龔丹妮 綜述 嚴(yán)晨曦 傅瑤 審校

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科 上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室,上海 200011

角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells,LSCs)位于角膜緣上皮基底層,可分化為短暫擴增細(xì)胞并遷移成為成熟的角膜上皮細(xì)胞,以維持角膜表面的完整性。先天性、創(chuàng)傷性或免疫性損傷,如熱化學(xué)燒傷、Stevens-Johnson綜合征、眼部瘢痕性類天皰瘡等可導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency,LSCD),從而導(dǎo)致反復(fù)的上皮糜爛、持續(xù)的角膜潰瘍、慢性炎癥、角膜血管化及纖維化等問題,嚴(yán)重影響患者的視覺功能及舒適感[1]。在治療單側(cè)LSCD病例中首選體外培養(yǎng)的對側(cè)健康眼LSCs移植;當(dāng)雙眼受影響時,可使用同種異體角膜緣組織。然而,鑒于長期免疫抑制治療的需要及其可能產(chǎn)生的不良反應(yīng),需考慮使用非角膜緣源性自體上皮組織。在過去的十多年中,體外構(gòu)建培養(yǎng)的自體口腔黏膜上皮細(xì)胞(cultivated oral mucosal epithelial cells,COMECs)已成為眼表重建的重要細(xì)胞來源,并被廣泛證明具有良好的臨床效果。本文綜合近年來利用培養(yǎng)的口腔黏膜上皮移植(cultured oral mucosal epithelial transplantation,COMET)治療LSCD的研究進(jìn)展,對體外培養(yǎng)方式的關(guān)鍵影響因素及細(xì)胞片臨床移植療效進(jìn)行綜述。

1 口腔黏膜上皮的體外培養(yǎng)

1.1 培養(yǎng)載體

細(xì)胞片的成功培養(yǎng)在很大程度上依賴于載體質(zhì)量。有效載體應(yīng)具有高度的生物相容性、非炎癥性及非免疫原性,需維持角膜透明度和機械穩(wěn)定性,并能促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增生。目前,多種生物及合成載體已應(yīng)用于研究。

1.1.1羊膜 人羊膜作為生物材料,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血管生成、促上皮化等特性,是LSCD治療中應(yīng)用最廣泛的載體。在羊膜上培養(yǎng)的COMECs表現(xiàn)為復(fù)層上皮,可檢測到非角化復(fù)層上皮標(biāo)志物CK3、CK4/13,部分研究報告了上皮祖細(xì)胞標(biāo)志物p63的表達(dá),透射電鏡可見橋粒、半橋粒和緊密連接等結(jié)構(gòu),與正常角膜上皮相似[2]。目前,對于羊膜載體是否應(yīng)剝離上皮存在爭論。去上皮羊膜具有較低的免疫原性,有利于所培養(yǎng)上皮細(xì)胞的遷移和融合,且可促進(jìn)細(xì)胞分化,而完整羊膜更有利于干細(xì)胞表型的維持[3-4],二者均可成功培養(yǎng)出口腔黏膜上皮細(xì)胞片,但前者在研究中的使用更為頻繁。值得注意的是,羊膜制備方法和批次間的可變性、疾病傳播的風(fēng)險、制備的高成本等缺點均可影響培養(yǎng),因此需尋找替代的載體材料。

1.1.2纖維蛋白載體 纖維蛋白成本較低,支持上皮細(xì)胞生長,且可通過抗纖溶藥物控制降解,因此已作為載體被廣泛用于再生醫(yī)學(xué)。纖維蛋白凝膠是由凝血酶、纖維蛋白原和氯化鈣組成的止血復(fù)合物,可抑制纖維化、組織壞死及炎癥。在體內(nèi),凝膠可被完全吸收,有利于細(xì)胞片的直接移植,且可減少移植后新生血管的形成。Sheth等[5]的研究表明,在纖維蛋白凝膠上培養(yǎng)的COMECs可形成復(fù)層上皮,細(xì)胞片表達(dá)CK3、CK4/13,且高表達(dá)p63。Hirayama等[6]在培養(yǎng)過程中通過添加抑肽酶等蛋白酶抑制劑來防止纖維蛋白降解,并在培養(yǎng)完成后利用纖維蛋白的可降解性分離得到無載體細(xì)胞片。纖維蛋白已取得良好的臨床效果,但存在一定的安全問題,如術(shù)后的病毒傳播風(fēng)險。

