楊芩， 付燕， 宋宇， 徐未琳， 彭舒， 鄧潔

(1.凱里學(xué)院 大健康學(xué)院，貴州 凱里 556000； 2.黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 凱里 556000)

藍(lán)莓為杜鵑花科越橘屬落葉或常綠灌木[1-2]，其果實(shí)不僅含有糖、類胡蘿卜素、香精油、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，而且富含多酚或生物活性物質(zhì)，如花青素、黃烷醇和黃酮醇等黃酮類化合物[3]。臨床證據(jù)表明，充分?jǐn)z入藍(lán)莓有降低血壓，預(yù)防心臟病發(fā)作，預(yù)防癌癥，改善心理健康和控制糖尿病等多種健康益處[4]。因此，近20年來，我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，截至2020年底，全國藍(lán)莓栽培面積6.64萬hm2，總產(chǎn)量34.72萬t，鮮果產(chǎn)量23.47萬t[5]，矮叢藍(lán)莓、高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓是目前栽培的三大栽培類型[6]。長久以來，國內(nèi)外學(xué)者熟知，藍(lán)莓栽培中需多品種搭配栽培，以克服藍(lán)莓自花授粉結(jié)實(shí)率低、難以保證產(chǎn)量的問題[7-15]。

具有活力的花粉通過媒介落在柱頭表面，然后在柱頭上天然培養(yǎng)基黏液的作用下水合萌發(fā)，并沿著花柱中的花粉管生長通道生長進(jìn)入胚囊并完成雙受精，受精是果樹能夠正常結(jié)實(shí)的必要條件[16-17]。坐果率的高低與花粉活力直接相關(guān)，例如扁桃[18]、澳洲堅(jiān)果[19]坐果率低的原因之一是花粉活力低。柱頭接受花粉的能力是柱頭與花粉黏附和水合萌發(fā)的生理基礎(chǔ)[20]，坐果率高低與可授性的強(qiáng)弱和強(qiáng)可授性持續(xù)時間有著密切聯(lián)系[21-23]。同時，花粉在柱頭上萌發(fā)后花粉管生長穿過花柱，隨之進(jìn)入胚囊最后完成精核與卵核融合過程的親和性對坐果也有著至關(guān)重要的影響[13,16,24]。當(dāng)然，精核與卵核融合時，胚囊是否具有活力是決定能否坐果的必要條件[16-17,25]。因此，花粉活力、柱頭可授性、授粉親和性和胚囊壽命被認(rèn)為是影響果樹授粉受精的關(guān)鍵生物學(xué)因素[26]。

因此，藍(lán)莓的授粉受精生物學(xué)特性一直備受學(xué)者關(guān)注和重視，不同藍(lán)莓品種的花粉活力差異大，同一品種不同發(fā)育時期的花粉活力亦存在著顯著差異[27]。不同藍(lán)莓品種的柱頭可授性有著顯著差異，柱頭擁有強(qiáng)可授性的時期不一致，維持強(qiáng)可授性的時間亦不一致[28-30]。自花授粉和異花授粉對花粉管生長速度和親和性有顯著影響[13,30]，自花授粉能加速胚囊退化使果實(shí)中的種子數(shù)量減少，同時種子變小[13,31]。同時，藍(lán)莓的花粉活力、柱頭可授性、花粉管生長速度亦受溫度和降雨等環(huán)境因素影響，進(jìn)而影響坐果[3,32]。然而，遺憾的是這些研究報(bào)道大多僅關(guān)注花粉活力、柱頭可授性、花粉管生長速度和胚囊活力中的某一方面，或者參試的材料較少，缺乏系統(tǒng)的研究，研究結(jié)果較為局限。因此，關(guān)于藍(lán)莓自花授粉結(jié)實(shí)率低的關(guān)鍵生物學(xué)因素是花粉活力？還是柱頭可授性？或者是授粉親和性？或者是胚囊壽命？或兼而有之？迄今為止仍撲朔迷離。

