胡浩，楊曉文，程德華，李秀蓉，何文斌，胡曉，高伯笛，趙曉蒙，張前軍1,2,，杜娟1,，劉激揚，盧光琇1,2,，林戈1,2,，李汶1,

一例X染色體結構重排導致DMD疾病

胡浩3,4，楊曉文3,4，程德華3,4，李秀蓉3,4，何文斌3,4，胡曉3,4，高伯笛3,4，趙曉蒙3,4，張前軍1,2,3,4，杜娟1,3,4，劉激揚5，盧光琇1,2,3,4，林戈1,2,3,4，李汶1,3,4

1. 中南大學基礎醫(yī)學院生殖與干細胞工程研究所，長沙 410078 2. 人類干細胞國家工程研究中心，長沙 410078 3. 中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院，長沙 410000 4. 湖南省生殖與遺傳臨床醫(yī)學研究中心，長沙 410000 5. 長沙市衛(wèi)生健康委員會，長沙 410023

假肥大型肌營養(yǎng)不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy，DMD/BMD)是一種最常見的進行性肌營養(yǎng)不良疾病，呈X-連鎖隱性遺傳，主要由基因的缺失、重復及點突變所致，極少數(shù)病例是由于染色體結構重排破壞了基因而引起疾病的發(fā)生。本文報告了1例經(jīng)多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)和下一代測序檢測后原因未明的、具有典型癥狀的DMD患者。采用核型分析、FISH分析及三代測序、Sanger測序綜合分析發(fā)現(xiàn)，患者存在母源性的X染色體臂間倒位(Chr.X:g. [31939463–31939465del; 31939466–131765063 inv; 131765064–131765067del])半合子變異。由于該變異破壞了基因和基因，因此推測該變異是患者發(fā)病的遺傳學病因。患者表現(xiàn)肌無力等典型的DMD癥狀，沒有明顯的Paganini-Miozzo綜合征相關癥狀。本病例的明確診斷，提示結構重排破壞基因也是導致DMD重要原因之一；常規(guī)遺傳學檢測陰性的患者應考慮核型分析、FISH驗證等結構重排變異檢測技術，通過三代測序技術能確定大概的重排斷點位置，Sanger測序可明確斷點區(qū)域序列。本病例報告通過明確的遺傳學診斷為該患者所在家庭進行生殖干預、降低再生育風險提供了診療基礎。

DMD；結構重排；核型分析；FISH；斷點分析

假肥大型肌營養(yǎng)不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy, DMD/BMD)為常見的進行性肌營養(yǎng)不良疾病，呈X-連鎖隱性遺傳，發(fā)病率為1/3500活產(chǎn)男嬰，主要的突變類型為缺失(約占60%～75%)、重復(8%～15%)和小突變(點突變及微小片段插入和缺失約占20%左右)[1～3]。遺傳學檢測的策略一般是利用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-depen-dent probe amplification, MLPA)檢查缺失和重復突變，對結果為陰性者進行基因各外顯子及側翼序列測序，診斷率可達95%以上[2]。其余約3%～5%的突變?yōu)樯疃葍?nèi)含子突變及染色體結構重排所致，該類突變可通過全基因組測序或三代測序基因、mRNA測序及核型分析、FISH等技術檢測。本文報道1例經(jīng)核型分析、FISH檢測及三代測序、Sanger驗證發(fā)現(xiàn)的X染色體倒位破壞基因?qū)е碌腄MD病例。

1 對象與方法

1.1 對象及臨床資料收集

先證者出生時因新生兒肺炎、懷疑新生兒缺氧缺血性腦損傷及顱內(nèi)缺血就診，發(fā)現(xiàn)心肌酶譜明顯異常(LDH: 1995 IU/L, CK: 67 558 IU/L, CK-MB: 1040 U/L)。2歲3個月會行走，步態(tài)不穩(wěn)，上樓梯困難，曾因“足外翻”行康復治療，智力正常。3歲時肌電圖檢查示肌源性損害，肌活檢可見大量肌纖維萎縮、變性、壞死及少量肥大、再生肌纖維，提示骨骼肌呈肌營養(yǎng)不良樣病理改變，疑DMD。9歲時出現(xiàn)行走困難，本院(中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院)就診時11歲，不能走路，坐輪椅，體查發(fā)現(xiàn)小腿腓腸肌假性肥大不明顯；智力同同齡兒，讀初一，成績中等。自訴視力正常，聽力正常。否認家族中有類似癥狀患者史(圖1)。本研究獲得中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院倫理委員會批準，并經(jīng)患者及其父母同意后簽署知情同意書。