1.1.3膠原蛋白載體 人角膜的主要成分是膠原,而膠原蛋白具有天然的生物相容性和低免疫原性,可作為上皮細(xì)胞擴增的載體。Ilmarinen等[1]將Ⅳ型膠原蛋白應(yīng)用于COMECs的培養(yǎng),在無血清和3T3飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下,在Ⅳ型膠原涂層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)出了復(fù)層上皮,結(jié)果顯示CK3/12、CK4/13呈陽性,基底層細(xì)胞表達(dá)增生標(biāo)記Ki67和祖細(xì)胞標(biāo)記p63;此外,培養(yǎng)物顯示緊密連接蛋白ZO-1和occludin陽性以及高跨上皮電阻值,表明其具有良好的屏障功能。Petsch等[7]分析了非交聯(lián)和紫外線/核黃素交聯(lián)Ⅰ型膠原膜用于角膜表面重建的適宜性和生物相容性,實驗證明膠原膜適合作為COMECs生長載體,且在體內(nèi)顯示出高度的生物相容性,為COMET提供了新方案。

1.1.4溫敏性培養(yǎng)皿 所有人或動物來源的載體,包括纖維蛋白和膠原蛋白,都有可能造成感染,而溫敏性培養(yǎng)皿可避免此問題。培養(yǎng)皿表面共價偶聯(lián)的溫度敏感性聚合物,可隨溫度變化在親水與疏水狀態(tài)間轉(zhuǎn)換,使細(xì)胞片自發(fā)從皿底分離。獲取的COMECs細(xì)胞片基底側(cè)細(xì)胞間連接及細(xì)胞外基質(zhì)完整,可增強與受體角膜表面的黏附。研究表明,培養(yǎng)的COMECs高表達(dá)E-鈣黏蛋白,有利于促進(jìn)細(xì)胞黏附并形成眼表的保護(hù)性屏障[8]。移植到重度LSCD兔模型角膜的COMECs可促進(jìn)角膜表面的上皮化,同時可減少病變角膜的血管化和纖維化[9]。此外,COMECs在LSCD患者的臨床治療中也取得了良好的療效[10]。

1.1.5接觸鏡 作為合成支架,接觸鏡在上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)移中具有實用性。Bj?rkblom等[11]首次將接觸鏡用于COMECs的培養(yǎng),細(xì)胞在培養(yǎng)3 d后存活率高,可見融合的鵝卵石樣形態(tài),且p63、ABCG2表達(dá)呈陽性。Zsebik等[12]實現(xiàn)了在無動物源性材料和飼養(yǎng)層條件下人口腔黏膜組織塊在接觸鏡上的培養(yǎng),同樣得到了理想的細(xì)胞片。接觸鏡培養(yǎng)得到的復(fù)層上皮有利于增強對感染的抵抗力,并具有較高的機械強度來耐受手術(shù)中的各項操作。由于細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裸露角膜后還需重新排列,當(dāng)前對于最佳的細(xì)胞培養(yǎng)層數(shù)尚未達(dá)成共識。

