羅 悅，汪 雋，羅 茜，付薛衡，許淑霞，羅 進(jìn)

(1.四川省分析測(cè)試服務(wù)中心，四川 成都 610023; 2.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610059;3.成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059)

0 引 言

對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑由于低毒、殺菌譜廣、生物可降解性和低成本，在化妝品中被廣泛使用[1-3]。適量添加的防腐劑可防止細(xì)菌滋生和活性物質(zhì)氧化，從而加長保質(zhì)期，但添加過多的防腐劑就會(huì)對(duì)人的身體產(chǎn)生危害[4]，所以化妝品中添加的防腐劑的種類鑒定與含量檢測(cè)成為受社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題。自20世紀(jì)末以來防腐劑的檢測(cè)方法得到了快速發(fā)展，化妝品中防腐劑測(cè)定方法多采用熒光法[5-7]、紫外-可見分光光度法[8-9]、薄層色譜法[10-11]、高效液相色譜法[12-13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]、氣相色譜法[16-17]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18-19]等方法。

由于化妝品樣品基體復(fù)雜、目標(biāo)物濃度低，故需要進(jìn)行有效前處理后才能進(jìn)行檢測(cè)。目前化妝品類樣品前處理手段主要有固相萃取、液液萃取、固相微萃取、免疫親合技術(shù)、基質(zhì)固相分散等，但大都存在操作步驟復(fù)雜、需使用有機(jī)試劑以及污染環(huán)境等缺點(diǎn)[20]。

超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）技術(shù)一種新型的萃取分離技術(shù)，是以超臨界流體（supercritical fluid，SCF）為萃取劑。SCF 是位于臨界溫度（Tc）和臨界壓強(qiáng)（Pc）點(diǎn)之上的流體，具有氣體和液體的雙重性質(zhì)，即具有優(yōu)異的溶解能力及良好的流動(dòng)性、傳質(zhì)性和滲透性。SFE擁有高滲透性能和高溶解性能，能高效、有選擇性的分離混合物并易于凈化，是集分離、提取及濃縮為一體的新型分離技術(shù)，因此被稱作“綠色分離技術(shù)”。本工作采用CO2作為超臨界流體，通過控制工作壓強(qiáng)和溫度使CO2成為SCF，SCF在超臨界狀態(tài)下從樣品中提取出目標(biāo)物，然后解除超臨界狀態(tài)將目標(biāo)組分釋放出來，以此來達(dá)到高效無污染分離濃縮的目的[21]。

本文針對(duì)化妝品中含有的對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑，研究了綠色環(huán)保的新型樣品前處理技術(shù)—SFE，并以HPLC-MS為檢測(cè)手段，開發(fā)一種用于檢測(cè)化妝品中4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的靈敏、準(zhǔn)確的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

高效液相色譜儀（日本 Shimadzu LVP 10AT）、電噴霧單級(jí)四極桿質(zhì)譜儀（美國 Agilent G1956A VL）、氮?dú)獍l(fā)生器（英國 Domnick hunter）、超臨界流體萃取儀（美國 ASI Applied Separations Spe-ed SFEII）、色譜柱（美國 Agilent TC-C18 4.6 mm × 250 mm，5 μm）、電子天平（METTLER-TOLEDO AL104）、手提式真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司 AUTO SCIENCE AP-01P）、液相微量進(jìn)樣器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠 AGE 50 μL）等。

MP、EP、PP（均為分析純）購于天津博迪化工有限公司； BP（分析純）購于天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；甲醇、乙醇、乙腈（均為色譜純）購于上海星可生化有限公司；超純水電阻率≥18.2 MΩ·cm由超純水機(jī)（成都優(yōu)普）制備?；瘖y品樣品（平衡水、驅(qū)蚊水、啫喱水、潔面乳、保濕霜、防曬霜、護(hù)膚霜、護(hù)手霜、潤唇等）均購于本地超市。

1.2 樣品前處理

稱取化妝品樣品0.500 0 g于10 mL容量瓶中，添加甲醇至刻度線處，振蕩后裝入不銹鋼萃取釜中，放入控溫箱中。用壓強(qiáng)為140 bar和溫度為65 ℃的CO2超臨界流體提取樣品40 min。在萃取儀的出口處用10 mL容量瓶收集提取取物，定容至刻度線處，再經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾，濾液作HPCL-MS測(cè)定用。

1.3 高效液相色譜條件

流動(dòng)相 A：甲醇（100%），流動(dòng)相 B：水（100%）；梯度洗脫程序見表1；流量：1.000 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧負(fù)離子模式；電噴霧電壓：4 000 V；噴霧氣體壓強(qiáng)：40 psi（1 psi=6.895 kPa）；烘干氣體壓強(qiáng)：20 psi；干燥氣（N2）溫度：350 ℃；流量：9.0 L·min-1，負(fù)離子針電壓：-4 300 V，正離子針電壓：5 500 V；SIM 掃描模式。質(zhì)荷比（m/z）： MP 151.0、EP165.0、PP179.0，BP193.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 超臨界萃取條件優(yōu)化

