馬郁蘭精油對大鼠力竭游泳導致的運動性疲勞不具有改善作用

張 偉,周嘉恒,胡 揚,蔡文泳，李慶喆,楊紅燕,張衍鵬，董 玲

(1空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系飛行人員療養(yǎng)與康復教研室，陜西 西安 710032；2西北大學生命科學學院組織工程實驗室，陜西 西安 710069； 3中國人民解放軍第94521部隊，山東 淄博 255399)

軍事訓練是部隊士兵在和平時期的主要任務，高強度、長時間的負荷訓練極容易導致士兵產生運動性疲勞。疲勞狀態(tài)會影響人體功能及思維判斷，極易導致軍事訓練傷的發(fā)生，降低部隊的作戰(zhàn)能力[1]。軍事訓練傷的發(fā)生不僅降低訓練效率，還可能造成官兵的心理和生理問題[2]。運動性疲勞是機體生理不能維持其機能在特定水平上或不能維持預定的強度[3]。研究表明，運動性疲勞會導致內分泌系統功能障礙、免疫力下降、失眠、抑郁等不利的生理反應[4-5]。此外，士兵訓練期間的長時間劇烈運動會導致心臟運動性疲勞[6]。因此，緩解訓練導致的運動性疲勞，促進官兵身體各項機能的恢復，以提高訓練效果和戰(zhàn)斗力、減少軍事訓練傷的發(fā)生具有重要意義。目前，有冷療、溫水浴、營養(yǎng)補償、按摩和藥物等治療方法[7-8]。但由于現有的運動性疲勞恢復方法有著器材價格高昂、使用時間及劑量難確定等局限，因此尋求便捷、有效的手段一直被廣大官兵和運動生理學家所重視。

芳香精油是指用有機溶劑萃取、機械壓榨或蒸餾的方法從芳香植物的根、莖、葉、花、果和種子中獲取具有芳香氣味的精油。運用香熏、按摩和沐浴等方法可使精油通過嗅吸和滲透皮膚的途徑作用于人體，從而對人在生理和心理上進行調整。馬郁蘭為唇形科牛至屬多年生草本植物，其野生資源在我國十分豐富，可用于食品、藥用、化妝品等方面。馬郁蘭精油可消除肌肉疼痛、促進血液循環(huán)和舒緩焦慮、壓力，具有消除身心疲勞的作用[9]。然而關于馬郁蘭精油對運動性疲勞影響的相關研究未見報道。因此，本研究采用負重強迫游泳運動誘導大鼠運動性疲勞模型，給予大鼠游泳運動前霧化吸入馬郁蘭精油，探究馬郁蘭精油是否具有緩解運動性疲勞的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗采用6周齡SD雄性大鼠60只，體質量170～210 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。適應性飼養(yǎng)3 d后，大鼠游泳學習3 d，20 min/d。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析 將馬郁蘭精油(多特瑞商貿有限公司，上海)送往南京大學現代分析中心檢測成分及含量。馬郁蘭精油經GC-MS聯用儀(QP-2020，日本島津公司)進行定性定量分析。氣相色譜條件：DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫(初始柱溫為60 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升至280 ℃)；載氣為氦氣，載氣流速為1.0 mL/min；分流比為80∶1；進樣體積0.2 μL。質譜條件：電離方式為電子電離，電離能量70 eV，離子源溫度為220 ℃，質量掃描范圍(m/z)為20～500。根據GC峰面積用歸一化計算精油中各成分的百分比。采用NIST2017譜庫檢索、標準品比對，并結合保留指數等手段進行定性分析。

1.2.2 大鼠吸入馬郁蘭精油劑量的測定 參照參考文獻 [10] 確定評估SD大鼠吸入霧化馬郁蘭精油的最適劑量。使用壓縮空氣式霧化器(403M，江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司)以壓縮泵產生壓縮空氣為驅動使馬郁蘭精油霧化。為評估大鼠馬郁蘭精油的耐受劑量范圍，采用隨機數表法將它們分為以下實驗組并吸入不同劑量霧化馬郁蘭精油：對照組(0 μL/h)和4組梯度劑量組(劑量分別為4、40、400、4 000 μL/h，每組8只大鼠)。將同組大鼠置于獨立通風動物籠盒(BCR-RI01-PEI，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，450 mm×275 mm×234 mm)。按分組通入不同劑量霧化精油15 min后進行負重游泳運動，觀察每只大鼠游泳動作并記錄每只大鼠游泳力竭時間用以評估精油的最適劑量。

