許 洋，葉善蓉，唐祥凱，陳 璐，田 偉，孫羽婕，胡雅琴，李欏顥

(1.中國測試技術(shù)研究院，四川 成都 610021; 2.茶葉標準與檢測技術(shù)四川省重點實驗室，四川 成都 610021 )

0 引 言

烯蟲酯、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯等化合物是在天然保幼激素JH III基礎(chǔ)上人工合成的類似物[1]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，其保持了十二碳二烯酸酯主體框架，結(jié)構(gòu)與JH III類似（同屬倍半萜烯類）且功能一致，對昆蟲季節(jié)性滯育、脫皮、變態(tài)發(fā)育及刺激雌性成蟲卵黃形成等一系列生理過程皆有調(diào)控作用[2]，在倉儲蟲防治、蚊控、飼喂等領(lǐng)域使用廣泛，因其具有活性高、選擇性強且環(huán)境安全性好等優(yōu)點，作殺蟲劑用，應(yīng)用前景良好[3]。稻谷儲藏使用烯蟲酯、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯后，會造成農(nóng)產(chǎn)品及環(huán)境中的殘留，不同國家、地區(qū)或組織也制定了相應(yīng)管理措施，如美國規(guī)定烯蟲酯用于控制昆蟲幼蟲時，在所有食品商品上的殘留容許量豁免，國際食品法典委員會和歐盟則規(guī)定稻谷中烯蟲酯最大殘留限量值為10 mg/kg 和5 mg/kg，但對烯蟲乙酯和烯蟲炔酯無限量要求，日本的農(nóng)殘限量標準制定較嚴，根據(jù)食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留“肯定列表”制度，規(guī)定稻谷中烯蟲酯最大殘留限量值為5 mg/kg，烯蟲乙酯和烯蟲炔酯執(zhí)行0.01 mg/kg的“一律標準”，韓國則未對稻谷中3種保幼激素類似物制定限量，而我國2021年9月3日實施的GB 2763—2021首次規(guī)定稻谷中烯蟲乙酯和烯蟲炔酯最大殘留臨時限量值為0.01 mg/kg，但無對應(yīng)檢測方法，對稻谷中烯蟲酯執(zhí)行10 mg/kg的限量標準。

圖1 烯蟲酯、烯蟲乙酯、烯蟲炔酯和天然保幼激素JH III的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前，烯蟲酯、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯等保幼激素類似物測試方法的研究較少，針對烯蟲酯主要有液相色譜法（LC）[4]、液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 (GC-MS)[6]及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[7]，未見采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法同時測定烯蟲酯、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯的報道。與單四級桿質(zhì)譜相比，串聯(lián)質(zhì)譜的動態(tài)多重反應(yīng)監(jiān)測（DMRM）模式具有更強的抗基質(zhì)干擾能力，且靈敏度更高，準確度更好，適合稻谷等復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量成分的分析。

本研究擬采用分散固相萃取樣品前處理法，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物定量分析方法。優(yōu)化前處理和凈化方式并考察方法的基質(zhì)效應(yīng)、準確度和精密度，旨用于實際稻谷樣品的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-7000C，美國安捷倫公司），DB-1 701（30 m×0.25 mm, 0.25 μm）毛細管色譜柱（美國安捷倫公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf 5810R，德國艾本德公司）；電子天平（BP211D，德國賽多利斯公司）。

100.0 mg/L烯蟲乙酯、烯蟲炔酯標準溶液（天津阿爾塔科技有限公司），烯蟲酯（純度90.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司），100.0 mg/L外環(huán)氧七氯B標準溶液（上海安譜實驗科技股份有限公司），乙酸乙酯、乙腈（色譜純，美國西格瑪奧德里奇公司），冰乙酸（優(yōu)級純，成都市科龍化工試劑廠），醋酸鈉、無水硫酸鎂（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司），PSA：40～60 μm和C18：40～60 μm（煙臺青云儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 標準溶液配制

內(nèi)標稀釋溶液的配制：吸取100.0 mg/L外環(huán)氧七氯B標準溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，色譜純乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的內(nèi)標稀釋溶液，4 ℃保存。

空白基質(zhì)溶液：稱取空白稻谷樣品5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，按1.3條件制備空白基質(zhì)溶液。

對照品單標儲備溶液的配制：稱取12.64 mg 烯蟲酯于10 mL容量瓶中，色譜純乙腈定容至刻度，搖勻，配制烯蟲酯對照品單標儲備溶液，-20 ℃保存。

對照品混合標準儲備溶液的配制：準確移取適量烯蟲酯對照品單標儲備溶液、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯標準溶液適量于10 mL容量瓶中，色譜純乙腈定容至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/L的對照品混合標準儲備溶液，-20 ℃保存。

