顯子均完整保留于BP[10]。為鑒定BP 剪接的影響因子，本研究選取BCL2L2外顯子3和PABPN1外顯子2之間部分基因組序列，構(gòu)建豬嵌合RNA BP 的minigene（見(jiàn)圖1）。根據(jù)理論推測(cè)，minigene BP應(yīng)有兩種順式剪接產(chǎn)物：嵌合RNA（產(chǎn)物A）以及正常、包含所有外顯子產(chǎn)物（產(chǎn)物B）。minigene 轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種預(yù)期產(chǎn)物均存在（見(jiàn)圖2），測(cè)序分析證明RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)正確性。說(shuō)明minigene可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩種成熟mRNA，用于后續(xù)剪接調(diào)控分析。

圖1 minigene結(jié)構(gòu)及預(yù)期產(chǎn)物Fig.1 Schematic structure and the theoretical products of minigene

圖2 minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定Fig.2 Identification of the splicing products of minigene

2.2 內(nèi)含子3的3'末端剪接調(diào)控元件鑒定

首先對(duì)內(nèi)含子3的3'端進(jìn)行片段缺失分析，并結(jié)合生物信息學(xué)方法鑒定重要剪接調(diào)控元件。共構(gòu)建3 個(gè)缺失突變型minigene，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、RTPCR 分析發(fā)現(xiàn)，片段A 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段C 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），片段B 缺失不影響嵌合分子表達(dá)（P＞0.05），如圖3所示。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，缺失片段A 和C 上均存在thyroid hormone receptor exon 9 和 gh-1 intron 3 等 反 應(yīng) 元 件 ，詳見(jiàn)表3。

表3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的剪接增強(qiáng)子Table 3 Splicing enhancer predicted by bioinformatic method

圖3 內(nèi)含子3的3'端缺失對(duì)嵌合子生成的影響Fig.3 Effects of deletion in 3'end of intron 3 on the production of chimeric RNA

2.3 內(nèi)含子3的5'端剪接調(diào)控元件鑒定

在內(nèi)含子3 的5'末端，片段1 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段2缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），片段3缺失不影響嵌合分子表達(dá)（P＞0.05），如圖4所示。在缺失的片段1 和2 上均預(yù)測(cè)到多個(gè)內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子元件，且二者不存在共同元件，詳見(jiàn)表3。

圖4 內(nèi)含子3的5'端缺失對(duì)嵌合子生成的影響Fig.4 Effects of deletion in 5'end of intron 3 on the production of chimeric RNA

2.4 外顯子4剪接調(diào)控元件鑒定

在BCL2L2外顯子4上研究發(fā)現(xiàn)，片段A或B缺失均導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段C缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)缺失片段只存在一種外顯子剪接增強(qiáng)子——srp40-exonic splicing enhancer，詳見(jiàn)表3。

2.5 組織表達(dá)分析

RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)BP 普遍表達(dá)于所檢測(cè)的各種組織中（見(jiàn)圖6A）。qPCR分析表明，在不同發(fā)育時(shí)期脂肪組織中，BP 表達(dá)模式和兩個(gè)親本略有不同（見(jiàn)圖6B），隨日齡增加，BP 表達(dá)量逐漸上升，在180日齡時(shí)達(dá)到最高，之后略有下降。

圖6 BP組織表達(dá)（A）及在脂肪組織中發(fā)育性表達(dá)（B）分析Fig.6 Expression of BP in tissues(A)and in developmental fat tissues(B)

2.6 亞細(xì)胞定位分析

BP和親本的亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖7所示。

由圖7 可知，BCL2L2 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，BP 和PABPN1 則主要在細(xì)胞核中表達(dá)。亞細(xì)胞定位是基因功能基礎(chǔ)，由此推測(cè)BP 在功能上可能更接近于PABPN1。

圖7 BP和親本亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.7 Subcellular localization of BP and the parent genes

圖5 外顯子4片段缺失對(duì)嵌合子生成的影響Fig.5 Effects of deletion in exon 4 on the production of chimeric RNA

3 討 論

cis-SAGe包括兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)：轉(zhuǎn)錄通讀和剪接加工。目前在轉(zhuǎn)錄通讀調(diào)控機(jī)制方面研究較多，已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CTCF、poly（A）信號(hào)等因素影響轉(zhuǎn)錄通讀[12-13]。與親本基因序列組成的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，cis-SAGe在轉(zhuǎn)錄后剪接加工過(guò)程中，去掉兩個(gè)親本間臨近外顯子，典型方式為5'親本的最后一個(gè)外顯子和3'親本的第一個(gè)外顯子作為內(nèi)含子被剪接掉[14-16]，剪接機(jī)制與經(jīng)典剪接一致，這些外顯子發(fā)生跳躍（Exon skipping）的原因尚不清楚。