患兒來本院前多次外院就診并行基因檢測：3歲時行基因MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)外顯子缺失和重復，點突變提示患兒基因存在c.2096C> G(p.Ala699Gly)雜合變異(可能良性變異)，遺傳自其母親；3歲5月齡于華大基因行基因檢測，未發(fā)現(xiàn)外顯子缺失及明確意義的點突變；3歲7月齡外院診斷為“肢帶型肌營養(yǎng)不良”，行、、、等基因檢測未發(fā)現(xiàn)異常，10歲時行全外顯子組測序檢測，發(fā)現(xiàn)基因和基因存在雜合意義不明變異，均遺傳自其父親。上述基因檢測結果均不能解釋患者的表型。

1.2 核型分析及FISH驗證

常規(guī)制備外周血淋巴細胞中期染色體分裂相，通過胰酶消化和吉姆薩染料進行G顯帶，選取帶紋清晰、分散良好的分裂相計數(shù)至少20個中期相，核型分析5個分裂相。核型分析結果參考國際人類細胞遺傳命名系統(tǒng)(International System for Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN)(2016)進行描述。利用常規(guī)G顯帶剩余細胞懸液制備中期染色體玻片，60℃烘烤1 h，RNA酶(0.1 μg/μL)溶液37℃消化40 min，梯度酒精(75%、80%、100%)脫水各2 min，室溫晾干，75℃水浴預熱的變性液(75%甲酰胺/ 2×SSC)中變性5 min，梯度酒精(75%、90%、100%)脫水各2 min，室溫晾干玻片；按照Vysis·LSI (locus specific identifier) DNA Probes說明書(美國Abbott-Vysis)配制X染色體短臂末端(綠色信號)、長臂末端(紅色信號)和著絲粒區(qū)域(白色信號)探針組合液，于75℃水浴變性5 min，將5 μL已變性探針滴加到載玻片標本區(qū)并用蠟膜封片，放入濕盒中于37℃恒溫箱中雜交過夜；雜交完成后高鹽緩沖液洗脫，梯度酒精(75%、90%、100%)脫水各2 min，室溫晾干，滴加5 μL DAPI復染液(0.5 mg/mL)于暗處放置20 min，通過FISH2.1軟件用熒光顯微鏡在40倍物鏡下拍照分析30個中期分裂相；根據(jù)X染色體發(fā)生臂間倒位后著絲粒信號與短臂末端綠色信號斑之間的距離是否有明顯改變，判斷是倒位X染色體還是正常X染色體。

圖1 患者家系圖

?表示正常女性，?表示正常男性；☉表示女性攜帶者；█表示患者；△表示流產(chǎn)，加/表示人工流產(chǎn)；箭頭所指為先證者。

1.3 三代測序DMD panel檢測

2020年12月患兒來我院就診，鑒于其臨床表型符合DMD的特征，選擇三代測序進行DMD panel檢測(武漢希望組醫(yī)學檢驗實驗室有限公司)。DMD 全長基因檢測(包括全部外顯子、內(nèi)含子、啟動子及基因側翼區(qū))使用長片段捕獲結合三代測序技術進行深度測序，以實現(xiàn)對全部突變類型的全覆蓋，包括點突變(single nucleotide variants, SNV)、插入缺失突變(Indel)、雜合/純合/復合雜合型缺失重復突變、動態(tài)突變、復雜重組、易位、倒位、重排等所有結構變異類型的精準檢測。

1.4 Gap-PCR分析及Sanger測序分析斷裂點

根據(jù)三代測序的結果，在基因47號內(nèi)含子及基因5號內(nèi)含子合適區(qū)域設計2對引物F1、F2和R1、R2，序列信息詳見表1。以患兒母親、患兒、正常男性(+)、正常女性(–)及空白對照(H2O)為模板進行PCR擴增，退火溫度均為52℃。擴增產(chǎn)物純化后常規(guī)Sanger測序。

