蔡桂豐，徐楗熒，阮永銘，曾偉榮，趙琴，許偉標，吳松

(1.珠海市婦幼保健院，珠海 519000；2.億康基因科技有限公司，蘇州 215000)

線粒體是人體細胞內(nèi)細胞器之一，在線粒體DNA(mtDNA)和核DNA驅(qū)動下它們負責細胞能量物質(zhì)ATP生產(chǎn)，因此也被稱為細胞的能量工廠，同時也參與介導細胞的增殖、凋亡和分化。線粒體自身擁有一套獨立的基因組DNA，其拷貝數(shù)量取決于細胞內(nèi)線粒體的數(shù)量。在成熟的人類精子中，大約有22～75個這樣的細胞器被包裹在中段周圍，而大量的線粒體分布在卵母細胞的細胞質(zhì)中[1]。受精后，主要遺傳自母系卵母細胞的線粒體會發(fā)生不對稱分離，有研究表明線粒體在發(fā)育中胚胎形成的卵裂球中分布不均衡，直到囊胚階段才自主復制[1-4]。在人類生殖過程中，生殖細胞的形成和受精、著床前胚胎的發(fā)育及胚胎著床都需要大量的細胞能量供給[5-6]，線粒體對于成功受精和正確的胚胎植入和發(fā)育至關重要，ATP含量不足與受精失敗和胚胎發(fā)育異常有關[4，7]。因此，卵母細胞中線粒體的質(zhì)量決定了卵母細胞的質(zhì)量，進而決定了發(fā)育中胚胎的質(zhì)量[8]。

在輔助生殖技術(ART)應用中，胚胎質(zhì)量是影響輔助生殖治療的一個關鍵因素[9]。盡管ART取得了實質(zhì)性進展，但評估胚胎生存能力的臨床工具幾乎沒有發(fā)展，胚胎學家在選擇最佳移植胚胎時仍然依賴于不精確和高度主觀的形態(tài)學和形態(tài)計量分級系統(tǒng)。重要的是，即使在植入前遺傳學檢測(PGT)篩選到染色體正常胚胎的情況下，仍然有部分移植胚胎無法植入或活產(chǎn)[10]；同時，PGT作為一種有創(chuàng)性的胚胎選擇技術對于胚胎的影響也存在爭議。2014年Stigliani等[11]發(fā)現(xiàn)，99%以上的廢棄胚胎培養(yǎng)液樣本可以檢測到mtDNA，證明培養(yǎng)液中含有mtDNA是一種常見現(xiàn)象，且與核DNA相比含量更高。近年來相關學者通過這種無創(chuàng)的方式探究了培養(yǎng)液中mtDNA與胚胎發(fā)育潛能的關系[11-14]，但研究數(shù)量有限，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA與胚胎質(zhì)量的關系有待進一步確認。本研究選擇了第5或6天發(fā)育囊胚(D5或D6囊胚)培養(yǎng)液，應用高通量測序(NGS)技術檢測培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)，試圖了解mtDNA拷貝數(shù)與常規(guī)胚胎形態(tài)、非整倍體性和囊胚發(fā)育時間的關系，為新的囊胚質(zhì)量評價指標提供數(shù)據(jù)支持。

資料和方法

一、研究對象

選取2021年7—12月于珠海市婦幼保健院生殖中心就診的10名行PGT的患者為研究對象。10名患者獲得正常受精并培養(yǎng)發(fā)育至4期的36枚囊胚，采集囊胚活檢細胞和培養(yǎng)液。

10對夫婦均簽署了卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)和PGT知情同意書。醫(yī)院生殖倫理委員會對此研究項目通過倫理審查。

二、研究方法

1.胚胎培養(yǎng)：將成熟卵母細胞進行ICSI后轉(zhuǎn)移至G-1 PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，16～18 h后觀察雙原核(2PN)形成情況。第3天(D3)根據(jù)胚胎質(zhì)量評分，用合適的剝卵針進一步去除D3胚胎的顆粒細胞，每個胚胎清洗3次后轉(zhuǎn)入G-2 PLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)到D4，再轉(zhuǎn)入單微滴進行培養(yǎng)，每個培養(yǎng)滴25 μl，培養(yǎng)至D5進行觀察并評分。

