許亞坡 羅金鍵 夏 超 吳慧麗

全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)每年新發(fā)病例數(shù)約180萬，死亡人數(shù)約88萬[1]，而近年我國CRC患病率及死亡率呈上升趨勢，患病率居惡性腫瘤第三位，死亡率居第五位[2]，嚴(yán)重威脅國民生命健康。手術(shù)是治療早期CRC的有效手段，但進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等階段的CRC患者，生存情況不容樂觀，分子靶向機(jī)制是現(xiàn)階段臨床研究重點(diǎn)[3]，故而探尋有效的基因治療靶點(diǎn)藥物對患者生存有積極意義。五味子素來源于五味子中分離的木脂素類活性成分，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等多種藥理作用[4]，近年研究表明其在腫瘤抑制方面顯示出確切效果[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1(Forkhead boxC1，F(xiàn)OXC1)作為插頭框轉(zhuǎn)錄因子家族重要一員，與癌細(xì)胞分化、發(fā)育等過程密切相關(guān)，上調(diào)其水平可促進(jìn)CRC癌細(xì)胞增殖[6]。但目前關(guān)于五味子素對CRC細(xì)胞增殖、侵襲及調(diào)控FOXC1基因的機(jī)制尚未明確，本研究以CRC HCT116細(xì)胞為研究對象，探討五味子素對HCT116細(xì)胞的影響，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制，為臨床CRC治療提供參考依據(jù)。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人CRC HCT116細(xì)胞，購自上海匹拓生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海微科生物技術(shù)有限公司，Opti-MEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購自上海澤葉生物科技有限公司，LipofectamineTM 2000試劑盒及Trizol溶液來自北京索萊寶科技有限公司，Transwell chamber購自廣州賽哲科技有限公司；五味子素、DEPC購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司，Binding Buffer緩沖液購自上海君瑞生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，碘化丙啶(PI)及0.1%結(jié)晶紫購自上海麥克林生化科技有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)購自上海群己生物科技有限公司；FOXC1、FOXC1-NC(模擬物陰性對照)均購自美國Sigma-aldrich公司；FOXC1(ab227977)、E-cadherin(ab16663)、MMP2(ab92536)、Vimentin(ab92547)抗體購自美國Abcam公司；Varioskan LUX型酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACSCalibur型)，Avanti J-E離心機(jī)購自美國貝克曼庫爾特有限公司，Powerpac Universal型電泳儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人CRC HCT116細(xì)胞，生長于含10%滅活胎牛血清、100 U/ml鏈霉素及青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于5% CO2、37 ℃的飽和溫度培養(yǎng)箱中，每2～3 d使用0.25%胰蛋白酶消化及傳代細(xì)胞1次，采用10% DMSO+90%血清凍存液來凍存細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗操作。

1.2.2 CCK-8檢測CRC HCT116細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，接種于96孔板(每孔2×104個)，分別添加0、12.5、25、50 μmol/L濃度的五味子素(甲醇溶解)，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，將HCT116細(xì)胞在培養(yǎng)箱(5% CO2、37%)中分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，細(xì)胞貼壁丟棄培養(yǎng)基，再添加10 μl CCK-8與200 μl培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，490 nm波長下使用酶標(biāo)儀測定吸光度值，計算不同濃度下細(xì)胞存活率，明確細(xì)胞增殖情況，重復(fù)3次，取平均值。并選擇細(xì)胞存活率接近50%的五味子素濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗研究。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 隨機(jī)分層法分為5組：對照組、FOXC1-NC組、FOXC1組、五味子素組、FOXC1+五味子素組。轉(zhuǎn)染前24 h，取長勢良好對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞，倒置顯微鏡，觀察細(xì)胞增殖至60%～70%時，進(jìn)行胰蛋白酶消化，收集CRC HCT116細(xì)胞，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×106個/ml接種到24孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，每個復(fù)孔重復(fù)3次，之后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用相關(guān)基因序列質(zhì)粒(2.4 μl的FOXC1-NC及FOXC1)與5 μl的LipofectamineTM2000分別添加至245 μl的Opti-MEM培養(yǎng)基中，制成溶液備用，靜置5 min后，混勻，靜置30 min，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)(48 h)，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染成功標(biāo)準(zhǔn)為轉(zhuǎn)染率>85%，以便用于后續(xù)實(shí)驗。對照組不做任何處理，F(xiàn)OXC1-NC組轉(zhuǎn)染FOXC1-NC，F(xiàn)OXC1組轉(zhuǎn)染FOXC1，五味子素組HCT116細(xì)胞內(nèi)加入50 μmol/L五味子素，F(xiàn)OXC1+五味子素組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FOXC1 24 h后加入五味子素50 μmol/L。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定HCT116細(xì)胞凋亡情況 取HCT116細(xì)胞，添加預(yù)冷PBS緩沖液，離心6 min(4 ℃，1000 r/min，離心半徑10 cm)，棄上清液，再次加入預(yù)冷PBS緩沖液，離心(離心條件同上)，棄上清液，加入500 μl 1×Binding Buffer緩沖液來重懸細(xì)胞，之后依次加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，室溫下振蕩孵育，使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況，CELL QUEST 3.0分析實(shí)驗數(shù)據(jù)。

