成 桃，韋燕飛，劉 歡，劉 紅，鄧舒燁

（1. 廣西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧 530200；2. 廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物重點實驗室，廣西 南寧 530022）

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）為最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的高發(fā)國家［1］， 由于肝癌具有發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移早、進展快、侵襲性強等特點，早期肝癌幾乎無明顯臨床癥狀，高達80%的肝癌患者一旦確診就已經(jīng)進入中晚期，失去了根治性治療的機會［2］。肝癌細胞的高侵襲與轉(zhuǎn)移特性是肝癌之所以能夠迅速增殖、發(fā)展的關鍵，因此，迫切需要探索抑制肝癌細胞遷移和侵襲的新策略。

白花丹醌（plumbagin， PL）是從傳統(tǒng)藥用植物白花丹的根部分離得到的一種活性醌類物質(zhì)，已證實PL 具有抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性［3］。目前研究表明PL 可以抑制乳腺癌、肺癌、舌鱗狀細胞癌、腦腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［4-7］，但PL 對肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的作用研究尚不深入。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PL能在體內(nèi)抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長，還可以通過抑制腫瘤源性血管內(nèi)皮細胞的遷移和侵襲來抑制肝癌血管生成［8］，但PL 在體外對肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用尚不清楚。因此，本研究以肝癌Huh-7和LM3 細胞為研究對象 ，在體外探討PL 對人肝癌細胞遷移和侵襲的影響及其潛在作用機制，為PL用于治療肝癌提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肝癌Huh-7 、LM3 細胞均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，用含10% 胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.2藥物與試劑 白花丹醌（貨號 P7262，檢測純度≥99%）購自美國Sigma-Aldrich 公司；兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin，貨號BM4166）、兔抗N-鈣黏蛋白（N-cadherin，貨號BM3921）、兔抗信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3，貨號BM4052）、兔抗磷酸化STAT3（p-STAT3，貨號BM4835）均購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2，貨號66366-1-lg）、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，貨號60004-1-Ig）、山羊抗鼠二抗（貨號SA00001-1）、山羊抗兔二抗（貨號SA00001-2）均購于武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗非受體型酪氨酸蛋白激酶 2（JAK2，貨號BS5769）、兔抗磷酸化JAK2（p-JAK2，貨號BS4109）均購于美國Bio word公司。

1.1.3儀器 Transwell 小室（貨號3422）購于美國Corning 公司；熒光倒置顯微鏡（型號 IX71）購于日本奧林巴斯公司；Western blot 電泳儀（電源型號Power Pac TM）、Western blot 電 泳 槽（型 號Mini-PROTEAN? Tetra）均購于美國 BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1CCK-8 法檢測白花丹醌對 Huh-7 和LM3 細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的Huh-7 和LM3 細胞接種至96 孔培養(yǎng)板（5×103/孔），將96 孔培養(yǎng)板放置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度（0、1、2、4、8、10 μmol/L）白花丹醌的新鮮培養(yǎng)基培育24、48、72 h。每個濃度組設6 個復孔，同時設空白組（加入等量的培養(yǎng)基）和對照組（加入等量含0.1% DMSO 的培養(yǎng)基）。在 37 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)相應時間后，參照CCK-8 試劑盒說明書向每孔加入含10 μL CCK8 的培養(yǎng)基100 μL，放入培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1 h，采用酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光值并計算細胞增殖抑制率 。

1.2.2劃痕實驗檢測白花丹醌對Huh-7 和LM3 細胞遷移能力的影響 取適量對數(shù)生長期的Huh-7 和LM3 細胞均勻鋪于6 孔板中，并將細胞置于培養(yǎng)箱中孵育16～24 h 使其形成單層細胞。用10 μL 槍頭在單層細胞中間劃3 條平行直線，PBS 清洗。實驗組分別加入含2、4、8 μmol/L 白花丹醌的無血清培養(yǎng)基，對照組加入含有0.1%DMSO 的無血清培養(yǎng)基。每孔選取5 個固定位點進行實時監(jiān)測，分別在0、24 h 時用倒置顯微鏡進行拍照并計算細胞劃痕愈合率。