混合標準工作溶液的配制：精確吸取128 μL的對照品混合標準儲備溶液，氮氣吹干，2 mL空白基質(zhì)溶液復(fù)溶，再逐級用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為 0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.08 mg/L、0.16 mg/L和0.32 mg/L的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取5 g試樣（精確至0.000 1 g）于50 mL塑料離心管中，加10 mL水，渦旋混勻后靜置30 min，加入15 mL 1%乙酸-乙腈溶液、6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈震蕩1 min，震蕩過程中冰浴降溫，在8 ℃下，4 200 r/min離心5 min。吸取8 mL上清液加到內(nèi)含1.2 g無水硫酸鎂、0.4 g PSA和0.2 g C18的15 mL塑料離心管中，渦旋混勻1 min，在8 ℃下，4 200 r/min離心5 min，準確吸取3 mL上清液于50 mL離心管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干。加入1 mL內(nèi)標稀釋溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，待GC-MS/MS分析。

1.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件色譜柱

Agilent DB-1 701毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；升溫程序：40 ℃ 保持 1 min，以 40 ℃/min 升溫至 120 ℃，再以 5 ℃/min升溫至240 ℃，最后以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持 6 min；進樣模式：不分流進樣；進樣量：1 μL；載氣：氦氣（≥99.999%）；恒流模式；流量：1.0 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊（EI）離子源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：230 ℃；碰撞氣：氮氣（≥99.999%），流量：1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣（≥99.999%），流量：2.25 mL/min；掃描模式：動態(tài)多重反應(yīng)監(jiān)測（DMRM）模式，3種保育激素類似物的保留時間和特征離子列于表1。

表1 3種烯蟲酯類保育激素類似物名稱、CAS號、色譜及質(zhì)譜參數(shù)1）

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

農(nóng)藥分析中常用的色譜柱有弱極性的HP-5MS柱[8]，中等極性的DB-17MS柱[9]和DB-1 701柱[10]。本研究逐一進行了考察。結(jié)果表明，當(dāng)使用弱極性的HP-5MS柱分析時，目標峰有拖尾現(xiàn)象；使用中等極性的DB-17MS柱分析時，基質(zhì)成分與目標化合物無法有效分離，特別是低濃度下，干擾物直接影響烯蟲炔酯的定量分析，而使用DB-1 701柱分析時，基質(zhì)成分不干擾3種保育激素類似物的測定，且目標化合物峰型尖銳對稱，保留性質(zhì)強，因此本實驗選擇DB-1 701柱作為分析柱。

對3種保育激素類似物進行質(zhì)譜全掃描，挑選3～5個特征離子進行產(chǎn)物離子掃描，選擇響應(yīng)值高的碎片離子組成特征離子對，利用系統(tǒng)的自動優(yōu)化功能確定定量和定性離子對及相應(yīng)的碰撞能量。3種保育激素類似物的色譜、質(zhì)譜參數(shù)列于表1，典型的DMRM色譜圖如圖2所示。

圖2 3種保育激素類似物典型DMRM色譜圖

2.2 提取方式的優(yōu)化

目前，針對含水量較低的樣品，在提取方法中是否使用水存在較多爭議[11]。蘭韜等[12]以添加回收為評判指標，認為不使用水回收率更好，黃云霞等[13]認為加水浸泡會加大水溶性干擾物的浸出而影響后續(xù)凈化效果，李凌云等[14]認為水的加入占據(jù)了農(nóng)藥在基質(zhì)中的部分吸附位點，農(nóng)藥容易被洗脫下來，提取效率更高。本文對比了水化和不水化兩個條件下響應(yīng)值及提取效率。稱取5 g稻谷樣品，添加3種保育激素類似物至0.2 mg/kg，一組加入15 mL乙腈提取30 min，一組加入10 mL水浸泡30 min，再加入15 mL乙腈，準確取乙腈提取液3 mL，40 ℃氮吹至近干，1 mL乙酸乙酯復(fù)溶后上機分析。結(jié)果顯示，加水條件下，3種保育激素類似物響應(yīng)值都偏低，較大可能是加水浸泡增加了水溶性干擾物的浸出而對目標化合物形成了干擾；同時將樣品進行全掃描分析，結(jié)果如圖3所示，加水條件下，稻谷樣品內(nèi)含物提取效率明顯高于不加水條件下。進一步考察加水浸泡對提取效率的影響，以含水胺硫磷的稻谷陽性樣品為例，發(fā)現(xiàn)不加水條件下，提取效率只有加水條件下的五分之一。為了將樣品本身的農(nóng)藥成分充分提取出來，本實驗采用加水提取的方法，并考慮在后面的凈化過程中盡量去除提取到的其他干擾物。

圖3 不同提取方式全掃描圖譜

2.3 提取溶劑選擇

對提取溶劑進行了考察。乙腈作為農(nóng)藥提取常用的溶劑，具有溶解性好、毒性較低等優(yōu)點，提取目標物范圍廣等特點[15]。在乙腈中加入適量濃度乙酸時，可提高某些對堿敏感農(nóng)藥穩(wěn)定性，進而提高提取效率[16]。在添加3種保育激素類似物為0.2 mg/kg條件下，分別比較了乙腈和1%乙酸-乙腈提取效果。結(jié)果顯示，1%乙酸-乙腈作為提取溶劑時，3種保幼激素類似物響應(yīng)值更高，故選擇1%乙酸-乙腈作為本方法的提取溶劑。