因此，本研究以目前主栽的6個兔眼藍(lán)莓品種為試材，對不同花齡的花粉活力和柱頭可授性進(jìn)行測定，同時在此基礎(chǔ)上開展花粉活力和柱頭可授性對自花授粉親和性及坐果率的影響，并在此基礎(chǔ)上開展各參試品種自花授粉坐果率與花粉活力、柱頭可授性、授粉親和性、胚囊壽命的相關(guān)性分析，以期探明參試品種自交坐果率低的關(guān)鍵生物學(xué)因子，為闡明藍(lán)莓自花授粉結(jié)實(shí)率低提供基礎(chǔ)資料，同時對指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐亦具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

以種植于“凱里學(xué)院校內(nèi)卓越農(nóng)林人才培養(yǎng)實(shí)訓(xùn)基地”內(nèi)生長健壯的、生長狀況一致且無病蟲害的8年生的燦爛(VacciniumasheiBrightwell)、杰兔(VacciniumasheiPremier)、粉藍(lán)(VacciniumasheiPowderblue)、巴爾德溫(VacciniumasheiBaldwin)、頂峰(VacciniumasheiClimax)、園藍(lán)(VacciniumasheiGardenblue)6個兔眼藍(lán)莓品種為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 花齡對花粉活力的影響

于各參試品種的盛花始期，按照本實(shí)驗(yàn)室的方法[1,12,21]收集各品種開花第0～7天的花粉及測定花粉活力。

1.2.2 花粉活力對自花授粉坐果率的影響

于各參試品種的盛花始期，按照本試驗(yàn)的方法[1,12,21]每個品種選擇2 400朵大蕾期花去雄，于去雄后第3天收集各品種開花第0～7天的花粉進(jìn)行自花授粉，授粉后第30天統(tǒng)計(jì)坐果率，每個處理300朵花，每100朵花為1次重復(fù)，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 花齡對柱頭可授性的影響

于各參試品種的盛花始期，按照本實(shí)驗(yàn)室的方法[1,12,21,28]收集各品種開花第0～7天的花柱及測定柱頭可授性。

1.2.4 柱頭可授性對自花授粉坐果率的影響

于各參試品種的盛花始期，按照本試驗(yàn)的方法[1,12,21,28]每個品種選擇2 400朵大蕾期花去雄，分別于去雄后第0～7天采用各品種開花第3天的花粉進(jìn)行自花授粉，授粉后第30天統(tǒng)計(jì)坐果率，每處理300朵花，每100朵花為1次重復(fù)，每處理重復(fù)3次。

1.2.5 自花授粉花粉管動力學(xué)觀察

于各參試品種的盛花始期，按照本試驗(yàn)的方法[12-13,21]每個品種選擇480朵大蕾期花去雄，分別于去雄后第0～7天，采用各品種開花第3天的花粉進(jìn)行自花授粉，授粉后第96小時采集各處理的花利用熒光顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)花柱基部被花粉管生長穿過的比率及胚囊退化率，每個處理60朵花，每20朵花為1次重復(fù)，每處理重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)在5%顯著水平進(jìn)行SNK分析。同時開展坐果率與花齡、花粉活力、擁有不同強(qiáng)度柱頭可授性的花柱比率、被花粉管生長穿過的花柱比率、胚囊退化率的相關(guān)性分析，以闡明參試品種自花授粉結(jié)實(shí)率低的關(guān)鍵生物學(xué)因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 花齡對花粉活力的影響