1.2.3 負重游泳實驗和劑量測定 采用負重游泳的方式測量大鼠力竭時間[10]。各組動物均采用尾部縛鉛球砝碼(約大鼠體質量的5%)的方法負重，負重后大鼠在高65 cm、直徑50 cm的圓形塑料桶中自由游泳，靜水深40 cm，水溫(34.0±2.0)℃。大鼠游泳力竭后立即撈出。大鼠力竭游泳的判斷標準為：大鼠在水中運動協調性下降且水淹沒大鼠鼻尖至大鼠再次浮出水面超過10 s[11]。對照組和4組梯度劑量組大鼠游泳力竭時間分別為(10.32±1.42)、(22.57±5.96)、(14.69±2.36)、(12.31±1.91)和(6.33±0.74)min。40、400、4 000 μL/h劑量組的游泳力竭時間較對照組無顯著差異(P>0.05)，4 μL/h劑量組的力竭時間顯著高于對照組(P<0.05)?；谝陨辖Y果，本實驗選擇低劑量(4 μL/h)開展后續(xù)研究。

1.2.4 大鼠運動性疲勞模型的建立 采用連續(xù)負重強迫SD大鼠游泳2周建立運動性疲勞模型[11]。使用隨機區(qū)組法將SD大鼠分為負重強迫游泳(weight-loaded forced swimming test, WL-FST)組和負重強迫游泳+馬郁蘭精油處理(weight-loaded forced swimming test+marjoram essential oil，WL-FST+MEO)組，每組10只大鼠。分別給予WL-FST組每日負重3%游泳90 min，游泳前吸入15 min霧化生理鹽水；WL-FST+MEO組每日進行負重3%游泳90 min，游泳前吸入15 min霧化馬郁蘭精油(4 μL/h)處理。

1.2.5 抓力、血壓、力竭運動時間測試和行為學實驗

1.2.5.1 抓力測試 使用小動物抓力計(ZS-ZL，北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)測量大鼠最大抓力。輕提大鼠尾部使大鼠身體與抓力計網面呈15°夾角，使其前爪落在網面向后拉大鼠，記錄抓力，每只大鼠測量3次，取其平均值。

1.2.5.2 血壓測試 使用智能無創(chuàng)血壓計(softron bp 2010A，北京軟隆生物科技有限公司)測量大鼠血壓。按照儀器使用說明將保溫筒預熱到39 ℃將大鼠放入鼠袋。監(jiān)測大鼠尾部血流脈沖波形穩(wěn)定后開始測量，記錄收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和心率(heart rate，HR)。

1.2.5.3 力竭運動時間測試 大鼠負重5%體質量，游泳至力竭，記錄力竭運動時間。其余操作及條件同運動性疲勞模型的建立。

1.2.5.4 行為學實驗 使用行為學視頻分析系統(JLBehv-OFG-4，上海)進行大鼠曠場的行為學檢測。大鼠置于行為學實驗室適應性訓練2 d后進行曠場實驗，曠場規(guī)格為80 cm×80 cm×50 cm，底部及四周為黑色木板。實驗時大鼠被單獨安置在曠場的一角，使其在曠場中自由探索5 min，記錄大鼠5 min內在曠場運動軌跡[12]。

1.2.6 血清生化指標檢測 大鼠游泳至力竭后，立即撈出注射30 g/L戊巴比妥麻醉(60 mg/kg)。心尖取血，室溫靜置20 min后4 ℃離心15 min(3 500 r/min)，取上清待測，于-80 ℃冰箱冷藏。葡萄糖(glucose，GLU)采用葡萄糖氧化酶法測定，游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)采用酶法測定，肌酸激酶(creatine kinase，CK)采用磷酸肌酶底物法測定，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)采用乳酸底物法測定。試劑盒采購于南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.7 電鏡實驗 取大鼠左心室室壁組織，并切成1 mm×5 mm大小,置于固定液(20 mL/L甲醛和25 mL/L戊二醛混合液)中4 ℃冰箱過夜，制作電鏡樣本備用。0.1 mol/L BP緩沖液沖洗樣本10 min；10 mL/L鋨酸浸泡90 min；再次用0.1 mol/L BP緩沖液沖洗樣本10 min；分別用500、700、800、900、950 mL/L乙醇依次脫水8 min，無水乙醇脫水25 min，丙酮脫水20 min；環(huán)氧樹脂包埋過夜；60 ℃純聚合24 h；樣品鉛鈾染色10 min，制備超薄切片；透射電子顯微鏡(JEM-1230，日本電子株式會社)掃描并拍照。