1.1.6新型培養(yǎng)載體 隨著研究的進(jìn)展,許多新型載體在COMECs的培養(yǎng)中得到了研究。Wang等[13]以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal stroma,APCS)為載體培養(yǎng)了功能性COMECs,細(xì)胞片表達(dá)上皮細(xì)胞及干細(xì)胞標(biāo)記,且APCS移植有望成為深層角膜病變行板層角膜移植的良好替代品。以離體角膜為載體進(jìn)行口腔黏膜上皮片的移植培養(yǎng),結(jié)果表明上皮細(xì)胞可向角膜表面遷移生長,從而實現(xiàn)角膜的再上皮化[14-15]。Irani等[16]使用多孔硅膜裝載COMECs重建干細(xì)胞龕,多孔硅膜具有生物相容性,可通過表面修飾來促進(jìn)降解和細(xì)胞附著,并且可以裝載蛋白質(zhì)和生長因子。多孔硅支架上擴增得到的COMECs形態(tài)及表型良好,并可成功移植至活體大鼠眼內(nèi)。Yazdani等[17]則對透明質(zhì)酸水凝膠支架進(jìn)行了優(yōu)化,通過Ⅳ型膠原涂層促進(jìn)干細(xì)胞附著,培養(yǎng)得到的COMECs細(xì)胞片可用于眼表重建。新型培養(yǎng)載體為COMECs的培養(yǎng)提供了新的方式與研究思路,但仍需進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗以證明其可行性。

1.2 培養(yǎng)條件

除培養(yǎng)載體外,能提供適宜生長因子的培養(yǎng)條件也十分重要。COMECs標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件通常需要小鼠來源3T3飼養(yǎng)層和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),但為了避免污染,無動物源性成分的培養(yǎng)條件也得到了大量研究。

1.2.1飼養(yǎng)層 3T3飼養(yǎng)層可促進(jìn)表皮干細(xì)胞的長期存活和連續(xù)擴增,因此廣泛應(yīng)用于COMECs的培養(yǎng)?？紤]到動物源性感染或未知病原體的傳播風(fēng)險,各種人類來源飼養(yǎng)細(xì)胞,如真皮成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和結(jié)膜成纖維細(xì)胞,已作為替代細(xì)胞應(yīng)用至研究中。最新的研究表明,人角膜緣龕細(xì)胞(limbal niche cells,LNCs)也是一種優(yōu)良的飼養(yǎng)細(xì)胞。作為角膜緣龕的主要成分,LNCs具有間充質(zhì)和胚胎干細(xì)胞的表型特征,可支持LSCs的自我更新,且在兔模型中證明可有效預(yù)防LSCD[18]。與培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞相比,COMECs在3T3飼養(yǎng)層的存在下會表達(dá)更多的促血管生成因子,而LNCs可降低COMECs的血管生成潛能[19-20]。研究表明,外泌體miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是LNCs滋養(yǎng)的COMECs抑制血管生成的重要因素,其具體機制有待進(jìn)一步研究[21]。此外,大鼠LNCs可在體外誘導(dǎo)COMECs轉(zhuǎn)分化,使其形成角膜上皮樣細(xì)胞,并表達(dá)角膜特異性標(biāo)記CK12和Pax6。

1.2.2血清 除飼養(yǎng)細(xì)胞外,FBS是COMECs培養(yǎng)過程中促進(jìn)其黏附和增生的關(guān)鍵成分。使用FBS同樣具有感染的風(fēng)險,而自體血清可避免這種問題。研究表明自體血清在培養(yǎng)過程中對于上皮細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持要優(yōu)于FBS[4]。Ang等[22]發(fā)現(xiàn)添加自體血清的培養(yǎng)基能有效促進(jìn)COMECs的增生,并成功將細(xì)胞片應(yīng)用到了臨床。此外,人血小板衍生物PLTMax也已作為FBS替代物應(yīng)用于COMECs的培養(yǎng),PLTmax的添加能促進(jìn)分離細(xì)胞的黏附,取得了良好的實驗結(jié)果[23]。