2.4 凈化劑用量的選擇

分散固相萃取常用的分散吸附劑有N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)和石墨化炭黑(GCB)等[17]。PSA多用于去除極性干擾物，如有機酸、脂肪酸和部分糖類，對色素也有一定的去除效果，但能力有限，通常與其他吸附劑組合使用；C18可去除脂肪、甾醇等非極性干擾物，對PSA是很好的補充，但本身極性不強，對極性較弱的化合物有一定的吸附；GCB能有效去除色素，但對平面結(jié)構(gòu)的化合物有吸附效應(yīng)，容易影響此類化合物的回收率[18]。稻谷富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等多種成分，基質(zhì)較復(fù)雜，但色素含量低，因此，本試驗考慮使用PSA和C18混合吸附凈化，并考察吸附劑的最佳用量。

在添加3種保育激素類似物為0.2 mg/kg條件下，固定PSA用量為400 mg，設(shè)置了100～800 mg 8種組合，分別考察C18用量對回收率的影響。結(jié)果如圖4所示：隨著C18用量的增加，3種保育激素類似物回收率逐漸降低，可能是C18在吸附雜質(zhì)的同時，對目標化合物也有不同程度的吸附作用，綜合凈化效果和回收率，確定C18用量為200 mg。

圖4 不同C18用量對3種烯蟲酯類保育激素類似物回收率的影響（n=6）

在添加3種保育激素類似物為0.2 mg/kg條件下，固定C18的用量不變，比較當(dāng)PSA用量分別為100，200，300，400，500，600，700，800 mg 時對農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果如圖5所示，PSA用量對3種保育激素類似回收率影響較小，考慮到實驗成本，確定PSA用量為400 mg。

圖5 不同PSA用量對3種烯蟲酯類保育激素類似物回收率的影響（n=6）

綜上所述，最終確定本方法中凈化劑組合及用量為PSA(400 mg)和C18(200 mg)。此組合下既控制了基質(zhì)效應(yīng)的影響，又保證了3種保幼激素類似物的回收率。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)主要指待測樣品中其他成分干擾目標化合物測定，通常受檢測儀器、基質(zhì)成分等多方面影響。稻谷樣品成分復(fù)雜，如果基質(zhì)效應(yīng)過大，需考慮對方法靈敏度和準確度的影響。本研究擬采用以下公式評價本方法的基質(zhì)效應(yīng)：

基質(zhì)效應(yīng)絕對值在20%以內(nèi)為弱基質(zhì)效應(yīng)，在20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng)，大于50%為強基質(zhì)效應(yīng)。雖然通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件、凈化去除干擾物等方式降低了基質(zhì)效應(yīng)，但如表2所示，稻谷中3種保育激素類似物的基質(zhì)效應(yīng)分別為55.7%、145.8%和134.9%，均表現(xiàn)出強基質(zhì)效應(yīng)，最終本文決定利用基質(zhì)匹配標準曲線來進一步減少基質(zhì)效應(yīng)，以保證方法的準確度。

表2 3種保幼激素類似物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.6 線性關(guān)系和定量限

配制質(zhì)量濃度為0.01～0.32 mg/L的系列混合標準溶液，在1.4節(jié)條件下進行分析，以各目標化合物濃度與內(nèi)標溶液濃度的比值為橫坐標，目標化合物與內(nèi)標溶液峰面積的比值為縱坐標繪制標準工作曲線，由表2可知，3種保幼激素類似物在0.01～0.32 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，以信噪比約為10時空白樣品添加濃度計算烯蟲乙酯的定量限為0.005 mg/kg，烯蟲炔酯和烯蟲酯的定量限為0.01 mg/kg，滿足國際食品法典委員會、歐盟、日本及我國GB 2763—2021對稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物的限量要求。

2.7 準確度和精密度

分別稱取18份稻谷樣品5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，添加烯蟲乙酯、烯蟲炔酯和烯蟲酯至質(zhì)量濃度分別為0.02，0.1，0.2 mg/kg，按1.3節(jié)處理，1.4節(jié)分析。由表3可知，3種保育激素類似物回收率在86.0%～107.3%之間，相對標準偏差在1.0%～5.7%（n=6）之間，滿足稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物定量分析回收率要求。

表3 3種烯蟲酯類保幼激素類似物在稻谷中不同水平下的加標回收率和RSD

2.8 實際樣品檢測

采用本文建立的方法對市場上銷售的25份稻谷樣品進行分析檢測，結(jié)果均未檢出目標物，稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物風(fēng)險較小，原因可能是烯蟲酯類保育激素類似物在國內(nèi)的應(yīng)用還較少，市面上登記銷售的農(nóng)藥制劑僅有勝杰生命科技（潛江）有限公司生產(chǎn)的3種S-烯蟲酯類衛(wèi)生殺蟲劑。

3 結(jié)束語

本文首次建立了稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本方法具有操作簡便、靈敏度高、準確度好等特點，適用于稻谷中3種烯蟲酯類保育激素類似物的同時測定，定量限滿足國際食品法典委員會、歐盟、日本及我國GB 2763—2021對3種烯蟲酯類保育激素類似物的限度要求。