2 結果

2.1 馬郁蘭精油成分及含量

利用GC-MS對精油的揮發(fā)性化學成分進行分析鑒定，得到馬郁蘭精油色譜圖(圖1)并鑒定出56種化學成分，占精油總成分的99.97%。馬郁蘭精油中含量1%以上的成分有16種，分別為4-萜烯醇(23.98%)、水合沙比寧(14.59%)、γ-萜品烯(13.22%)、α-松油烯(8.03%)、檜烯(7.47%)、α-松油醇(3.50%)、順式水合檜烯(3.27%)、萜品油烯(3.09%)、石竹烯(2.87%)、β-水芹烯(2.77%)、順式-4-(異丙基)-1-甲基環(huán)己-2-烯-1-醇(2.51%)、月桂烯(1.85%)、乙酸芳樟酯(1.77%)、雙環(huán)-大根老鸛草烯(1.76%)、鄰傘花烴(1.39%)、(R)-(+)-苧烯(1.34%)，占精油總成分的93.41%。

圖1 馬郁蘭精油的總離子流色譜圖

2.2 馬郁蘭精油降低運動性疲勞大鼠血壓和HR，并縮短力竭游泳時間

實驗結果顯示，WL-FST+MEO組大鼠與WL-FST組相比，DBP和HR顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖2)，提示馬郁蘭精油具有降低血壓和HR的作用；兩組間抓力無顯著差異，提示兩組大鼠的肌肉力量水平沒有差異；吸入2周霧化馬郁蘭精油的運動性疲勞大鼠力竭游泳時間顯著下降(P<0.01，圖2)，提示馬郁蘭精油降低了運動性疲勞大鼠的運動表現。

A～C：負重游泳2周后大鼠的SBP、DBP和HR；D：負重游泳2周后大鼠的抓力；E：力竭運動后大鼠力竭時間。SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；HR：心率；WL-FST：負重強迫游泳(n=8)；WL-FST+MEO：負重強迫游泳+馬郁蘭精油處理(n=9)。 aP<0.05， bP<0.01。

2.3 馬郁蘭精油未改善大鼠運動性疲勞后血清的GLU、FFA含量及CK、LDH活力

運動性疲勞的產生機制有多種學說和理論，其中衰竭學說認為在運動過程中體內能源物質大量消耗導致能量短缺，從而造成肌肉不能維持工作強度。此外，堵塞學說認為運動時機體能量代謝增強，造成乳酸、酮體等代謝物質在體內堆積，導致肌肉等組織功能下降。本實驗中血清測試結果顯示，游泳力竭后兩組大鼠血清中GLU、FFA含量及CK、LDH活力均無顯著統計學差異(圖3)。提示馬郁蘭精油對大鼠運動能力的影響與能量物質消耗和代謝物質堆積無明顯相關性。

A：GLU含量；B：FFA含量；C：CK活力；D：LDH活力。GLU：葡萄糖；FFA：游離脂肪酸；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶；WL-FST：負重強迫游泳；WL-FST+MEO：負重強迫游泳+馬郁蘭精油處理。n=6。

2.4 馬郁蘭精油增加疲勞大鼠的焦慮樣行為

曠場實驗是檢測嚙齒類動物自主活動度的一種重要手段，主要通過受試動物在曠場中的活動量來評價動物對外界的認知能力、興奮性和抑郁等[13]。曠場實驗結果顯示，與WL-FST組相比，WL-FST+MEO組大鼠在曠場中移動的總距離、中央區(qū)域移動速度、平均移動速度和邊緣移動總距離均無顯著性差異，但中央區(qū)域移動距離和滯留時間顯著降低(P<0.05，圖4)。

2.5 馬郁蘭精油不能改善運動性疲勞大鼠心肌細胞結構的損傷

透射電鏡掃描結果顯示，兩組大鼠心肌細胞的線粒體中均出現嵴間隙增寬、斷裂或溶解呈空泡狀，部分線粒體分布散亂的現象。與WL-FST組相比，WL-FST+MEO組中心肌細胞損傷更嚴重(圖5)。

A：曠場實驗軌跡圖；B：曠場實驗總移動距離；C：曠場實驗平均移動速度；D：曠場中央區(qū)域移動距離；E：曠場中央區(qū)域平均移動速度；F：曠場中央區(qū)域滯留時間；G：曠場周邊區(qū)域移動距離。WL-FST：負重強迫游泳(n=8)；WL-FST+MEO：負重強迫游泳+馬郁蘭精油處理(n=9)。 aP<0.05， bP<0.01。