1.2.3Transwell 遷移實驗檢測白花丹醌對 Huh-7和LM3 細胞遷移能力的影響 取適量對數(shù)生長期的Huh-7 和LM3 細胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為 1×105個/mL。取100 μL 加入上室內(nèi)并加入不同濃度白花丹醌 （2、4、8 μmol/L） 干預，對照組用含有0.1%DMSO 的培養(yǎng)基處理。取750 μL 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h后用鑷子取出Transwell 小室，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min。然后用濕棉簽擦去上室內(nèi)未遷移的細胞，在顯微鏡下隨機選取5 個視野拍照并計算遷移細胞數(shù)目的平均值。

1.2.4 Transwell 侵襲實驗檢測白花丹醌對 Huh-7和LM3 細胞侵襲能力的影響 將Transwell 小室上底面均勻涂覆基質(zhì)膠并置于培養(yǎng)箱中凝固1 h。取適量對數(shù)生長期的Huh-7、LM3 細胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為 1×105個/mL。取出已經(jīng)制備好的Transwell 小室，將100 μL 無血清培養(yǎng)基加入上室內(nèi)并加入不同濃度白花丹醌 （2、4、8 μmol/ L）進行干預，對照組同樣用含有0.1%DMSO 的無血清培養(yǎng)基處理。將750 μL 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室后把Transwell 小室放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛室溫固定，0.1%結(jié)晶紫染色，然后用濕棉簽擦去上室內(nèi)未侵襲的細胞，在顯微鏡下隨機選取5 個視野拍照并計算侵襲細胞數(shù)目的平均值。

1.2.5 Western blot 實驗檢測白花丹醌對Huh-7 和LM3 細胞中蛋白表達的影響 將Huh-7、LM3 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，分別用不同濃度的白花丹醌處理細胞，將六孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用冰PBS 洗滌細胞2 次并在冰RIPA 裂解液中裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心20 min。采 用BCA 試劑盒檢測上清液中蛋白的濃度，用SDS-PAGE 凝膠電泳將樣品進行分離，之后將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用TBST 配制的5%脫脂奶粉將膜室溫封閉1 h，TBST 洗滌3 此，每次10 min。結(jié)束后與適當濃度的一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min。洗滌完成后用適當濃度的二抗室溫孵育1 h，將膜用TBST 再次洗滌，最后采用 ECL 化學發(fā)光系統(tǒng)檢測膜上的條帶，用Image J 軟件進行密度測定。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)結(jié)果均采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0. 05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞增殖的影響

與空白對照組比較，白花丹醌干預 Huh-7 和LM3 細胞 24、48、72 h 后對細胞有不同程度的抑制作用，隨著白花丹醌濃度的增大和作用時間的延長，細胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），表明白花丹醌能明顯抑制Huh-7 和LM3 細胞的增殖，并存在濃度和時間相關性。結(jié)果見圖1 和表1、2。

表1 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞增殖的影響（n=6，±s）Tab 1 The effect of different concentrations of plumbagin on the proliferation of hepatocellular carcinoma Huh-7 cells（n=6，±s）

表1 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞增殖的影響（n=6，±s）Tab 1 The effect of different concentrations of plumbagin on the proliferation of hepatocellular carcinoma Huh-7 cells（n=6，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，下表同。

組別空白對照組白花丹醌組質(zhì)量濃度（μmol/L）增殖抑制率(%)48 h 0 5.93 ± 1.98*26.39 ± 4.89**77.46 ± 0.51**79.34 ± 0.81**81.42 ± 0.38**297.3＜0.000 1 72 h 0 8.74 ± 3.23*32.28 ± 2.32**87.93 ± 3.01**91.97 ± 0.22**92.38 ± 0.12**391.4＜0.000 1 012481 0 FP 24 h 0 6.74 ± 4.36*25.04 ± 0.71**63.00 ± 2.30**67.47 ± 2.33**70.19 ± 1.58**119.0＜0.000 1

