三甲胺柱[5]芳烴的合成及其抑菌性能

吳惠香，楊 華，趙登奇，黃建穎，楊利軍

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

在食品工業(yè)中，由于細(xì)菌會(huì)在食品、管道、空氣和其他食物接觸物的表面或內(nèi)部大量生長(zhǎng)繁殖[1]，即使使用現(xiàn)代食品保存技術(shù)，微生物腐敗也會(huì)導(dǎo)致過多的食品劣變。由金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）引起的食品污染即使在發(fā)達(dá)國家也非常普遍。從農(nóng)場(chǎng)到餐桌這一連續(xù)過程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能導(dǎo)致細(xì)菌污染的發(fā)生，并最終引起食源性疾病[2]。迄今，食源性疾病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[3]，并且可以造成全球范圍內(nèi)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為防止食品污染造成食源性疾病的暴發(fā)，定期對(duì)食品加工設(shè)備進(jìn)行清洗和消毒是一項(xiàng)非常重要的步驟。然而，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致傳統(tǒng)的抑菌劑和殺菌劑（如抗生素和一些納米材料）的抑菌、殺菌效果逐漸降低，迫切需要不斷研發(fā)新型抑菌和殺菌劑[4-7]。

柱芳烴（圖1）是一類具有相對(duì)較大空腔和對(duì)稱柱狀結(jié)構(gòu)的新型超分子化合物。根據(jù)柱芳烴形成單元數(shù)目的不同可分為柱[n]芳烴（n＝5,6,7,8,9,10…），因其富π-電子空腔和雙環(huán)上氧原子的冠醚狀排列而具有獨(dú)特的主客體性質(zhì)[8]。目前柱[5]芳烴已被較多用于構(gòu)建超分子聚合物、互鎖分子和生物分子雜化材料[9-10]?；谥紵N的應(yīng)用研究已覆蓋吸附材料[11]、離子檢測(cè)[12]、氨基酸識(shí)別和蛋白質(zhì)吸附[13]、藥物可控釋放、癌癥治療[14]、催化[15]、光治療[16]、細(xì)胞膠水[17]等領(lǐng)域。

圖1 柱[5]芳烴的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of pillar[5]arene

柱芳烴的生物活性近幾年才初步得到揭示[18-19]，其獨(dú)特結(jié)構(gòu)在不同領(lǐng)域的功能組裝體方面還具有很大的開發(fā)潛力。例如，季銨鹽和咪唑基團(tuán)不同脂肪鏈的陽離子柱[5]芳烴[20-21]、帶有肽鏈的支柱[5]芳烴[22]和基于兩性離子柱[5]芳烴的帶正電納米聚集體[23]等陸續(xù)被報(bào)道具有較好的抑菌和抑制生物被膜活性。因此，本實(shí)驗(yàn)在溴代柱[5]芳烴上引入季銨鹽基團(tuán)，得到水溶性陰離子為溴離子的柱[5]芳烴鹽，并以S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α菌株為供試菌，研究三甲胺柱[5]芳烴的抑菌性能；利用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）法測(cè)定其細(xì)胞毒性，旨在為開發(fā)新型有效無毒的抑菌劑提供更多的可能性和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

S.aureusATCC 6538 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；E.coliDH5α 日本Takara公司。

HeLa細(xì)胞、MCF7細(xì)胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫。

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基 上海麥克林生物化學(xué)有限公司；青霉素/鏈霉素、結(jié)晶紫及其他常用試劑 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶（酶活力≥2500 U/mg） 美國Gibco公司；MTT 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANCE III 500 NMR超導(dǎo)核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國Bruker公司；H-7650型透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 三甲胺柱[5]芳烴的合成及表征

參考Joseph等[20-21]的方法并稍作修改，合成路線如圖2所示。將9.910 g對(duì)苯二酚二羥乙基醚和31.500 g三苯基膦加入以乙腈（250 mL）作為溶劑的反應(yīng)瓶中，隨后在0 ℃下邊攪拌邊緩慢加入39.800 g四溴化碳。待固體完全溶解，在室溫下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冷水（500 mL）中有白色固體析出；通過抽濾得到固體，并用體積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶液（100 mL）沖洗固體。將粗產(chǎn)品用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，析出固體后抽濾干燥得到產(chǎn)物1（產(chǎn)量10.360 g、產(chǎn)率64.3%）。