由表1可知，花齡對參試品種的花粉活力有著顯著的影響，總體上表現(xiàn)為花粉活力先增加后下降的趨勢。在大蕾期，參試品種間的花粉活力存在顯著差異，粉藍(lán)的花粉活力最高為84.26%，其余花粉活力從高到低依次為燦爛、巴爾德溫、園藍(lán)、頂峰和杰兔，分別為79.20%、63.94%、51.64%、46.09%和31.66%。各參試品種花粉活力達(dá)到最高值的花齡不一致，且各參試品種的最高花粉活力存在顯著差異；杰兔的最高花粉活力為開花第3天的50.67%；粉藍(lán)在開花第1～3天的花粉活力達(dá)到高峰期，為90.85%～92.96%，且顯著高于其他花齡的花粉活力；頂峰的最高花粉活力為開花第2天的92.28%，開花第1和第3天的花粉活力分別為83.05%和85.71%；燦爛的花粉活力高峰期與粉藍(lán)的一致為開花第1～3天，花粉活力85.72%～87.77%；巴爾德溫的最高花粉活力為開花第2天的83.66%，開花第1和第3天的花粉活力分別為74.11%和76.59%；園藍(lán)的最高花粉活力為開花第4天的82.73%，開花第1～3天的花粉活力分別為72.65%、75.03%和77.75%。在開花第4天各參試品種的花粉活力雖然均顯著下降，但除了杰兔外，其余的5個品種在開花第4～6天的花粉活力仍可達(dá)到48%以上。在開花第7天，粉藍(lán)、頂峰、燦爛、巴爾德溫和園藍(lán)的花粉活力分別顯著降低為32.56%、28.69%、31.38%、28.97%和27.56%，且這5個品種在開花第7天的花粉活力無顯著差異，但杰兔開花第7天的花粉活力僅為20.59%，且顯著低于其他5個品種開花第7天的花粉活力。

表1 花齡對兔眼藍(lán)莓花粉活力的影響

2.2 不同花齡的花粉對自花授粉坐果率的影響

表2表明，用不同花齡的花粉對參試的6個兔眼藍(lán)莓品種開花第3天的花進(jìn)行自花授粉，獲得的坐果率在不同品種間相同花齡的花粉和同一品種內(nèi)不同花齡的花粉間雖然有一定的顯著性差異，但坐果率均未超過30%，僅為21.33%～28.00%。利用開花第0～7天的花粉進(jìn)行自花授粉后，在相同花齡的花粉情況下，巴爾德溫的坐果率均最高，為26.00%～28.00%，開花第0～1天巴爾德溫的坐果率顯著高于其他5個品種。杰兔、粉藍(lán)、頂峰、燦爛和園藍(lán)不同花齡的花粉自花授粉后坐果率分別為22.67%～26.33%、23.33%～26.33%、21.33%～24.00%、22.00%～23.67%和23.67%～26.00%。

表2 不同花齡的花粉對自花授粉坐果率的影響

2.3 花齡對柱頭可授性的影響

由表3可知，參試的品種間的柱頭可授性強(qiáng)度的變化趨勢相似，從大蕾期至開花第7天，6個參試品種的柱頭可授性由弱逐漸增強(qiáng)到第3天達(dá)到最強(qiáng)，然后隨著發(fā)育期的延長逐漸減弱至不具有可授性。其中，杰兔在開花當(dāng)天就有較強(qiáng)可授性，而其他5個品種在開花當(dāng)天具有弱可授性；燦爛和巴爾德溫在開花第1天的柱頭可授性強(qiáng)度高于其余4個品種同發(fā)育期的柱頭可授性；園藍(lán)開花第3天的柱頭可授性強(qiáng)度低于其余5個品種同發(fā)育期的柱頭可授性；燦爛和巴爾德溫開花第4天的柱頭可授性強(qiáng)度高于其余4個品種相同發(fā)育期的柱頭可授性；杰兔、頂峰和粉藍(lán)在開花第5天的柱頭可授性強(qiáng)度低于其他3個品種同時期的柱頭可授性。6個參試品種的柱頭可授性均持續(xù)6 d左右，但燦爛和巴爾德溫2個品種在開花第1～5天均具有較強(qiáng)或強(qiáng)的柱頭可授性，其他4個品種具有較強(qiáng)或強(qiáng)柱頭可授性的時期主要集中在開花第2～3天。