1.2.3無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系 盡管飼養(yǎng)細(xì)胞和血清的使用極大促進(jìn)了上皮細(xì)胞片的研究,但微生物感染的可能性以及培養(yǎng)方案難以標(biāo)準(zhǔn)化,均阻礙了培養(yǎng)系統(tǒng)的廣泛使用,而開發(fā)無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系成為理想的選擇。Ilmarinen等[1]在不使用血清和3T3飼養(yǎng)細(xì)胞條件下,利用Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板成功培養(yǎng)了COMECs細(xì)胞片。Nakamura等[24-25]利用添加了多種生長因子的DMEM/F12和defined K-SFM混合培養(yǎng)基,培養(yǎng)出包含全克隆型干細(xì)胞的功能性COMECs,并成功移植到兔角膜表面。Dhamodarn等[26]將上皮組織置于去上皮羊膜上,在含有自體血清的人角膜上皮生長培養(yǎng)基中進(jìn)行組織塊培養(yǎng),結(jié)果顯示該方案可促進(jìn)COMECs向角膜細(xì)胞系分化。Oliva等[27]則使用添加了牛腦垂體提取物的DMEM/BEGM混合培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)COMECs融合并形成復(fù)層片狀細(xì)胞片,且形態(tài)和表型與使用血清和飼養(yǎng)層的對照組相近。由此可見,無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系具有廣闊的應(yīng)用空間,今后應(yīng)進(jìn)一步探索最適宜的COMECs標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件。

1.3 培養(yǎng)技術(shù)

除載體和培養(yǎng)條件外,培養(yǎng)中涉及到的各項技術(shù)也對上皮細(xì)胞片的質(zhì)量至關(guān)重要。良好培養(yǎng)技術(shù)的運用可減少組織的取材量,提高細(xì)胞片的機械性能,且可將細(xì)胞片保存再利用,為基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供便利。

1.3.1酶解法與組織塊培養(yǎng)法 目前,口腔黏膜上皮細(xì)胞片的培養(yǎng)主要有酶解法和組織塊培養(yǎng)法,其中酶解法的使用更為廣泛。酶解法使用單細(xì)胞懸浮技術(shù),將口腔黏膜組織用中性蛋白酶Ⅱ以及胰蛋白酶-EDTA處理成單細(xì)胞后播種于培養(yǎng)基,經(jīng)培養(yǎng)使其形成細(xì)胞片。Hsueh等[23]發(fā)現(xiàn)利用膠原酶分離細(xì)胞可保留上皮基底膜,而細(xì)胞與基底膜間的相互作用可調(diào)節(jié)細(xì)胞增生。Rovere等[28]則將膠原酶運用于細(xì)胞片與培養(yǎng)皿的分離,認(rèn)為其可提供具有足夠抗性及黏附性的COMECs。

由于細(xì)胞片的制造需要將細(xì)胞高密度播種,而大面積切除口腔黏膜組織會導(dǎo)致嚴(yán)重的口腔疼痛、不適及瘢痕。與酶解法不同,組織塊培養(yǎng)法將組織碎片接種于培養(yǎng)皿,上皮細(xì)胞從碎片邊緣遷移并增生,可產(chǎn)生足夠數(shù)量的上皮細(xì)胞,因此僅需少量供體組織即可培養(yǎng)為上皮細(xì)胞移植物應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)。Morino等[29]在角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行原代組織塊培養(yǎng),再用胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行處理后將細(xì)胞播種在溫敏性培養(yǎng)皿中,傳代后通過降溫獲取無載體細(xì)胞片。實驗表明利用組織塊培養(yǎng)法得到的細(xì)胞片與酶解法無明顯差異,而前者的高播種密度增加了細(xì)胞片的獲取成功率,并縮短了所需的培養(yǎng)時間。