2.囊胚形態(tài)學評價：采用Garnder囊胚評分法[15]對培養(yǎng)的囊胚進行形態(tài)學評估，參考Klimczak囊胚分類標準[16]對囊胚分組：(1)高質(zhì)量囊胚，包括3～6AA和4～6AB囊胚；(2)一般質(zhì)量囊胚，包括BB、1～3AB及1～2AA囊胚；(3)低質(zhì)量囊胚，包括AC、CA、BC、CB或CC囊胚。

3.胚胎活檢及培養(yǎng)液的收集：當囊胚發(fā)育到4期(一般為D5/D6)，評估胚胎等級，選擇4CB/4BC以上囊胚進行活檢。用記號筆在樣本采集管上標號，用移液器在需采樣的培養(yǎng)液中反復吹吸3次后收集胚胎培養(yǎng)液樣本(避免吸到油滴)，收集1個培養(yǎng)滴更換1次槍頭，避免交叉污染。將樣本采集管置于迷你離心機(珠海黑馬)上，瞬時離心(4 000 r/min，5～10 s)，確保采集的樣本置于采集管底，-80℃保存。

4.單細胞全基因組擴增(WGA)和NGS分析：對收集的囊胚活檢細胞和培養(yǎng)液進行WGA，然后通過ChromInst(EK100100724 NICSInstTM文庫制備試劑盒；蘇州億康基因)進行文庫制備。使用QubitdsDNA HS Assay Kit(貨號Q32851；Invitrogen，美國)對擴增建庫產(chǎn)物進行純化和定量，然后使用Illumina NextSeq 550平臺(Illumina，美國)進行雙端reads 75測序，每個樣品產(chǎn)生大約150萬個測序讀數(shù)。下機數(shù)據(jù)進行引物接頭和低質(zhì)量序列的過濾，過濾后的高質(zhì)量reads序列比對到hg19人類參考基因組，并進行重復reads序列去除和堿基GC含量校正，剩余唯一比對reads使用CBS分割算法進行拷貝數(shù)變異(CNV)分析。

mtDNA含量以mtDNA拷貝數(shù)/核基因組的形式進行量化，即平均每核基因組下mtDNA的拷貝數(shù)。把比對到線粒體基因組的測序讀取序列進行計數(shù)，并通過比對到常染色體的讀取序列計數(shù)進行均一化；根據(jù)以下公式計算和顯示每個核基因組的mtDNA拷貝數(shù)：mtDNA拷貝數(shù)=(比對常染色體區(qū)域數(shù)×2×比對線粒體讀取序列數(shù)量)/(比對常染色體讀取序列數(shù)×比對線粒體區(qū)域數(shù))。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、樣本分組

本次研究共收集到36枚囊胚，其中D5囊胚33枚、D6囊胚3枚。根據(jù)形態(tài)學評估結(jié)果，高質(zhì)量囊胚21枚、一般質(zhì)量囊胚12枚、低質(zhì)量囊胚3枚。根據(jù)胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(PGT-A)結(jié)果，整倍體囊胚19枚，非整倍體囊胚17枚(表1)。

表1 囊胚評價指標情況表

二、不同形態(tài)學質(zhì)量評價囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)發(fā)育囊胚形態(tài)學質(zhì)量評價分組，檢測結(jié)果顯示質(zhì)量評價為高質(zhì)量、一般質(zhì)量和低質(zhì)量胚胎組的mtDNA拷貝數(shù)分別為[(150.24±166.24)，n=21]、[(110.58±92.83)，n=12]和[(91.00±0.82)，n=3]，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同形態(tài)學質(zhì)量評價囊胚組培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

三、D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)囊胚發(fā)育時間分組，檢測結(jié)果顯示D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)分別為[(137.64±143.57)，n=33]和[(71.00±54.52)，n=3]，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 D5和D6囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

四、整倍體和非整倍體囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

根據(jù)囊胚活檢細胞整倍體性分組，檢測結(jié)果顯示36份囊胚活檢細胞中整倍體囊胚和非整倍體囊胚分別為19枚和17枚，其中整倍體組和非整倍體組培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)分別為[(144.79±162.17)]和[(117.88±107.14)]，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 整倍體和非整倍體囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)比較