圖2 三甲胺柱[5]芳烴的合成路線Fig.2 Synthesis route of pillar[5]arene based on trimethylamine

將3.240 g化合物1（10 mmol）加入以1,2-二氯乙烷（130 mL）為溶劑的反應(yīng)瓶中，完全溶解后加入0.570 g多聚甲醛（19 mmol）和2.4 mL三氟化硼乙醚（19 mmol），室溫反應(yīng)10～30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入水淬滅，分液漏斗分液，取下層有機(jī)相用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥；通過真空蒸餾獲得粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用二氯甲烷-石油醚（1∶2，V/V）進(jìn)行柱色譜分離，得到白色固體為化合物2（產(chǎn)量1.04 g、產(chǎn)率30.4%），即溴代柱[5]芳烴。

將0.168 g化合物2加入以無水乙醇（100 mL）為溶劑的反應(yīng)瓶中，再加入4 mL三甲胺（15 mmol），90 ℃下回流反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到白色固體為化合物3，即三甲胺柱[5]芳烴（產(chǎn)量0.250 g、產(chǎn)率78.1%）。

采用1H NMR對(duì)合成的各化合物進(jìn)行表征，測(cè)定溫度為室溫，其中化合物1和2以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，化合物3以重水（D2O）為溶劑；同時(shí)采用高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectra，HRMS）對(duì)化合物3進(jìn)行表征，電噴霧電離離子源。

1.3.2 三甲胺柱[5]芳烴的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定

參考Sun Zhimin[24]和Liu Yuhong[25]等的方法并稍作修改，S.aureusATCC 6538培養(yǎng)于含40%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甘油、1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）葡萄糖的胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中；E.coliDH5α培養(yǎng)于含40%甘油、1%葡萄糖的LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中，并保藏于－80 ℃冰箱中，使用前活化兩次，放置在振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h；對(duì)活化好的菌株按照平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，調(diào)整培養(yǎng)基中菌株濃度約為1h 106CFU/mL，置于4 ℃冰箱貯藏備用。

采用微量肉湯法測(cè)定最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC），使用96 孔板通過梯度稀釋法配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液。吸取100 μL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于96 孔板中，加入1h 106CFU/mL菌液使每孔菌株接種密度為5h 105CFU/mL，三甲胺柱[5]芳烴終質(zhì)量濃度依次為0.008～2.000 mg/mL。以等體積不含菌液的培養(yǎng)基無菌水溶液為空白對(duì)照，等體積含菌液的培養(yǎng)基和無菌水為陰性對(duì)照；金黃色葡萄球菌以甲氧西林為陽性對(duì)照，大腸桿菌以多黏菌素B為陽性對(duì)照。將96 孔板在37 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。MIC為完全抑制微生物生長(zhǎng)的最低濃度。

從MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)無明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的孔中吸取100 μL溶液涂布于含0.6%酵母浸粉的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后觀察平板菌落生長(zhǎng)情況。三甲胺柱[5]芳烴最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）為培養(yǎng)24 h后細(xì)菌平板無菌落生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的最小濃度。

1.3.3 生物被膜形成實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[20]的方法，按體積分?jǐn)?shù)1%將測(cè)試菌株過夜培養(yǎng)物添加到含1%葡萄糖的新鮮LB培養(yǎng)基中，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋至5h 105CFU/mL。將100 μL菌液和100 μL不同終質(zhì)量濃度待測(cè)化合物溶液添加到96 孔板每孔中，37 ℃下不攪拌孵育24 h。孵育結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌孔，去除浮游細(xì)菌。剩余的細(xì)菌在室溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%結(jié)晶紫溶液染色15 min后再次用PBS洗滌，將微孔板倒置并在紙巾上輕輕拍打以除去多余液體，風(fēng)干，加入200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，最后在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔OD值。以不加待測(cè)化合物為對(duì)照組，按式（1）計(jì)算生物被膜形成量。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞膜損傷情況

參照文獻(xiàn)[26]的方法并稍作修改。將細(xì)菌過夜培養(yǎng)至108～109CFU/mL，反復(fù)離心（4 ℃、5000 r/min，5 min）收集細(xì)菌于管底，直到肉眼可見米粒大小沉淀，加1 mL質(zhì)量濃度為MIC的抑菌劑三甲胺柱[5]芳烴于離心管中，以不加抑菌劑為對(duì)照組，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定，漂洗后用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定1 h，用體積分?jǐn)?shù)30%～80%乙醇溶液依次脫水后，再用體積分?jǐn)?shù)90%丙酮溶液和無水丙酮繼續(xù)脫水，用丙酮與包埋劑Spurr混合溶液（1∶2，V/V）處理樣品1 h，再使用此包埋劑與3 倍體積的丙酮混合，處理樣品3 h，最后用純包埋劑處理，室溫下過夜后，切片、染色，最后用TEM對(duì)切片進(jìn)行觀察并保存圖片。