2.1.1 樣品溶劑的影響

分別選取了3種溶劑包括甲醇（Methanol）、乙醇（Ethanol）和乙腈（Acetonitrile），樣品經(jīng)過壓強(qiáng)為140 bar（1 bar=0.1 MPa）、溫度為 65 ℃ 的 CO2超臨界流體提取40 min后進(jìn)行HPLC-MS測(cè)量。由圖1可知，提取效率從高到低排序?yàn)橐掖迹炯状迹疽译妫蚴褂靡掖己图状嫉挠绊憥缀跸嗟?。考慮流動(dòng)相影響因素，選擇甲醇作為樣品的溶劑。

圖1 樣品溶劑的影響

2.1.2 提取壓強(qiáng)的影響

CO2的溫度-壓強(qiáng)相圖見圖2，由圖可知，CO2處于超臨界狀態(tài)的臨界壓強(qiáng)為73 Mbar。本文分析了從80 ～200 bar的五種不同大小的壓強(qiáng)下對(duì)化妝品中的對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑提取效率的影響。如圖3所示，壓強(qiáng)在80 ～140 bar范圍內(nèi)時(shí)，伴隨著壓強(qiáng)增大，提取效率隨之提高。由于隨著壓強(qiáng)增大，SCF密度增大，溶質(zhì)在SCF擴(kuò)散系數(shù)減小，利于提高溶質(zhì)溶劑化效率以增強(qiáng)提取效率。壓強(qiáng)在140 bar時(shí)提取效率達(dá)到最高，故選擇超臨界流體提取的最佳工作壓強(qiáng)為140 bar。

圖2 CO2的溫度-壓強(qiáng)相圖

圖3 提取壓強(qiáng)的影響

2.1.3 提取溫度的影響

在壓強(qiáng)維持穩(wěn)定的情況下，升高溫度會(huì)使超臨界狀態(tài)下的CO2密度變小，溶質(zhì)的蒸發(fā)壓強(qiáng)提高，導(dǎo)致目標(biāo)物的溶解性會(huì)顯著增強(qiáng)。使用35，45，55，65，75 ℃ 5種溫度來優(yōu)化提取過程。如圖4所示，升高提取溫度有利于增強(qiáng)提取效率，并在溫度為65 ℃時(shí)提取效率達(dá)到了最大值。因此選擇65 ℃為最佳提取溫度。

圖4 提取溫度的影響

2.1.4 超臨界流體萃取提取時(shí)間的影響

探討了靜態(tài)提取時(shí)間分別為 10，20，30，40，50 min對(duì)防腐劑檢測(cè)的影響。如圖5所示，表明提取時(shí)間在20 min到40 min范圍內(nèi)時(shí)，延長靜態(tài)提取時(shí)間有利于增大提取效率，過長的提取時(shí)間不利于防腐劑的提取，故選擇40 min為最佳靜態(tài)提取時(shí)間。

圖5 提取時(shí)間的影響

2.2 HPLC-MS確認(rèn)

由于化妝品樣品成分復(fù)雜，同時(shí)考慮到可能存在結(jié)構(gòu)類似物或防腐劑濃度較低，因此非常有必要確定成分的分子量。以對(duì)羥基苯甲酸酯類分子離子峰（m/z）：151.0、165.0、179.0、193.0 為目標(biāo)離子，通過一級(jí)特征圖譜，結(jié)合總離子流圖和提取離子流量圖，可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定性（圖6）。

圖6 4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜總離子流量圖和提取離子流量圖

2.3 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

MP、EP、PP和BP四種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑濃度分別在0.01～100 μg/mL時(shí)，回歸系數(shù)均大于 0.999，檢出限 0.52～0.58 ng/kg（S/N=3），線性范圍較寬。四種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）分別為 6.18%、4.68%、5.67%、8.77%，檢測(cè)精密度較好。結(jié)果列于表2。

表2 液-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑分析結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品及回收率測(cè)定

對(duì)市售的9種化妝品樣品進(jìn)行SFE前處理后，用HPLC-MS進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2015年），對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑在化妝品中允許使用最大值為：?jiǎn)我环N酯濃度為4 000 mg/kg，混合酯總濃度為8 000 mg/kg（以酸計(jì)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在檢測(cè)的9種化妝品樣品里，都檢測(cè)到含有對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑，但含量均沒有超過標(biāo)準(zhǔn)。化妝品樣品檢測(cè)及加標(biāo)回收結(jié)果如表3所示，加標(biāo)回收率在95.15%-107.69%之間，準(zhǔn)確度較高，可以用于化妝品樣品檢測(cè)。

表3 9種化妝品樣品中4種防腐劑檢測(cè)及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3 9種化妝品樣品中4種防腐劑檢測(cè)及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)束語

化妝品樣品由于成分復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行有效前處理尤為重要。本工作使用SFE對(duì)化妝品中的4種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑MP、EP、PP 和BP進(jìn)行提取，使用HPLC-MS進(jìn)行檢測(cè)。SFE集樣品提取、分離、濃縮過程為一體，處理過程簡(jiǎn)單、高效。結(jié)合HPLC-MS的高靈敏和準(zhǔn)確檢測(cè)，SFE-HPLCMS提供了一種化妝品防腐劑樣品高效的前處理方法和高靈敏的檢測(cè)方法。