表1 本研究使用的引物序列

2 結果與分析

2.1 G顯帶核型及FISH分析

G顯帶核型分析提示患兒及其母親均存在X染色體倒位，核型分別為46,Y,inv(X)(p21.2q26)mat、46,X, inv(X)(p21.2q26)(圖2)。FISH提示母親核型為46,X, inv(X)(p21q26).ish inv(X)(Subtel Xp+,CEP X+,Subtel Xq+)，患兒核型為46,Y,inv(X)(p21q26).ish inv(X)(Subtel Xp+,CEP X+,Subtel Xq+)，與G顯帶結果一致。

2.2 三代測序結果分析倒位大致斷裂點

患兒攜帶一段長度約為99.83 Mb的半合子倒位變異，該變異的2個斷點分別位于基因47號內(nèi)含子和基因5號內(nèi)含子，倒位區(qū)域包含了基因的第1～47號外顯子的全部序列和基因的第6號外顯子的全部序列以及其他508個基因的全部序列(圖3A)。按照ISCN(2016)命名規(guī)則，該結構變異被命名為：Seq[GRCh37] inv(X)(pter→p21.1::q26.2→p21.1::q26.2→qter) Chr.X: g.[31939463–31939465del; 31939466–131765063 inv; 131765064–131765067del]。

圖2 患者及其母親的G帶核型分析與FISH檢測結果

A：患兒母親G顯帶核型分析結果；B：患兒母親FISH檢測結果；C：患兒G顯帶核型分析結果；D：患兒FISH檢測結果。

2.3 Gap-PCR及Sanger測序確定斷裂點堿基序列

F1/R1、F2/R2的引物配對時，先證者母親、先證者均能擴增出對應大小的產(chǎn)物，正常男性(+)、正常女性(–)及空白對照(H2O)沒有相應的擴展產(chǎn)物(圖3B)。Sanger測序結果提示先證者F1/R1擴增片段為基因外顯子48側的47內(nèi)含子序列與基因外顯子6側的5內(nèi)含子序列的融合片段；先證者F2/R2擴增片段為基因外顯子47側的47內(nèi)含子序列與基因外顯子5側的5內(nèi)含子序列的融合片段(圖3C)。F1/F2、R1/R2的引物配對時，先證者母親、正常男性(+)、正常女性(–)均能擴增出對應大小的產(chǎn)物，先證者及空白對照(H2O)沒有相應的擴展產(chǎn)物(圖3D)。Sanger測序結果提示先證者母親F1/F2擴增片段箭頭前后均為基因47內(nèi)含子序列，R1/R2擴增片段箭頭前后均為基因5內(nèi)含子序列(圖3E)。綜上所述，先證者存在Chr.X:g.[31939463–31939465del; 31939466–131765063 inv; 131765064–131765067del]半合子變異；患兒母親為該變異雜合子。

3 討論

DMD/BMD是由于基因發(fā)生基因變異、導致抗肌萎縮蛋白(dystrophin)表達異常的肌病?；蛳嚓P的突變類型較多，根據(jù)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫(Human Genome Mutation Database, HGMD)收錄[4](數(shù)據(jù)截至2022年8月1日)，有2436個微小變異(missense/nonsesns，splicing substitutions, regulatory substitutions, small deletions, small insertions/duplications, small indels)、1905個大片段缺失(gross deletions)、770個大片段插入/重復(gross insertions/duplications)和143個復雜的結構重排(complex rearrangements) 4大類(圖4)。上述四大類基因變異中，結構重排占比最少(3%)，本院(中信湘雅生殖與遺傳專科醫(yī)院)2014～2022年基因水平確診的623例DMD/BMD患者的突變種類中(另文發(fā)表)結構重排占比2.9%，兩者結果相似。