表3 花齡對柱頭可授性強(qiáng)度的影響

2.4 不同花齡的花柱對自花授粉坐果率的影響

由表4可知，利用開花第3天的花粉對6 個參試品種不同花齡的花自花授粉后，在同一品種內(nèi)，隨花齡的不斷延長，自花授粉坐果率表現(xiàn)為先降低后略有增加再逐漸顯著降低的趨勢。各參試品種均在大蕾期獲得自花授粉品種內(nèi)最高的坐果率，杰兔、粉藍(lán)、頂峰、燦爛、巴爾德溫和園藍(lán)的坐果率分別為54.67%、53.33%、40.33%、45.67%、67.67%和55.00%；在開花第6天，6個參試品種的自花授粉坐果率均下降至20.00%以下；至開花第7天，自花授粉坐果率僅為1.00%～6.33%。值得關(guān)注的是，在6個參試品種具有強(qiáng)可授性的開花第2～3天自花授粉的坐果率均顯著低于具有適中或弱可授性的開花第0和第1天的坐果率；同時，除了粉藍(lán)和園藍(lán)以外，其他4個品種開花第4天的坐果率均高于開花第3天的坐果率。

表4 不同花齡的花柱對自花授粉坐果率的影響

2.5 花齡對自花授粉親和性的影響

由表5可知，花齡對被花粉管生長穿過的花柱比率有著顯著影響，總體變化趨勢與花齡對自花授粉坐果率的影響一致，表現(xiàn)為被花粉管生長穿過的花柱比率先顯著降低后略有增加再顯著降低。在開花第0天，杰兔、粉藍(lán)、頂峰、燦爛、巴爾德溫和園藍(lán)自花授粉后被花粉管生長穿過的花柱比率分別為68.33%、66.67%、51.67%、61.67%、83.33%和70.00%；在開花第5天，除了巴爾德溫外，其余5個品種自花授粉后被花粉管生長穿過的花柱比率均未超過20.00%；至開花第7天，被花粉管生長穿過的花柱比率僅為3.33%～6.67%。值得關(guān)注的是，在6個參試品種具有強(qiáng)可授性的開花第3天利用各自開花第3天的花粉進(jìn)行自花授粉后，被花粉管生長穿過的花柱比率均顯著低于具有適中或弱可授性的開花第0和第1天的被花粉管生長穿過的花柱比率；同時，除了粉藍(lán)以外，其他品種開花第4天的被花粉管生長穿過的花柱比率均高于開花第3天的被花粉管生長穿過的花柱比率。

表5 花齡對被花粉管生長穿過的花柱比率的影響

2.6 花齡對胚囊退化的影響

表6表明，花齡對參試品種的胚囊退化有著顯著影響，總體上表現(xiàn)為隨花的逐漸發(fā)育胚囊退化率逐漸增加。在開花第0天，杰兔胚囊的退化率為67.33%，顯著高于其他5個品種，巴爾德溫和園藍(lán)胚囊的退化率分別為47.33%和42.00%，顯著高于粉藍(lán)(33.33%)、頂峰(38.67%)和燦爛(36.67%)。開花第1天后，參試6個品種的胚囊退化率均顯著增加，在柱頭可授性最強(qiáng)的開花第3天，杰兔、粉藍(lán)、頂峰、燦爛、巴爾德溫和園藍(lán)的胚囊退化率分別為83.33%、76.00%、68.67%、65.33%、62.67%和75.33%，6個品種的胚囊退化率均超過60.00%，且杰兔的胚囊退化率顯著高于其他5個品種；在開花第4天，參試6個品種的胚囊退化率均超過70.00%；在開花第7天，參試的6個品種的胚囊退化率均超過90.00%，且此時品種間的胚囊退化率無顯著性差異。