1.2.5 Transwell實(shí)驗檢測細(xì)胞侵襲能力 預(yù)冷培養(yǎng)液，以1∶8比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠與培養(yǎng)基，加入Transwell chamber上室(40 μl/孔)，培養(yǎng)箱孵育(37 ℃，5 h)，選取對數(shù)期HCT116細(xì)胞，加入Transwell chamber上室，每孔3×104個，將100 g/L胎牛血清培養(yǎng)液加入Transwell chamber下室，每孔600 μl，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h(37 ℃)，PBS緩沖液洗滌，棉簽擦去微孔膜內(nèi)層磁暴，多聚甲醛固定(20 min)，PBS清洗，0.1%結(jié)晶紫染色(10 min)，洗去表面結(jié)晶紫，選10個視野，顯微鏡下計算侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次實(shí)驗，取平均數(shù)。

1.2.6 Realtime-PCR測定FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá) 收集各組培養(yǎng)48 h的HCT116細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗2次，吸盡PBS溶液后，予以Trizol溶液1 ml震蕩混勻(4 ℃，5 min)，加入0.2 ml氯仿振蕩15 s，靜置(4 ℃，3 min)，離心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，-20 ℃靜置20 min，離心(4 ℃，12000 rpm，15 min)，棄上清，1 ml DEPC處理后洗滌沉淀，離心機(jī)離心(4 ℃，8000 rpm，185 min)，加入dd H2O水30 μl，溶解RNA；RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1，反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體系10 μl，2 μL模板cDNA ，各1 μl上下游引物，擴(kuò)增條件(98 ℃反應(yīng)5 min，95 ℃變性15 s，72 ℃延伸30 s，熔解曲線55 ℃～95 ℃，40個循環(huán))；以β-actin為內(nèi)參，目的基因相對定量采用2-△△CT法計算。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，混勻，充分裂解20～30 min，提取蛋白質(zhì)，之后予以離心(12000 r/min，離心半徑10 cm，5 min)，取上清液，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)緩沖液轉(zhuǎn)膜(50 min)，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜上，將其放入50 g/L脫脂奶粉中，孵育2 h，TBST洗膜5 min，在加入稀釋(1∶1000)的FOXC1、MMP2、E-cadherin、Vimentin一抗與稀釋(1∶2000)的β-actin一抗中孵育過夜(4 ℃)，次日洗膜，加入稀釋(1∶2000)二抗孵育(室溫，1 h)，洗膜，暗室中曝光顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J 軟件分析灰度值，計算相對表達(dá)量：目的蛋白/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度五味子素對HCT116細(xì)胞存活率的影響

使用不同濃度五味子素作用于HCT116細(xì)胞，檢測不同時間點(diǎn)細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L五味子素處理HCT116細(xì)胞比較，在12 h、24 h、48 h時采用12.5、25、50 μmol/L五味子素處理的細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)，其中采用50 μmol/L五味子素處理48 h時，細(xì)胞存活率最接近50%，后續(xù)實(shí)驗均選取此條件細(xì)胞。見圖1。

圖1 不同濃度五味子素處理不同時間的HCT116細(xì)胞存活率

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

5組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組、FOXC1-NC組比較，F(xiàn)OXC1組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組細(xì)胞凋亡率高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表2。

表2 各組HCT116細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較

5組侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，F(xiàn)OXC1組侵襲細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組侵襲細(xì)胞數(shù)下降(P<0.05)；且FOXC1+五味子素組侵襲細(xì)胞數(shù)低于FOXC1組，高于五味子素組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組HCT116細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.4 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)水平

5組HCT116細(xì)胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，F(xiàn)OXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)水平升高，E-cad-herin mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)水平降低，E-cadherin mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)水平低于FOXC1組，高于五味子素組，且E-cadherin mRNA表達(dá)水平高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表4。