據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫[4]，可進一步將復雜的結構重排(complex rearrangements)分為11小類：①多位點堿基突變；②缺失和重復；③外顯子跳躍式缺失或重復；④外顯子跳躍式缺失和插入/重復；⑤大片段缺失和點突變；⑥超大片段缺失和插入及倒位；⑦小片段(1 Mb以下)倒位和缺失；⑧基因內(nèi)倒位；⑨X染色體臂內(nèi)超基因倒位；⑩X染色體臂間倒位；?X染色體與常染色體相互易位等。其中①～③、⑤這4小類可通過MLPA+NGS (next generation sequencing)檢出，而④、⑥～?等7小類僅經(jīng)過MLPA+NGS難以檢出。針對X染色體結構重排如X染色體臂內(nèi)超基因倒位、X染色體臂間倒位和X染色體與常染色體相互易位，可經(jīng)核型分析發(fā)現(xiàn)部分患者的致病原因，但也不能確定具體的倒位斷裂位點的位置，破壞了哪些基因。本文所述的病例輾轉(zhuǎn)多個醫(yī)院及檢測機構均沒有在DNA水平上確診。對于這類MLPA+NGS檢測未明確病因的DMD患者，應考慮核型分析以期發(fā)現(xiàn)結構重排；進一步還可通過三代測序確定具體的染色體斷裂位置。三代測序具備長讀長的技術特點，因此使用長片段捕獲基因結合三代測序技術進行深度測序，以實現(xiàn)對基因全部突變類型的全覆蓋，包括點突變(SNV)、插入缺失突變(Indel)、雜合/純合/復合雜合型缺失重復突變、動態(tài)突變、復雜重組、易位、倒位、重排等所有結構變異類型的精準檢測。對于X染色體臂間倒位和X染色體與常染色體相互易位還可以通過FISH進一步確認。

基因組結構異常斷裂連接位點的確定可為患者遺傳咨詢和生育咨詢進一步提供精準的理論依據(jù)。到目前為止，僅有5例X染色體臂間倒位破壞基因案例的報道[5～9]。在這5個研究中只有1個患者的斷裂連接點被明確，其主要方法是使用FISH明確大致斷點區(qū)域，然后使用PCR結合Sanger測序明確斷點[6]。然而，其他的病例采用核型分析、FISH和RT-PCR等方法僅確定了斷裂的大致區(qū)域，沒有明確具體的斷裂連接位點。同時，以上方法步驟繁瑣、所需材料獲取困難，如FISH確定斷裂連接區(qū)域時需要大量探針，過程繁瑣，RT-PCR需要獲取患者的肌肉組織等。本研究通過抽取患者新鮮外周血采用三代測序發(fā)現(xiàn)患者的2個斷點分別位于基因第47號內(nèi)含子和基因的第5號內(nèi)含子(Chr.X:g.[31939463–31939465del; 31939466–131765063 inv; 131765064–131765067del])，然后設計引物擴增斷點兩側序列經(jīng)Sanger測序可精準明確斷點的堿基序列。因此，三代測序(long-read sequencing)是明確結構變異斷裂連接位點的簡便有效方法。

圖3 Gap-PCR產(chǎn)物電泳結果及相應擴增片段的測序結果

A：倒位X染色體的模式圖及斷裂位點引物F1/R1、F2/R2分布模式圖。B：以先證者母親、先證者、正常男性(+)、正常女性(–)及空白對照(H2O)為模板，以F1/R1、F2/R2配對為引物的擴增產(chǎn)物的電泳結果。C：先證者母親、先證者的F1/R1、F2/R2配對引物擴增產(chǎn)物測序結果圖。D：以先證者母親、先證者、正常男性(+)、正常女性(–)及空白對照(H2O)為模板，以F1/F2、R1/R2配對為引物的擴增產(chǎn)物的電泳結果圖。E：先證者母親的F1/F2、R1/R2配對引物的擴增產(chǎn)物測序結果圖，其中下劃線所示的AGAG、AGC為倒位所致缺失的堿基。

圖4 HGMC數(shù)據(jù)庫(A)與中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院(B)病例中DMD基因變異類型比例比較