表6 花齡對胚囊退化率的影響

2.7 自花授粉坐果率與授粉受精關(guān)鍵生物學(xué)因素的相關(guān)性分析

表7表明，參試的6個兔眼藍(lán)莓品種，除了園藍(lán)以外，其余5個品種的自花授粉坐果率均與花粉活力不存在顯著相關(guān)性。參試6個兔眼藍(lán)莓品種自花授粉的坐果率與可授性強(qiáng)度的相關(guān)性則相較復(fù)雜，坐果率與擁有不同強(qiáng)度可授性的花柱的比率相關(guān)顯著性不一致。杰兔、頂峰、巴爾德溫和園藍(lán)4個品種的自花授粉坐果率與具有強(qiáng)可授性的花柱比率不存在顯著相關(guān)性，粉藍(lán)和燦爛自花授粉的坐果率與具有強(qiáng)可授性的花柱比率顯著相關(guān)；粉藍(lán)、頂峰和燦爛3個品種自花授粉坐果率與具有較強(qiáng)可授性的花柱比率存在顯著正相關(guān)，巴爾德溫自花授粉坐果率與具有較強(qiáng)可授性的花柱比率存在極顯著正相關(guān)，杰兔和園藍(lán)自花授粉的坐果率與具有較強(qiáng)可授性的花柱比率不存在顯著相關(guān)性；粉藍(lán)、頂峰和園藍(lán)自花授粉坐果率與具有弱可授性的花柱比率存在極顯著正相關(guān)，燦爛和巴爾德溫自花授粉坐果率與具有弱可授性的花柱比率存在正相關(guān)，杰兔自花授粉坐果率與具有弱可授性的花柱比率不存在顯著相關(guān)性；參試6個品種自花授粉的坐果率與不具有可授性的花柱比率存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。參試6個兔眼藍(lán)莓品種自花授粉的坐果率均與被花粉管生長穿過的花柱比率極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.965、0.967、0.947、0.966、0.960和0.962；與胚囊退化率呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.926、-0.969、-0.878、-0.937、-0.848和-0.964。

表7 坐果率與授粉受精關(guān)鍵生物學(xué)因素的相關(guān)性分析

3 討論

果樹生產(chǎn)栽培以果實(shí)為收獲對象，因此，能夠順利地完成授粉受精對于絕大多數(shù)果樹生產(chǎn)栽培來說具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義，而坐果率的高低對于小漿果藍(lán)莓的高產(chǎn)栽培有著決定性的作用。目前主栽的南高叢藍(lán)莓、北高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓均為多倍體[33]，一般而言多倍體減數(shù)分裂過程易出現(xiàn)異常而致花粉和胚囊活力降低[25]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，參試的6個兔眼藍(lán)莓品種，除了杰兔之外，其他5個品種的花粉活力最高值均超過80.00%，這可能歸因于參試品種均為六倍體[33]，屬偶數(shù)多倍體，在減數(shù)分裂時有效地降低了分裂配對異常的概率。前人關(guān)于花粉活力對扁桃[18]和澳洲堅(jiān)果[19]等果樹的研究表明，花粉活力的高低對坐果率有著直接的影響，但本研究發(fā)現(xiàn)，參試的6個品種，除了園藍(lán)以外，其余5個品種自花授粉的坐果率與花粉活力無顯著的相關(guān)性，這可能歸因于參試品種的自交不親和性降低了花粉活力對自花授粉坐果率的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，花齡對參試6個品種的自花授粉坐果率有著極顯著的負(fù)相關(guān)影響，這主要體現(xiàn)在柱頭可授性、授粉親和性和胚囊壽命3項(xiàng)評價參數(shù)方面。柱頭作為雌性器官接收花粉的載體，可授性強(qiáng)弱是衡量雌性器官接收花粉并助力花粉萌發(fā)能力強(qiáng)弱的直接體現(xiàn)，柱頭可授性強(qiáng)度不論對自交還是異交的結(jié)實(shí)率都會產(chǎn)生重要的影響[34]，本研究發(fā)現(xiàn)花齡對參試6個品種柱頭可授性強(qiáng)弱的影響與本實(shí)驗(yàn)室已有研究結(jié)果基本一致[21]。相關(guān)性分析表明，參試6個品種自花授粉的坐果率與擁有不同強(qiáng)度可授性的花柱比率有著多樣性的相關(guān)性，呈現(xiàn)出一定的品種特異性。杰兔自花授粉坐果率與不具有可授性的花柱比率呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與擁有強(qiáng)可授性、較強(qiáng)可授性和弱可授性的花柱比率不存在顯著相關(guān)性。粉藍(lán)和燦爛自花授粉坐果率與擁有強(qiáng)可授性和較強(qiáng)可授性的花柱比率呈顯著正相關(guān)，巴爾德溫自花授粉坐果率與擁有較強(qiáng)可授性的花柱比率呈極顯著正相關(guān)。粉藍(lán)、頂峰和園藍(lán)自花授粉坐果率與擁有弱可授性的花柱比率呈極顯著正相關(guān)，燦爛和巴爾德溫自花授粉坐果率與擁有弱可授性的花柱比率呈顯著正相關(guān)。參試的6個品種自花授粉坐果率與不具有可授性的花柱比率呈極顯著負(fù)相關(guān)，這表明柱頭可授性強(qiáng)弱對參試6個品種自花授粉坐果率影響不大，但柱頭是否具有可授性對參試品種自花授粉坐果率有著至關(guān)重要的影響。這可能歸因于藍(lán)莓單朵花的花期較長，且其濕性柱頭的表面寬，乳突細(xì)胞多，不僅接收花粉的面積大，而且接收和附著能力強(qiáng)[21,28-30,32]。