1.3.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過MTT測(cè)定法評(píng)估柱[5]芳烴的細(xì)胞毒性[27]。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，HeLa細(xì)胞和MCF7細(xì)胞在含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)為單層并融合時(shí)，加入1.5 mL胰蛋白酶溶液（0.5 g/100 mL，PBS配制）孵育5 min，離心（500hg、10 min），收集細(xì)胞，棄去上清液。加入3.00 mL血清補(bǔ)充培養(yǎng)基以中和殘留的胰蛋白酶，并將細(xì)胞以1.00h 104cells/mL重懸于血清補(bǔ)充培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)15 h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。棄原培養(yǎng)基，然后用不含或含不同質(zhì)量濃度柱[5]芳烴的新鮮血清補(bǔ)充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h或12 h，然后每孔加入20 μL 0.50 mg/mL MTT溶液，37 ℃下培養(yǎng)4 h后，移除MTT溶液，并用PBS洗滌細(xì)胞3 次。添加100 μL二甲基亞砜溶解甲瓚晶體，并通過酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。以未處理細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞活力按式（2）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0軟件作圖，采用單因素方差分析，通過Duncan’s test法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三甲胺柱[5]芳烴的表征結(jié)果

各化合物的結(jié)構(gòu)如圖3、4所示，以苯二酚二羥乙基醚為原料，通過簡(jiǎn)單常規(guī)的有機(jī)反應(yīng)合成溴代柱[5]芳烴（化合物2），隨后在無水、無氧、室溫條件下與三甲胺反應(yīng)，得到三甲胺柱[5]芳烴（化合物3）。

圖3 化合物1（A）、2（B）和3（C）的1H NMR譜Fig.3 1H NMR spectra of compounds 1 (A),2 (B) and 3 (C)

化合物1結(jié)構(gòu)的表征結(jié)果為：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.86（s，4H）、4.24（t，J＝6.3 Hz，4H）、3.61（t，J＝6.3 Hz，4H）；化合物2結(jié)構(gòu)的表征結(jié)果為：1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ6.91（s，10H）、4.23（t，J＝5.6 Hz，20H）、3.84（s，10H）、3.63（t，J＝5.6 Hz，20H）；化合物3結(jié)構(gòu)的表征結(jié)果為：1H NMR（500 MHz，D2O）：δ6.92（s，10H）、4.42（s，20H）、3.90（s，10H）、3.77（s，20H）、3.19（s，90H）?；衔?的HRMS表征結(jié)果為：m/z1055.7550（[M－2Br]2＋），相對(duì)分子質(zhì)量2271.2350。

圖4 化合物3的HRMS圖Fig.4 HRMS spectra of compound 3

2.2 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureus ATCC 6538和E.coli DH5α的MIC和MBC

添加不同質(zhì)量濃度三甲胺柱[5]芳烴、甲氧西林和多黏菌素B培養(yǎng)S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α 24 h后，經(jīng)肉眼觀察到澄清孔的試劑濃度即為MIC（圖5、6），進(jìn)一步通過測(cè)定OD值評(píng)估三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α的MIC（圖7），MBC測(cè)定平板涂布結(jié)果如圖8、9所示。由表1可知，三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureusATCC 6538的MIC和MBC分別為0.125 mg/mL和1.000 mg/mL，對(duì)E.coliDH5α的MIC和MBC分別為和0.250 mg/mL和＞1.000 mg/mL。結(jié)果表明三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureusATCC 6538抑菌效果優(yōu)于E.coliDH5α，三甲胺柱[5]芳烴對(duì)E.coliDH5α的MIC是S.aureusATCC 6538的2 倍。

圖5 不同質(zhì)量濃度三甲胺柱[5]芳烴培養(yǎng)S.aureus ATCC 6538（A）和E.coli DH5α（B）24 h后96 孔板結(jié)果圖像Fig.5 Pictures of S.aureus ATCC 6538 (A) and E.coli DH5α (B)cultured on 96-well plate in the presence of trimethylamine-based pillar[5]arene at different concentrations for 24 h

圖6 不同質(zhì)量濃度甲氧西林培養(yǎng)S.aureus ATCC 6538（A）和多黏菌素B培養(yǎng)E.coli DH5α（B）24 h后96 孔板圖像Fig.6 Pictures of S.aureus ATCC 6538 cultured in the presence of methicillin and E.coli DH5α cultured in in the presence of polymyxin B at different concentrations for 24 h on 96-well plate