(硫酸肝素6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶)基因含6個外顯子，有2個轉(zhuǎn)錄本，全長的轉(zhuǎn)錄本主要在成年人和胎兒腦部表達，較長轉(zhuǎn)錄本少約40個氨基酸殘基的短轉(zhuǎn)錄本主要在卵巢、胎盤及胎兒腎中表達，其功能主要體現(xiàn)對HS、n-硫酸肝素、肝素和HS的一些衍生物具有6-O-磺基轉(zhuǎn)移酶活性[10,11]?；蛲蛔兛蓪е翽aganini-Miozzo綜合征(MRXSPM; 301025)，呈X-連鎖隱性遺傳，是一種神經(jīng)發(fā)育障礙，以整體發(fā)育遲緩、智力發(fā)育受損、高度近視和輕度畸形面部特征為特征[12]。本例患兒雖然倒位打斷了基因的結構，斷點位于內(nèi)含子5，導致外顯子6完全缺失(編碼290個氨基酸)，但患者除了有典型的DMD癥狀外，暫時沒有發(fā)現(xiàn)Paganini- Miozzo綜合征相關癥狀，智力正常，現(xiàn)讀初中，成績可，視力正常、聽力正常，除薄唇外沒有其他的明顯的OMIM中記錄的面部特征。原因可能有：基因與Paganini-Miozzo綜合征相關性待確定，目前僅1篇文獻報道基因與Paganini- Miozzo綜合征相關[12]，該文獻報道了1例基因c.916G>C (G306R)變異導致嚴重的精神發(fā)育遲緩、特殊面容和高度近視伴脈絡膜視網(wǎng)膜病變。本文中的患兒存在其他調(diào)控通路，補償了基因功能缺失導致效應。

本病例的明確診斷，為該患者所在家庭進行生殖干預、降低再生育風險提供了診斷基礎，同時也提示結構重排破壞基因也是導致DMD重要原因之一，在臨床遺傳學醫(yī)療實踐中需予以重視。核型分析、FISH驗證是檢測結構重排變異的經(jīng)濟而有效技術，若發(fā)現(xiàn)染色體結構重排可進一步利用三代測序確定大概的重排斷點位置、并通過Sanger測序明確斷點區(qū)域的序列信息。

致謝：

感謝希望組在三代測序(long-read sequencing)中給予的幫助。

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A DMD case caused by X chromosome rearrangement

Hao Hu3,4, Xiaowen Yang3,4, Dehua Cheng3,4, Xiurong Li3,4, Wenbin He3,4, Xiao Hu3,4, Bodi Gao3,4, Xiaomeng Zhao3,4, Qianjun Zhang1,2,3,4, Juan Du1,3,4, Jiyang Liu5, Guangxiu Lu1,2,3,4, Lin Ge1,2,3,4, Wen Li1,3,4

Duchenne/Beckermusculardystrophy(DMD/BMD)isoneofthemostcommonprogressivemusculardystrophydiseaseswithX-linkedrecessiveinheritance.Itismainlycausedbythedeletion,duplicationandpointmutationofgene.Inrarecases,itisalsocausedbythedestructionofgenebychromosomalstructuralrearrangement.Here,we report a case of Duchenne/Becker Muscular dystrophy (DMD/BMD) with typical symptoms but unknown genetic defects after MLPA and next generation sequencing tests in other hospitals. Interestingly, we findapericentric inversion of X chromosome (Chr.X: g. [31939463–31939465del; 31939466–131765063 inv; 131765064–131765067del]) in this patient. We then use the karyotyping, FISH, long-read sequencing and Sanger sequencing technologies to characterize the chromosome rearrangement. We find that this chromosomal aberration disruptboth thegene and thegene. The patient present with typical DMD symptoms such as muscle weakness, but no obvious symptoms of Paganini-Miozzo syndrome. Our results suggest that the destruction ofgene by structural rearrangement is also one of the important causes of DMD. Therefore, we suggest to provide further genetic testing for those DMD patients with unknown genetic defects through routine genetic testing. Cost-effective karyotyping and FISH should be considered firstly to identify chromosome rearrangements. Long-read sequencing followed by Sanger sequencing could be useful to locate the precise breakpoints. The genetic diagnosis of this case made it possible for reproductive intervention in the patient’s family.

DMD; structural rearrangement; karyotype; FISH; breakpoint analysis

2022-09-26;

2022-11-16;

2022-12-12

長沙市健康民生項目(遺傳性罕見病綜合防控)和湖南創(chuàng)新型省份建設專項經(jīng)費(編號：2019SK4012)資助[Supported by the Health and Livelihood Project of Changsha (Comprehensive Prevention and Control of Inherited Rare Disorders) and Hunan Innovative Province Construction Special Fund (No. 2019SK4012)]

胡浩，副主任醫(yī)師，研究方向：遺傳病的診斷、產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學檢測，遺傳咨詢。E-mail: leonhu97@126.com

李汶，副研究員，研究方向：遺傳病的診斷及疾病機理研究，遺傳咨詢。E-mail: liwen1968@csu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-179

(責任編委: 盧大儒)