表2 不同濃度白花丹醌對肝癌 LM3 細胞增殖的影響（n=6，±s）Tab 2 The effect of different concentrations of plumbagin on the proliferation of hepatocellular carcinoma LM3 cells（n=6，±s）

表2 不同濃度白花丹醌對肝癌 LM3 細胞增殖的影響（n=6，±s）Tab 2 The effect of different concentrations of plumbagin on the proliferation of hepatocellular carcinoma LM3 cells（n=6，±s）

組別空白對照組白花丹醌組質(zhì)量濃度(μmol/L)增殖抑制率(%)012481 0 FP 24 h 0 0.61 ± 0.06 6.51 ± 6.51 10.13 ± 3.43*47.85 ± 0.63**57.62 ± 1.03**69.54＜0.000 1 48 h 0 0.51 ± 0.05 6.85 ± 1.12**14.22 ± 2.80**79.27 ± 0.11**91.85 ± 0.37**110.9＜0.000 1 72 h 0 4.35 ± 1.42*7.35 ± 1.01**23.71 ± 5.07**92.33 ± 0.15**97.47 ± 0.36**423.1＜0.000 1

圖1 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞增殖的影響Fig 1 Effects of different concentrations of plumbagin on proliferation of hepatocellular carcinoma Huh-7 and LM3 cells

2.2 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞遷移的影響

與對照組比較，不同濃度的白花丹醌能顯著抑制 Huh-7 和LM3 細胞的遷移細胞數(shù)（P＜0.01），其中8 μmol/L 組效果最為顯著，見圖 2 和表3、4；與對照組相比，白花丹醌干預組細胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且隨著白花丹醌濃度的增加細胞劃痕愈合率越低，表明白花丹醌能夠劑量依賴性地抑制 Huh-7 和LM3 細胞遷移，結(jié)果見圖2 和表3、4。

表3 不同濃度白花丹醌對Huh-7 細胞遷移的影響（n=3，±s）Tab 3 Effects of different concentrations of plumbagin on migration of Huh-7 cells （n=3，±s）

表3 不同濃度白花丹醌對Huh-7 細胞遷移的影響（n=3，±s）Tab 3 Effects of different concentrations of plumbagin on migration of Huh-7 cells （n=3，±s）

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)遷移細胞數(shù)(個)劃痕愈合率(%)空白對照組白花丹醌組0 2 4 8 FP 503.0 ± 3.51 310.0 ± 2.89**233.0 ± 6.81**191.0 ± 7.55**616.50＜0.000 1 87.72 ± 0.07 52.11 ± 0.64**31.98 ± 0.22**15.93 ± 1.54**13.55＜0.000 1

表4 不同濃度白花丹醌對LM3 細胞遷移的影響（n=3，±s）Tab 4 Effects of different concentrations of plumbagin on migration of LM3 cells （n=3，±s）

表4 不同濃度白花丹醌對LM3 細胞遷移的影響（n=3，±s）Tab 4 Effects of different concentrations of plumbagin on migration of LM3 cells （n=3，±s）

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)遷移細胞數(shù)(個)劃痕愈合率(%)空白對照組白花丹醌組0 2 4 8 FP 124.70 ± 2.40 87.00 ± 1.16**71.33 ± 0.89**18.00 ± 1.16**104.20＜0.001 65.22 ± 1.26 46.62 ± 5.20*44.55 ± 6.80*24.37 ± 2.37**13.55＜0.000 1

圖2 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞遷移能力的影響Fig 2 Effect of plumbagin on migration ability of hepatocellular carcinoma Huh-7 and LM3 cells

2.3 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞侵襲的影響

Transwell 侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，白花丹醌作用后，Huh-7 和LM3 細胞穿過 Transwell 小室的細胞數(shù)減少（P＜0.01），提示白花丹醌可顯著抑制肝癌Huh-7 和LM3 細胞侵襲能力，結(jié)果見圖 3 和表5。