圖7 濁度法分析三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureus ATCC 6538和E.coli DH5α的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of trimethylamine-based pillar[5]arene on the growth of S.aureus ATCC 6538 and E.coli DH5α evaluated by turbidity method

圖8 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureus ATCC 6538（A）和E.coli DH5α（B）的抑制作用Fig.8 Antibacterial effect of trimethylamine-based pillar[5]arene against S.aureus ATCC 6538 (A) and E.coli DH5α (B)

圖9 甲氧西林對(duì)S.aureus ATCC 6538（A）和多黏菌素B對(duì)E.coli DH5α（B）的抑制作用Fig.9 Antibacterial effect of methicilin against S.aureus ATCC 6538 (A)and polymyxin B against E.coli DH5α (B)

表1 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureus ATCC 6538和E.coli DH5α的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of trimethylamine-based pillar[5]arene against S.aureus ATCC 6538 and E.coli DH5α mg/mL

2.3 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)生物被膜形成的抑制作用

如圖10A所示，隨三甲胺柱[5]芳烴質(zhì)量濃度的增加，S.aureusATCC 6538生物被膜形成量不斷降低。從結(jié)晶紫染色圖中也可以明顯看出，在0.125 mg/mL三甲胺柱[5]芳烴作用下，S.aureusATCC 6538生物被膜形成量為31.15%。如圖10B所示，隨三甲胺柱[5]芳烴質(zhì)量濃度的增加，E.coliDH5α生物被膜形成量也不斷減少，呈一定質(zhì)量濃度依賴性。總體而言，三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureusATCC 6538生物被膜形成的抑制作用優(yōu)于對(duì)E.coliDH5α。

圖10 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)S.aureus ATCC 6538（A）和E.coli DH5α（B）生物被膜形成的影響及結(jié)晶紫染色圖Fig.10 Effect of trimethylamine-based pillar[5]arene on the formation of S.aureus ATCC 6538 (A) and E.coli DH5α (B) biofilm and results of crystal violet staining

2.4 三甲胺柱[5]芳烴對(duì)菌株細(xì)胞膜的損傷作用

如圖11所示，在不加三甲胺柱[5]芳烴的情況下，S.aureusATCC 6538具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整平滑，細(xì)胞質(zhì)厚實(shí)緊密，細(xì)胞質(zhì)中間可見一道隔膜；而當(dāng)加入三甲胺柱[5]芳烴后，S.aureusATCC 6538細(xì)胞壁和細(xì)胞膜遭到損傷，失去細(xì)胞壁和細(xì)胞膜保護(hù)的細(xì)胞質(zhì)變得松散，內(nèi)容物開始向環(huán)境中泄漏，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有孔洞出現(xiàn)。未經(jīng)三甲胺柱[5]芳烴處理的E.coliDH5α呈短桿狀，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜平滑完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)致密。E.coliDH5α細(xì)胞壁相對(duì)于S.aureus較薄，符合革蘭氏陰性菌的特點(diǎn)。此外，還可以看出E.coliDH5α細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之間有細(xì)微間隙。而經(jīng)三甲胺柱[5]芳烴處理后E.coliDH5α細(xì)胞壁、細(xì)胞膜變得模糊不清，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)發(fā)生絮狀凝結(jié)并變得疏松。同時(shí)E.coliDH5α形態(tài)也發(fā)生變化，出現(xiàn)皺縮并向內(nèi)彎曲凹陷。

圖11 三甲胺柱[5]芳烴處理處理前后S.aureus ATCC 6538（A）和E.coli DH5α（B）的TEM圖像Fig.11 TEM images of S.aureus ATCC 6538 (A) and E.coli DH5α (B)before and after treatment with trimethylamine-based pillar[5]arene

2.5 三甲胺柱[5]芳烴的細(xì)胞毒性

如圖12A所示，隨著三甲胺柱[5]芳烴質(zhì)量濃度的增加，相比于不加三甲胺柱[5]芳烴的對(duì)照組，HeLa細(xì)胞存活率下降，但細(xì)胞存活率仍保持較高水平，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，24 h后細(xì)胞存活率仍大于80%，這與Gao Lingyan等[23]研究報(bào)道結(jié)果類似。如圖12B所示，極低質(zhì)量濃度的三甲胺柱[5]芳烴略微促進(jìn)了MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能是實(shí)驗(yàn)誤差所致，也可能是細(xì)胞對(duì)三甲胺柱[5]芳烴的刺激反應(yīng)所致。在不同質(zhì)量濃度三甲胺柱[5]芳烴處理下，24 h培養(yǎng)后HeLa和MCF7細(xì)胞的存活率均比4 h培養(yǎng)后高，說明三甲胺柱[5]芳烴對(duì)這兩種細(xì)胞均無毒，細(xì)胞能夠正常存活。