WL-FST：負重強迫游泳；WL-FST+MEO：負重強迫游泳+馬郁蘭精油處理。n=3，標尺為1 μm，×15 000。

3 討論

軍事訓練中高強度劇烈運動引起的疲勞與機體運動能力降低密切相關，過量運動甚至導致各種運動疲勞、損傷甚至疾病。因此，探究消除高強度、高負荷、長時間軍事訓練帶給士兵的負面影響，尋找抗運動性疲勞的療法變得越來越重要。芳香療法是用于恢復健康的一種常見的補充治療方法，是指利用按摩、沐浴、熏香和食用的方式將從芳香植物中提取的精油通過皮膚、呼吸道或消化道輸送到體內，使人在生理和心理方面獲得療效[14-15]。其中，KWON等[16]研究結果表明，與沒有接受任何治療的人相比，接受芳香精油的鍛煉者的效果更好，芳香精油在運動中誘導了積極的情緒，減少了運動中的疲勞，并改善了參與者在恢復期的感覺，香氣對鍛煉者的感覺有重要影響，它可以積極地影響鍛煉的滿意度和持久性。國內有研究[17]表明，馬郁蘭精油含有多酚類、生物堿類、皂苷類、萜類等多種抗氧化成分，具有良好的抗氧化活性且抗氧化活性隨著濃度增加而增大，其抗氧化機制主要包含清除自由基、抑制自由基生成和激活抗氧化體系等。

在高強度耐力運動中，肝糖原被分解代謝成GLU釋放到血液中為肌肉提供能量，如果血液中GLU含量低會導致疲勞[18]。脂肪分解導致脂質代謝成FFA，從而增加其作為能源的利用率。血液中GLU和FFA含量可以作為高強度耐力訓練能力的指標。本研究結果表明，游泳后各組的GLU和FFA含量無顯著性差異，提示馬郁蘭精油降低大鼠運動表現與碳水化合物關系不密切。血漿中CK的主要功能是支持產生運動所需的能量，而LDH催化丙酮酸轉化為乳酸。高強度負重運動可以顯著增加CK和LDH活性，從而降低運動表現[10]。本研究結果表明，兩組大鼠血清中的CK和LDH活性無顯著差異，提示馬郁蘭精油降低大鼠運動表現與CK和LDH的代謝無關。本研究中吸入2周霧化馬郁蘭精油的運動性疲勞大鼠在曠場中的中央區(qū)域移動距離和滯留時間顯著下降，提示吸入馬郁蘭精油加劇大鼠焦慮樣行為。有研究表明過度訓練對心臟的損傷會隨著疲勞程度加深，且過度疲勞誘導心肌細胞凋亡、心肌細胞核形態(tài)結構異常[19]。心臟電鏡掃描結果顯示，與WL-FST組相比，WL-FST+MEO組大鼠心肌細胞線粒體中出現嵴間隙增寬、斷裂或溶解呈空泡狀的表征更明顯，提示兩組大鼠心肌細胞都有損傷且WL-FST+MEO組大鼠心肌細胞受損更嚴重，馬郁蘭精油對運動性疲勞大鼠的心肌細胞損傷無改善作用。

在本實驗中，精油對動物的作用可能與人存在差異，需要進一步研究馬郁蘭精油對人體的影響。研究表明，目前我軍各兵種軍事訓練傷的發(fā)生以過度疲勞和急性損傷為主[20]。大鼠游泳疲勞模型是目前國內外有關疲勞研究的動物模型之一。本研究所用的動物模型能部分模擬常規(guī)狀態(tài)下軍事訓練導致的運動性疲勞，但不能模擬特殊環(huán)境且負荷較大的軍事訓練造成的疲勞，如飛行、核潛艇、航母等任務中超負荷作業(yè)、睡眠剝奪和長期精神壓力等因素所致的疲勞[1,21]。綜上所述，霧化吸入馬郁蘭精油(4 μL/h，15 min/d，持續(xù)2周)后大鼠力竭游泳時間減少、曠場中央區(qū)域運動總距離和滯留時間縮短并且心肌結構中線粒體嵴間隙增寬、嵴斷裂或溶解呈空泡狀的損傷現象更明顯。本實驗結果提示，馬郁蘭精油有降低血壓和HR的作用，但是不能消除運動性疲勞，使用馬郁蘭會增加運動性疲勞大鼠的焦慮樣行為并加劇運動性疲勞所致的心臟損害。