圖3 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞侵襲能力的影響Fig 3 Effect of plumbagin on the invasion ability of hepatocellular carcinoma Huh-7 and LM3 cells

表5 不同濃度白花丹醌對 Huh-7 和LM3 細胞侵襲的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of different concentrations of PL on the invasion of Huh-7 and LM3 cells （n=3， ±s）

表5 不同濃度白花丹醌對 Huh-7 和LM3 細胞侵襲的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of different concentrations of PL on the invasion of Huh-7 and LM3 cells （n=3， ±s）

組別質(zhì)量濃度(μmol/L)LM3 細胞侵襲細胞數(shù)(個)Huh-7 細胞空白對照組白花丹醌組0 2 4 8 102.0 ± 1.16 96.33 ± 3.18 57.67 ± 0.89**FP 739.7 ± 6.70 567.3 ± 23.69**333.0 ± 12.66**274.7 ± 8.11**222.4＜0.000 1 22.67 ± 1.45**382.3＜0.000 1

2.4 白花丹醌對Huh-7 和LM3 細胞遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

與空白組比較，白花丹醌組E-cadherin 蛋白表達水平明顯上調(diào)（P＜0.01）；白花丹醌組（8 μmol/L）N-cadherin 和MMP-2 蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見圖 4、表 6、7。

表6 白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 和 MMP-2 蛋白表達的影響（n=3，±s）Tab 6 Effects of PL on the expression of E-cadherin， N-cadherin and MMP-2 proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 cells （n=3，±s）

表6 白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 和 MMP-2 蛋白表達的影響（n=3，±s）Tab 6 Effects of PL on the expression of E-cadherin， N-cadherin and MMP-2 proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 cells （n=3，±s）

組別空白對照組白花丹醌組質(zhì)量濃度(μmol/L)0 2 4 8 FP E-cadherin 1.00 ± 0.01 1.71 ± 0.06**1.98 ± 0.15**3.88 ± 0.16**11.18＜0.000 1 N-cadherin 1.00 ± 0.01 0.91 ± 0.04 0.91 ± 0.02 0.68 ± 0.08**8.29＜0.001 MMP-2 1.00 ± 0.01 0.96 ± 0.03 0.65 ± 0.12 0.37 ± 0.07*32.62＜0.05

圖4 白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞中 E-cadherin， N-cadherin 和MMP-2 蛋白表達的影響Fig 4 Effect of plumbagin on the expression of E-cadherin， N-cadherin and MMP-2 proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 and LM3 cells

2.5 白花丹醌對JAK2/STAT3 信號通路活性的影響

表7 白花丹醌對肝癌LM3 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 和 MMP-2 蛋白表達的影響（n=3， ±s）Tab 7 Effects of plumbagin on the expression of E-cadherin， N-cadherin and MMP-2 proteins in hepatocellular carcinoma LM3 cells（n=3，±s）

表7 白花丹醌對肝癌LM3 細胞中 E-cadherin、N-cadherin 和 MMP-2 蛋白表達的影響（n=3， ±s）Tab 7 Effects of plumbagin on the expression of E-cadherin， N-cadherin and MMP-2 proteins in hepatocellular carcinoma LM3 cells（n=3，±s）

組別空白對照組白花丹醌組質(zhì)量濃度(μmol/L)0 2 4 8 FP E-cadherin 1.00 ± 0.01 1.14 ± 0.08 1.40 ± 0.15 2.03 ± 0.20**11.71＜0.01 N-cadherin 1.00 ± 0.01 0.97 ± 0.04 0.87 ± 0.01 0.55 ± 0.18*5.168＜0.05 MMP-2 1.00 ± 0.01 1.03 ± 0.20 0.60 ± 0.12 0.43 ± 0.07*6.134＜0.05