1.3.2氣-液界面培養(yǎng)法 氣-液界面培養(yǎng)法是一種通過降低培養(yǎng)基高度,使細(xì)胞暴露于空氣從而促進(jìn)其分化及分層的技術(shù),可增加細(xì)胞片的機械強度。這種方法在LSCs的培養(yǎng)中得到了很好的研究,并運用于大多數(shù)的COMECs培養(yǎng)。與非氣-液界面培養(yǎng)得到的2～5層COMECs細(xì)胞片相比,氣-液界面培養(yǎng)下可獲得4～9層的復(fù)層細(xì)胞片[30]。而當(dāng)前對于此方法的應(yīng)用仍存在爭議,贊同的觀點認(rèn)為其可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增生、上皮分層并增強細(xì)胞的屏障功能,反對的觀點則認(rèn)為其可誘導(dǎo)鱗狀化生并使干細(xì)胞逐漸損失及分化[2]。因此,在使用COMECs進(jìn)行角膜再生時,氣-液界面培養(yǎng)技術(shù)的潛在優(yōu)勢是否大于劣勢還有待研究。

1.3.3凍存再培養(yǎng)技術(shù) 在LSCD治療期間,凍存技術(shù)有利于組織或細(xì)胞的保存以備再次手術(shù)的需要。Promprasit等[31]將混合了DMSO、丙二醇及FBS的DMEM作為凍存劑,通過高濃度凍存劑和高降溫速率結(jié)合的玻璃化冷凍過程來減少滲透和有毒有害影響。該研究將組織凍存2個月后復(fù)蘇再培養(yǎng),結(jié)果表明凍存組織培養(yǎng)片的干細(xì)胞和分化細(xì)胞的形態(tài)及標(biāo)志表達(dá)與新鮮組織相似,但培養(yǎng)上皮片移植的結(jié)果仍有待深入研究。Morino等[29]使用CELLBANKER1凍存培養(yǎng)基,將上皮細(xì)胞凍存3個月后復(fù)蘇,細(xì)胞存活率大于80%,將其在溫敏性培養(yǎng)皿培養(yǎng)后成功得到了細(xì)胞片。Oliva等[32]用不同凍存劑將COMECs玻璃化冷凍并保存,結(jié)果表明乙二醇和DMSO組成的溶劑會導(dǎo)致p63表達(dá)的缺失,而COMECs在液氮中凍存后形態(tài)及表型保持良好,證明其可以在液氮中長期保存。

2 口腔黏膜上皮移植的臨床應(yīng)用

臨床上雙側(cè)LSCD遠(yuǎn)比單側(cè)疾病常見,而應(yīng)用非角膜緣組織在雙側(cè)LSCD病例中進(jìn)行自體移植,可避免與同種異體移植相關(guān)的問題。在所有治療性非角膜緣細(xì)胞類型中,COMET已在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。

2.1 口腔黏膜上皮移植的優(yōu)勢

臨床上,LSCD治療成功的標(biāo)準(zhǔn)包括:穩(wěn)定透明角膜上皮的重建、角膜結(jié)膜化/血管化的消退以及持續(xù)性上皮缺損的修復(fù)。在一項比較研究中,接受同種異體培養(yǎng)角膜緣上皮移植的患眼中約一半視覺明顯改善,而接受COMET的患眼中則達(dá)68%[33]。Dobrowolski等[34]對17例無虹膜患眼行COMET并隨訪12～18個月,術(shù)后76.4%患眼有規(guī)則的透明上皮,88.2%的病例視力有所提高。Prabhasawat等[35]對COMET術(shù)后20例患者20眼平均隨訪31.9個月,75%取得了臨床成功,患者不適、結(jié)膜炎癥和纖維血管組織形成明顯減少,70%患者術(shù)后視力提高。對2004-2019年已發(fā)表病例的綜述顯示,70.8%的LSCD患眼在COMET術(shù)后可獲得穩(wěn)定的眼表[30]。2021年6月,全球首個用于LSCD治療的COMET產(chǎn)品Ocural?在日本上市,已成功應(yīng)用于臨床眼表移植且術(shù)后并發(fā)癥少[36]。由此可見,COMET是LSCD患者有效的治療方式。