圖12 不同質(zhì)量濃度三甲胺柱[5]芳烴處理對(duì)HeLa（A）和MCF7（B）細(xì)胞存活率的影響Fig.12 Cell viability of HeLa (A) and MCF7 (B) cells treated with different concentrations of trimethylamine-based pillar[5]arene after 4 and 24 h of incubation

3 討論

近年來，由于細(xì)菌病原體對(duì)常規(guī)抗菌藥物的耐藥性增加，迫切需要開發(fā)有效的新型抑菌劑和抑菌材料以控制這些細(xì)菌病原體引起的感染和腐敗。柱芳烴是除冠醚、環(huán)糊精、杯芳烴以及葫蘆脲以外的一類新型大環(huán)主體，因其獨(dú)特的柱狀結(jié)構(gòu)和在制備不同領(lǐng)域功能組裝體方面的潛力而備受關(guān)注。

本研究以二氯甲烷為溶劑，三氟化硼乙醚催化1,4-二溴乙氧基苯與多聚甲醛發(fā)生聚合反應(yīng)，經(jīng)柱層析分離純化得到溴代柱[5]芳烴，最后三甲胺與溴代柱[5]芳烴經(jīng)親核取代反應(yīng)得到陽離子水溶性柱[5]芳烴，其中陰離子為溴離子。通過NMR和HRMS對(duì)所合成物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，然后選取S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α兩種常見細(xì)菌菌株進(jìn)行抑菌性能研究。菌懸液濃度和OD值成正比，OD值越小則證明物質(zhì)的抑菌性能越強(qiáng)[24-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三甲胺柱[5]芳烴處理后，在未達(dá)到MIC時(shí)，OD值較高，96 孔板中培養(yǎng)基渾濁，表明菌株生長(zhǎng)未受到抑制并在培養(yǎng)基中大量繁殖；當(dāng)達(dá)到MIC時(shí)，液體培養(yǎng)基開始澄清，表明細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，相應(yīng)OD值則顯著降低。平板涂布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在達(dá)到MIC時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)僅被抑制，一旦給與細(xì)菌合適的生長(zhǎng)條件，細(xì)菌仍會(huì)生長(zhǎng)繁殖形成菌落。隨著三甲胺柱[5]芳烴質(zhì)量濃度增加，平板上的菌落數(shù)量也隨之下降，在達(dá)到MBC時(shí)，菌株停止生長(zhǎng)?？偟貋碚f，三甲胺柱[5]芳烴對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌，這與Joseph等[20-21]研究結(jié)果一致。

此外，在對(duì)生物被膜形成影響的實(shí)驗(yàn)中，隨著三甲胺柱[5]芳烴質(zhì)量濃度的增加，S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α生物被膜形成量逐漸減少，呈質(zhì)量濃度依賴性，并且三甲胺柱[5]芳烴對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

為了更直觀地了解抑菌劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的影響，可采用TEM進(jìn)行觀察，通過對(duì)比對(duì)照組與處理組細(xì)菌細(xì)胞膜形態(tài)差異，以及抑菌劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷情況，從而大致推斷抑菌劑的抑菌機(jī)制[28-29]。TEM觀察結(jié)果顯示，三甲胺柱[5]芳烴會(huì)影響S.aureusATCC 6538和E.coliDH5α的細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致膜穿孔、菌體裂解，使胞內(nèi)物質(zhì)大量流失而使菌體死亡。

食品防腐劑的過度添加會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致傳統(tǒng)抑菌劑的效果逐漸降低；而大多數(shù)化學(xué)合成防腐劑長(zhǎng)期食用存在潛在致病風(fēng)險(xiǎn)，加之人們對(duì)食品安全問題的日漸重視，因此研發(fā)一種新型無毒、抗菌效果好的抑菌劑非常重要。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法分析三甲胺柱[5]芳烴的生物安全性，與傳統(tǒng)方法相比，MTT法是最簡(jiǎn)便的測(cè)定細(xì)胞活力方法之一[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MIC范圍內(nèi)三甲胺柱[5]芳烴對(duì)HeLa和MCF7細(xì)胞均無毒性，具有作為新型食品防腐劑或者抑菌藥物的潛力。

本實(shí)驗(yàn)合成了水溶性三甲胺柱[5]芳烴，具有一定的抑菌效果，且毒性很低，可與其他抑菌劑復(fù)配使用，但其抑菌機(jī)制需進(jìn)一步探討。