討 論

優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇是生殖醫(yī)學技術發(fā)展所關注的一個重點問題。雖然現(xiàn)階段基于胚胎形態(tài)學和遺傳學的評估已經(jīng)在輔助生殖臨床治療應用上取得了良好效果，但這些方法仍然存在著一定的局限性，如形態(tài)學評估的主觀判斷差異、胚胎活檢細胞遺傳學檢測的有創(chuàng)性。近年來，胚胎培養(yǎng)液或腔液中遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)引起了學者的關注，已有數(shù)據(jù)表明包括培養(yǎng)液中細胞核DNA和mtDNA可以被成功分離、檢測和分析[17-21]，這為胚胎遺傳學的無創(chuàng)評估提供了基礎。目前，針對核DNA的無創(chuàng)評估已經(jīng)取得了一定的進展，但是對于囊胚培養(yǎng)液中mtDNA的無創(chuàng)評估研究較少。本研究通過NGS無創(chuàng)檢測囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)，探究mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量的關系。

一般而言，在當前胚胎評價中形態(tài)學質(zhì)量評分高和整倍體的囊胚具有更好的胚胎質(zhì)量或發(fā)育潛能。本研究嘗試探索不同形態(tài)學質(zhì)量評級、不同整倍體性和不同發(fā)育時間(D5/D6)的囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的差異，研究結(jié)果與先前的一些研究有所不同。在Stigliani等[11-12]的兩項研究中，其中一項研究比較了A等級與B、C等級D2/D3胚胎培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值，結(jié)果顯示兩者無明顯差異[12]；另一項研究結(jié)果顯示，可以形成囊胚的D3卵裂胚培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值顯著高于不能成囊的胚胎，且可在D5發(fā)育至3或4期囊胚的D3卵裂胚培養(yǎng)液中mtDNA/核DNA比值顯著高于發(fā)育較慢的胚胎，表明高mtDNA/核DNA比值是高發(fā)育潛能胚胎的一個參考指標[11]。李亨利等[13]對卵裂期胚胎培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)在不同胚胎形態(tài)學質(zhì)量分組中進行了比較，研究結(jié)果提示，形態(tài)學優(yōu)質(zhì)組(以卵裂球數(shù)目判定)顯著高于非優(yōu)質(zhì)組，發(fā)育正常速度組顯著高于異常速度組，而高評分組與低評分組無顯著差異。本研究中，在高質(zhì)量、一般質(zhì)量、低質(zhì)量囊胚以及D5、D6囊胚分組中并未發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的顯著差異。分析其原因可能因為，不同時期胚胎樣本、胚胎形態(tài)學評價的標準、mtDNA檢測方法和量化方法造成了研究間結(jié)果的不一致。

Zhang等[14]進一步對囊胚培養(yǎng)液中mtDNA進行了研究，多重因素線性回歸分析顯示，培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與囊胚活檢細胞mtDNA拷貝數(shù)(P=0.001)、女性年齡(P=0.012)、囊胚評分(P=0.014)呈顯著正相關，但與囊胚染色體整倍體性無明顯相關性(P=0.138)，說明囊胚活檢細胞mtDNA拷貝數(shù)、女性年齡、囊胚評分可能是影響培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的因素。本研究未進行線性相關性分析，但從不同分組間平均mtDNA拷貝數(shù)的數(shù)據(jù)可以看到，從低質(zhì)量到高質(zhì)量囊胚呈現(xiàn)上升趨勢，但尚無統(tǒng)計學差異，這可能因為本研究中胚胎形態(tài)學評價的標準和mtDNA拷貝檢測方法不同于上述研究。同時也有研究提出，目前囊胚培養(yǎng)液中DNA來源不明、DNA產(chǎn)量和完整性較低、潛在外源性污染、培養(yǎng)液或囊腔液樣本采集標準不統(tǒng)一、數(shù)據(jù)處理和分析不一致等問題對培養(yǎng)液中遺傳信息的無創(chuàng)研究帶來了挑戰(zhàn)[21-22]，這也可能是影響目前研究結(jié)果差異的重要原因。

但本研究仍存在一些不足之處：首先，研究納入的胚胎樣本數(shù)量較少，導致最后分組間差異較大；其次，未納入胚胎移植及妊娠結(jié)局的相關數(shù)據(jù)，導致研究結(jié)論有一定的局限性。后續(xù)應完善實驗設計，開展更大樣本量的隊列研究加以分析。

綜上所述，不同形態(tài)學評級、囊胚發(fā)育時間和染色體整倍體性囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)無顯著差異，胚胎質(zhì)量與培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)的關系有待進一步確認。在當前囊胚培養(yǎng)液mtDNA拷貝研究數(shù)據(jù)較少的情況下，本研究為進一步探究囊胚培養(yǎng)液中mtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量關系提供了參考數(shù)據(jù)。