與空白組比較，白花丹醌組（4、8、10 μmol/L）p- JAK2 和p- STAT3 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），并且隨著白花丹醌濃度的增加其蛋白表達量逐漸降低，而JAK2 與 STAT3 蛋白表達變化不 明顯（P＞0.05），表明白花丹醌可通過抑制JAK2/STAT3 信號通路相關蛋白的表達，從而抑制肝癌 Huh-7 和LM3 細胞遷移和侵襲。見圖 5、表 8、9。

圖5 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 和LM3 細胞中JAK2/ STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響Fig 5 Effects of different concentrations of plumbagin on the expression of JAK2/ STAT3 signaling pathway related proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 and LM3 cells

表8 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞中JAK2/ STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響（n= 3，±s）Tab 8 Effects of different concentrations of plumbagin on the expression of JAK2/ STAT3 signaling pathway related proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 cells （n= 3，±s）

表8 不同濃度白花丹醌對肝癌Huh-7 細胞中JAK2/ STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響（n= 3，±s）Tab 8 Effects of different concentrations of plumbagin on the expression of JAK2/ STAT3 signaling pathway related proteins in hepatocellular carcinoma Huh-7 cells （n= 3，±s）

組別質(zhì)量濃度(μmol/L)p-JAK2 JAK2 p-STAT3 STAT3空白對照組白花丹醌組0 1 2 4 8 1 0 1.00 ± 0.01 0.86 ± 0.07 0.73 ± 0.02 0.60 ± 0.07*0.52 ± 0.07**0.30 ± 0.14**1.00 ± 0.01 0.97 ± 0.04 1.00 ± 0.07 1.12 ± 0.10 0.92 ± 0.06 0.83 ± 0.08 1.00 ± 0.01 0.97 ± 0.13 0.83 ± 0.07 0.62 ± 0.04*0.53 ± 0.10*0.42 ± 0.12**1.00 ± 0.01 1.12 ± 0.04 1.16 ± 0.09 1.01 ± 0.02 1.11 ± 0.15 0.91 ± 0.04 F P 11.23＜0.001 2.153＞0.05 7.130＜0.01 1.522＞0.05

表9 不同濃度白花丹醌對肝癌LM3 細胞中JAK2/ STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響（n= 3， ±s）Tab 9 Effects of different concentrations of plumbagin on the expression of JAK2/ STAT3 signaling pathway related proteins in hepatocellular carcinoma LM3 cells （n= 3，±s）

表9 不同濃度白花丹醌對肝癌LM3 細胞中JAK2/ STAT3 信號通路相關蛋白表達的影響（n= 3， ±s）Tab 9 Effects of different concentrations of plumbagin on the expression of JAK2/ STAT3 signaling pathway related proteins in hepatocellular carcinoma LM3 cells （n= 3，±s）

組別空白對照組白花丹醌組質(zhì)量濃度（μmol/L)0 1 2 4 8 1 0 F P p-JAK2 1.00 ± 0.01 0.87 ± 0.05 0.75 ± 0.08 0.66 ± 0.06*0.58 ± 0.11*0.33 ± 0.11**8.784＜0.01 JAK2 1.00 ± 0.01 0.90 ± 0.06 0.90 ± 0.11 0.78 ± 0.02 0.78 ± 0.03 0.96 ± 0.05 2.492＞0.05 p-STAT3 1.00 ± 0.01 0.96 ± 0.11 0.85 ± 0.11 0.66 ± 0.09 0.59 ± 0.10*0.37 ± 0.10**6.563＜0.01 STAT3 1.00 ± 0.01 1.01 ± 0.04 0.94 ± 0.03 0.90 ± 0.12 0.84 ± 0.05 0.82 ± 0.08 1.582＞0.05