表4 各組HCT116細(xì)胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA表達(dá)水平

注：×200，A：對照組；B：FOXC1-NC組；C：FOXC1組；D：五味子素組；E：FOXC1+五味子素組

2.5 FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin蛋白表達(dá)水平

5組HCT116細(xì)胞FOXC1、E-cadherin、MMP2、Vimentin 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組、FOXC1-NC組比較，F(xiàn)OXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)；與對照組比較，五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；FOXC1+五味子素組FOXC1、MMP2、Vimentin蛋白表達(dá)水平低于FOXC1組，高于五味子素組，且E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于FOXC1組，低于五味子素組(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組HCT116細(xì)胞FOXC1、MMP2、Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)水平

3 討論

目前研究認(rèn)為CRC是環(huán)境、遺傳、飲食習(xí)慣、生活方式等多因素協(xié)同作用的結(jié)果，mi RNA基因突變或擴(kuò)增，致使致癌信號激活，細(xì)胞發(fā)生惡變，產(chǎn)生大量利于自身生長的趨化因子，不加干預(yù)會不斷惡化、轉(zhuǎn)移，手術(shù)、化療雖可延長患者生存時間，但手術(shù)存在腫瘤分期限制，化療存在耐藥性及毒副作用，整體生存率仍有待提高[7]，因此深入探索其他CRC治療機(jī)制十分必要。

注：A：對照組；B：FOXC1-NC組；C：FOXC1組；D：五味子素組；E：FOXC1+五味子素組

五味子素來源于木蘭科植物五味子，前期學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物活性，如有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)，五味子素B可轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR4信號，減少神經(jīng)元凋亡，以保護(hù)神經(jīng)；另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[9]五味子素B可增強(qiáng)多西他賽的抗腫瘤作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。隨著臨床的應(yīng)用逐漸發(fā)現(xiàn)，五味子素系列在腫瘤方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢，研究表明[10]五味子素A可下調(diào)miR-155水平，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，且有研究發(fā)現(xiàn)[11]五味子素B能誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡，具有潛在藥理作用。而五味子素對CRC細(xì)胞的凋亡、侵襲能力影響尚不清楚。本研究采用不同濃度五味子素處理CRC HCT116細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同濃度五味子素可不同程度降低細(xì)胞存活率，提示五味子素可降低HCT116細(xì)胞活性。為進(jìn)一步評估五味子素對各組HCT116細(xì)胞的凋亡、侵襲影響，本研究采用流式細(xì)胞儀測定HCT116細(xì)胞凋亡情況，Transwell實(shí)驗測定細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染FOXC1后，細(xì)胞凋亡率低于對照組、FOXC1-NC組，侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組、FOXC1-NC組，提示過表達(dá)FOXC1可抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力；在過表達(dá)FOXC1后使用五味子素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)FOXC1+五味子素組細(xì)胞凋亡率低于五味子素組，而侵襲細(xì)胞數(shù)高于五味子素組，提示五味子素抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞侵襲，可能與降低FOXC1表達(dá)有關(guān)。

FOXC1定位于染色體6p25上，是FOX家族重要一員，已被證實(shí)在肝癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞生物學(xué)行為，與細(xì)胞遷移、侵襲、耐藥性密切相關(guān)[12-14]。Seong-Hoon Yun等[15]國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OUP-TFII敲低可上調(diào)FOXC1表達(dá)，促進(jìn)大腸癌細(xì)胞增殖與侵襲；而劉健等[16]學(xué)者研究顯示，F(xiàn)OXC1可直接與靶基因整聯(lián)蛋白α7、成纖維細(xì)胞生長因子受體4結(jié)合，激活其表達(dá)，促進(jìn)直腸癌轉(zhuǎn)移。上述表述提示FOXC1與CRC發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，本研究進(jìn)一步進(jìn)行Realtime-PCR及Western blot檢測，分析各組細(xì)胞FOXC1及其下游基因mRNA、蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1組FOXC1、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平高于對照組、FOXC1-NC組，E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平低于對照組、FOXC1-NC組，而五味子素組上述表達(dá)水平相反，而FOXC1+五味子素組則可部分逆轉(zhuǎn)五味子素對FOXC1及其下游E-cadherin、MMP2、Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平，以此驗證五味子素可下調(diào)FOXC1表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)mRNA、蛋白水平，進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲能力，促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。

綜上，F(xiàn)OXC1在CRC HCT116細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而五味子素可降低細(xì)胞活力，抑制其侵襲，可能與五味子素下調(diào)FOXC1表達(dá)及調(diào)節(jié)相關(guān)mRNA、蛋白表達(dá)有關(guān)，可為臨床基因靶向治療提供實(shí)驗依據(jù)，但本研究尚存一定局限性，需動物體實(shí)驗來驗證上述結(jié)論。