Minigene是研究基因表達(dá)調(diào)控的有力工具，用于分析突變對(duì)基因表達(dá)的影響、鑒定可變剪接轉(zhuǎn)錄本和順式調(diào)控元件、揭示不同細(xì)胞內(nèi)剪接差異及機(jī)制[17-18]。Minigene 正確表達(dá)關(guān)鍵是含有SSs，SSs 位于內(nèi)含子上，包括5'末端的GU、3'末端的AG 和位于 3'SSs 上游 18～40 nt 的分支點(diǎn)。SSs 突變常常導(dǎo)致錯(cuò)誤剪接，在成熟mRNA中出現(xiàn)序列缺失或增加[19]。對(duì)于一些較大內(nèi)含子，可截取其3'和5'末端部分序列參與構(gòu)建minigene，降低minigene 長(zhǎng)度，提高轉(zhuǎn)染效率。本研究中參與剪接形成嵌合子的兩個(gè)內(nèi)含子均較小，故將所有堿基全部用于構(gòu)建minigene，完整保留SSs；且在構(gòu)建各缺失突變體時(shí)，均保留內(nèi)含子3'末端的60 bp 和5'末端的10 bp，確保剪接信號(hào)不受片段缺失影響，保證minigene 轉(zhuǎn)錄后剪接順利進(jìn)行。與理論預(yù)期一致，minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生外顯子跳躍和包含所有外顯子的兩種剪接產(chǎn)物。本研究重點(diǎn)是鑒定影響嵌合子形成的順式作用元件，所以僅對(duì)發(fā)生外顯子跳躍的mRNA（即嵌合RNA）表達(dá)情況進(jìn)行研究，鑒定有潛在作用的反應(yīng)元件。

ISE 有助于小外顯子進(jìn)行高效剪接[20]；ESE 位于外顯子上，但影響剪接位點(diǎn)正確選擇、使用[21]。在BP 剪接生成過(guò)程中，BCL2L2 內(nèi)含子3 和PABPN1內(nèi)含子1及二者之間序列被作為一個(gè)大的內(nèi)含子剪接掉，這個(gè)大內(nèi)含子的5'和3'末端提供SSs，同時(shí)原有剪接信號(hào)被忽視。為確定引起這些變化的因素，本研究分析BCL2L2 內(nèi)含子3 和外顯子4上剪接調(diào)控元件，鑒定BP 表達(dá)影響因子，發(fā)現(xiàn)srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、β-tropomyosin exon 6b等元件可能在嵌合子表達(dá)剪接調(diào)控中發(fā)揮作用。Srp40 蛋白結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后剪接過(guò)程，直接影響剪接能否正常進(jìn)行[22]，ASB10基因上該位點(diǎn)突變導(dǎo)致原有剪接位點(diǎn)不被識(shí)別，生成新的成熟mRNA[23]，在外顯子4 的3 個(gè)缺失片段上均僅預(yù)測(cè)到srp40-exonic splicing enhancer 反應(yīng)元件，其對(duì)嵌合子生成的影響，值得進(jìn)一步研究。gh-1 intron 3最早發(fā)現(xiàn)于人生長(zhǎng)激素-1（Growth hormone-1，GH-1）基因內(nèi)含子3 上，核心序列為G2X1-4G3，該序列突變導(dǎo)致GH-1 基因剪接時(shí)發(fā)生外顯子3 跳躍，生成截短蛋白質(zhì)多肽鏈，影響正常蛋白質(zhì)分泌[24]。人GH-1 研究表明，gh-1 intron 3 不存在累加效應(yīng)，與其他ISE 序列不同[24]。多數(shù)ISE 均是以多拷貝形式存在并調(diào)控可變剪接轉(zhuǎn)錄本表達(dá)時(shí)具有累加效應(yīng)，如雞β-tropomyosin 內(nèi)含子 7、人α-globin 內(nèi)含子2上鑒定到的ISE序列[25-26]。本研究在缺失片段A和C 中均檢測(cè)到gh-1 intron 3，其作用方式及是否具有累加作用，還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用半定量RT-PCR、生物信息學(xué)分析及定點(diǎn)突變技術(shù)鑒定影響嵌合RNA BP剪接生成的調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、βtropomyosin exon 6b等元件具有重要作用，且BP在組織中普遍表達(dá)且受發(fā)育調(diào)控，通過(guò)亞細(xì)胞定位分析確定BP 與親本PABPN1 均定位在細(xì)胞核內(nèi)，推測(cè)二者可能在功能上更接近，為深入分析BP 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制提供參考。