3 討論

肝癌因其惡性程度高、病情進展快，只有25%～30%的原發(fā)性肝細胞癌病例在疾病的早期被診斷，大部分肝癌患者就診時已為晚期，不適合手術切除［9］。晚期肝癌的治療相當棘手，西藥藥物治療不良反應多且長期應用容易出現(xiàn)耐藥。因此，從中醫(yī)藥寶庫中尋找治療肝癌的新藥物具有至關重要的現(xiàn)實意義。

白花丹醌是從中藥白花丹的根中提取出來的醌類化合物，其化學名稱為5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌。目前研究發(fā)現(xiàn)PL 可通過多種機制發(fā)揮抗癌活性，如靶向凋亡、自噬途徑，調(diào)控細胞周期，抗腫瘤血管生成，抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等［3］。此外，PL 可能還可作為活性氧 （ROS） 抑制劑 、谷胱甘肽過氧化物酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用［10］。

E-鈣黏蛋白是一類介導細胞間黏附的跨膜糖蛋白，其表達下降或缺失可導致癌細胞間黏附性減弱，進而使癌細胞容易發(fā)生脫落和轉(zhuǎn)移［11］。研究發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白與肝轉(zhuǎn)移密切相關，其表達減少或缺失可以促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［12］。N-鈣黏蛋白是一類鈣依賴性跨膜糖蛋白，其主要參與調(diào)節(jié)鈣介導的細胞間的黏附、聚集和遷移，它的表達能介導腫瘤細胞由上皮向間葉轉(zhuǎn)化并促使血管增生進而提高腫瘤的侵襲能力［13］?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是一種鋅依賴性酶，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）成員之一，它能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分、破壞阻礙腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵性作用［14］。

本研究運用 CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn)PL 可呈濃度依賴的方式抑制 Huh-7、LM3 細胞的增殖；利用細胞劃痕實驗和Transwell 遷移實驗檢測了PL 處理的Huh-7、LM3 細胞，發(fā)現(xiàn)PL 可以抑制 Huh-7、LM3細胞的遷移能力；與此同時，Transwell 侵襲實驗證明了PL 也可抑制Huh-7 和LM3 細胞的侵襲能力。進一步運用 Western blot 檢測細胞中 E-cadherin、N-cadherin、MMP-2 的 蛋 白 表 達，發(fā) 現(xiàn)PL 可 下 調(diào)N-cadherin、MMP-2 的 表 達，上 調(diào) E-cadherin 的 表達，提示PL 抑制肝癌細胞遷移、侵襲可能與下調(diào)N-cadherin、MMP-2 的表達，上調(diào) E-cadherin 的表達有關，而且這種作用呈一定的濃度依賴的方式。

JAK2/STAT3 信號通路是重要的信號傳導通路之一，對細胞遷移和侵襲有重要作用并影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究表明中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 信號通路影響腫瘤的遷移和侵襲，如從中草藥黃連中提取的黃連素通過COX-2/PGE2 介導的JAK2/STAT3 信號通路抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］；從中藥甜茶中提取的根皮苷通過拮抗JAK2/STAT3 信號通路抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲［16］；中藥白花蛇舌草中提取的蒽醌類單體2-羥基-3-甲基蒽醌可能通過下調(diào)IL-6誘導的JAK2/STAT3 通路部分抑制肺癌細胞的生長和侵襲［17］。本研究檢測了不同濃度PL 處理后的肝癌Huh-7、LM3 細胞中JAK2/STAT3 信號通路相關蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)PL 可下調(diào)p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達，這提示PL 可能抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活。

綜上所述，PL 在體外對人肝癌Huh-7 和LM3細胞的遷移、侵襲能力具有抑制作用，且具有一定的濃度依賴性，其作用機制可能是通過阻斷JAK2/STAT3 信號通路。以上研究為PL 治療肝癌提供了理論和實驗支持。

作者貢獻度說明：

成桃、韋燕飛：實驗設計、實驗實施、撰寫論文；劉歡：協(xié)助實驗設計、指標檢測；劉紅：收集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析；鄧舒燁：實驗設計、論文修改、審校。

本文所有作者聲明無任何利益沖突。