本研究發(fā)現(xiàn)，花齡對參試的6個品種自花授粉后被花粉管生長穿過的花柱比率差異顯著。開花第0天進(jìn)行自花授粉處理獲得的坐果率顯著高于其他時間進(jìn)行自花授粉獲得的坐果率，同時開花第3天進(jìn)行自花授粉獲得的坐果率顯著低于開花第0～2天進(jìn)行自花授粉獲得的坐果率，這可能歸因于藍(lán)莓的花柱中存在著某種與S-RNase具有相似作用的物質(zhì)，且亦具有時空和組織表達(dá)的特異性，在開花第3天的花柱中其表達(dá)量達(dá)到高峰，因而使坐果率顯著降低[12]。此外，坐果率的高低在很大程度上取決于雄配子到達(dá)目標(biāo)胚囊時胚囊是否具有活力[17]。已有研究表明，藍(lán)莓授粉后需要48～72 h花粉管能夠穿過花柱進(jìn)入胚囊授粉[13,30]，本研究在開花第0天對各參試品種進(jìn)行自花授粉，在花粉管進(jìn)入胚囊后的授粉后第96小時取樣觀察發(fā)現(xiàn)，粉藍(lán)、頂峰和燦爛的胚囊退化率超過30.00%，巴爾德溫和園藍(lán)的胚囊退化率超過40.00%，而杰兔的胚囊退化率達(dá)到67.33%；同時杰兔開花第3天自花授粉處理的胚囊退化率超過80.00%，其余5個品種的胚囊退化率均超過60.00%。相關(guān)性分析表明，各參試品種自花授粉的坐果率與胚囊退化率均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這表明胚囊的高退化率是各品種自花授粉坐果率低的重要原因之一。

綜上所述，柱頭是否具有可授性、被花粉管生長穿過的花柱比率和胚囊退化率是參試6個兔眼藍(lán)莓品種自花授粉的坐果率低的關(guān)鍵生物學(xué)因素，研究結(jié)果為探明兔眼藍(lán)莓自花授粉坐果率低的生物學(xué)原理奠定了一定的理論依據(jù)。但是，基于自交不親和性的花粉管生長和胚囊退化是一個錯綜復(fù)雜的生命過程，目前關(guān)于藍(lán)莓自交不親和性和胚囊退化的研究主要集中在表型結(jié)果及其應(yīng)用上，而關(guān)于自交不親和性與胚囊退化的機(jī)理研究尚未開展。因此，以花粉管生長過程為線索，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究藍(lán)莓花粉管生長和胚囊退化過程中基因表達(dá)的差異變化，這應(yīng)成為今后關(guān)于藍(lán)莓自交不親和性和胚囊退化的分子機(jī)制研究的重點(diǎn)。