針對伴有明顯角膜混濁和/或內(nèi)皮功能障礙的嚴(yán)重LSCD,通常在COMET手術(shù)恢復(fù)眼表穩(wěn)定后行穿透性角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty,PKP),以獲得更佳的角膜透明度。Baradaran-Rafii等[37]評估了化學(xué)燒傷所致的雙側(cè)LSCD患者行兩步法手術(shù)的中期療效,術(shù)后平均隨訪28.2個月,14只患眼中有13只術(shù)后眼表穩(wěn)定,無上皮缺損,無明顯新生血管形成,移植物總存活率和無排斥存活率分別為92.9%和69.2%。在另一項研究中,對1例具有10年化學(xué)燒傷病史、雙眼Roper-Hall 4級的患者行COMET及PKP系列手術(shù),成功恢復(fù)了一側(cè)眼的視功能,證明了手術(shù)方式對晚期LSCD患者視覺功能恢復(fù)的有效性[38]。

2.2 口腔黏膜上皮移植的不足

COMET治療LSCD的有效性和安全性已被基礎(chǔ)實驗和臨床試驗證明,然而仍有多種因素會導(dǎo)致移植的失敗。首先,COMET術(shù)后新生血管生成及持續(xù)性角膜上皮缺損(persistent corneal epithelial defects,PED)發(fā)生率較高。多項研究表明口腔黏膜細(xì)胞比角膜緣細(xì)胞具有更大的血管生成潛能,導(dǎo)致移植后對新生血管的抑制能力相對較弱[39]。術(shù)后PED的發(fā)生率與術(shù)前PED密切相關(guān)。有研究提出術(shù)后PED與COMECs抗氧化能力弱及黏附相關(guān)分子表達(dá)低有關(guān)[40]。COMET術(shù)后常見的并發(fā)癥為瞼球粘連,初診為瘢痕性眼表疾病的患者行再次修復(fù)手術(shù)的概率最高,而對于術(shù)前即患瞼球粘連或眼瞼異常的患者,角膜移植的風(fēng)險較高[41-42]。此外,結(jié)膜微生物菌群具有導(dǎo)致術(shù)后感染的可能,受損眼表缺乏正常結(jié)膜組織,加上免疫機制的減弱,可導(dǎo)致?lián)p傷的加劇[43]。而盡管口腔黏膜上皮與角膜緣上皮表達(dá)相似的基因標(biāo)志物,兩者的形態(tài)、功能和微環(huán)境仍存在差異。在當(dāng)前的臨床研究中,COMET后上皮細(xì)胞仍維持口唇黏膜的表型,可能會導(dǎo)致上皮增厚,視覺效果不佳[44]。

總體來說,COMET能在嚴(yán)重LSCD患者中實現(xiàn)眼表上皮的持續(xù)重建,但需注意術(shù)后并發(fā)癥的防護(hù)。術(shù)前行結(jié)膜菌群培養(yǎng)及抗感染治療,術(shù)后進(jìn)行PED和新生血管管理,術(shù)前術(shù)后及時糾正眼瞼異常,可能會進(jìn)一步提高此類手術(shù)的臨床療效。

3 展望

COMET已成為臨床領(lǐng)域治療LSCD的重要方法,但不同研究中培養(yǎng)方式的差異性以及臨床應(yīng)用中可能出現(xiàn)的移植并發(fā)癥,都對COMECs培養(yǎng)的進(jìn)一步優(yōu)化提出了要求。建立上皮細(xì)胞片培養(yǎng)、儲存、質(zhì)量評估和標(biāo)本運輸?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化體系,培養(yǎng)符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的口腔黏膜上皮細(xì)胞片,探究良好的體內(nèi)誘導(dǎo)口腔黏膜上皮轉(zhuǎn)分化方案,將有利于未來COMET臨床療效的提升。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突