韓 雪， 黃 欣， 朱玲玲△， 范 明,△

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系， 北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認知科學(xué)研究室， 北京 100850)

氧糖剝奪對人臍靜脈內(nèi)皮細胞通透性的影響*

韓 雪1， 黃 欣2， 朱玲玲2△， 范 明1,2△

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系， 北京 100069； 2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所認知科學(xué)研究室， 北京 100850)

目的：建立體外氧糖剝奪模型模擬腦缺血缺氧損傷, 探討氧糖剝奪對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECS)屏障功能的影響。方法：細胞培養(yǎng)至完全融合后換成無糖培養(yǎng)基置于低氧手套箱(0.3% O2)分別處理0.5 h、1 h、2 h和4 h后, 利用CCk-8法檢測細胞存活，利用跨內(nèi)皮細胞電阻 (trans-endothelial electrical resistant, TEER)方法檢測HUVECs細胞通透性的變化，以及Western blot檢測緊密連接相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果：氧糖剝奪處理0.5 h、1 h、2 h和4 h后, HUVECs細胞存活率逐漸下降，TEER值逐漸降低，緊密連接蛋白Occludin、VE-cadherin的表達明顯降低。結(jié)論：氧糖剝奪破壞內(nèi)皮細胞間的緊密連接功能，增加HUVECs細胞的通透性，導(dǎo)致細胞的存活率明顯降低。

氧糖剝奪；緊密連接；通透性；HUVEC

【DOI】 10.12047/j.cjap.5407.2017.027

腦缺血發(fā)病率高，輕則影響患者的生活質(zhì)量，重則威脅患者的生命健康[1]。目前對于腦缺血損傷的預(yù)防和治療仍然缺少有效的手段和措施。以往的研究策略大多集中在保護神經(jīng)元，近年來“神經(jīng)-血管單元(neurovascular unit, NVU)”概念的提出，成為腦保護和可塑性研究的新關(guān)注點，靶向調(diào)節(jié)神經(jīng)-血管單元也是腦損傷修復(fù)的新策略[2]。NVU是指由神經(jīng)元、血腦屏障(blood brain barrier, BBB)、小膠質(zhì)細胞以及維持腦和神經(jīng)組織完整性的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)共同構(gòu)成的一個動態(tài)的結(jié)構(gòu)復(fù)合體，它也是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)細胞-細胞間

信號傳遞和細胞-基質(zhì)間相互作用的框架, 是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。研究發(fā)現(xiàn)：腦缺血損傷破壞血腦屏障，進而導(dǎo)致腦組織內(nèi)環(huán)境紊亂，引起神經(jīng)元功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死[3]。腦血管內(nèi)皮細胞是神經(jīng)血管單元重要的組成細胞，在腦缺血損傷過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，成為該過程中神經(jīng)保護的新靶點[4]。而腦血管內(nèi)皮細胞主要通過限制細胞旁轉(zhuǎn)運和跨細胞轉(zhuǎn)運來維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，其中由緊密連接蛋白限制的細胞旁轉(zhuǎn)運尤為重要。研究表明，缺血缺氧可激活VEGF、MMP2等導(dǎo)致緊密連接蛋白磷酸化，使其表達下調(diào)或重組[5,6,7]，可激活MMP9降解內(nèi)皮細胞細胞外基質(zhì)[8]，最終使其通透性降低。

目前常用于血腦屏障功能研究的內(nèi)皮細胞模型大多為大、小鼠來源的原代細胞或者細胞系[9,10]，缺少人源腦血管內(nèi)皮細胞。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)是具有完整的內(nèi)皮屏障功能的一種人源內(nèi)皮細胞，可以較好地模擬人源內(nèi)皮細胞的屏障功能，是一種理想的用于屏障功能研究的細胞模型。本研究旨在觀察體外模擬腦缺血損傷的氧糖剝奪模型中對HUVECs細胞內(nèi)皮屏障功能及細胞存活的影響，為研究血腦屏障在腦缺血的預(yù)防治療中的作用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、青鏈霉素購自Hyclone公司，無糖培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司，CCK-8購自Dojindo公司，anti-VE-cadherin購自eBioscience公司，anti-Occludin購自invitrogen公司，anti-β-actin購自Sigma公司，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)

HUVEC細胞系為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院施明老師惠贈。細胞培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，1%青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基。細胞在37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，平均3 d傳代。

1.3 氧糖剝奪細胞模型的建立

細胞隨機分成常氧對照組，氧糖剝奪組(低氧1 h組，低氧2 h組，低氧4 h組，總計4組)。培養(yǎng)3 d后細胞匯合約100%，低氧實驗組換成無糖無血清培養(yǎng)基放入低氧手套箱(COY laboratory products公司)，即在37℃、0.3%O2、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測細胞存活率

細胞隨機分成常氧對照組，氧糖剝奪組(按1.3分組)。將細胞接種于96孔板中，每組5個復(fù)孔，終密度為1×104cells/孔。氧糖剝奪處理后，每孔培養(yǎng)基100 μl，加入10 μl CCK-8，孵育4 h,于酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo公司)450 nm 波長處檢測吸光度(OD) 值。

1.5 跨內(nèi)皮細胞電阻(TEER值)的測定

細胞接種入insert小室(1 μm，6孔板，millipore公司)中，以未接種細胞僅在小室內(nèi)加入等量相同培養(yǎng)基的樣品為空白對照,培養(yǎng)3 d后細胞完全匯合，利用Millicell-ESR電阻儀(millipore公司)測TEER值，每個insert均取不同方向的3個點,每點重復(fù)測定3次,方法嚴格參照儀器說明書。TEER值是公認的測定內(nèi)皮細胞物理屏障功能最精確的工具。TEER值下降表明內(nèi)皮細胞通透性增加，屏障功能受損。TEER值(Ω·cm2)=(實驗組-空白組)×4.5 。

1.6 Western blot檢測緊密連接蛋白Occludin和介導(dǎo)細胞粘附連接的VE-cadherin蛋白表達

氧糖剝奪處理完畢的細胞，用預(yù)冷的PBS洗2遍，再刮下來移到1.5 ml EP管中，3 000 r/min 4℃離心5 min，棄上清，向細胞沉淀中加入含Cocktail(1∶50，Roche公司)的RIPA裂解液(普利萊公司)在冰上裂解30 min，再加入5×loading buffer，100℃煮10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。PBST 漂洗PVDF膜3次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗3次，每次10 min。將顯影液ECL加于PVDF 膜上，用保鮮膜將膜包好。暗室中在X 光膠片曝光，調(diào)整曝光時間，直至出現(xiàn)最佳條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 氧糖剝奪對HUVECs細胞存活的影響

隨著氧糖剝奪處理時間的延長，細胞邊界模糊，折光度較差, 細胞密度明顯減少，部分細胞發(fā)生皺縮。利用CCK-8法檢測氧糖剝奪后HUVECs細胞的存活率，結(jié)果顯示：與正常培養(yǎng)組比較，氧糖剝奪各處理組細胞存活率明顯降低，且隨著氧糖剝奪時間的延長細胞存活率逐漸降低，氧糖剝奪處理30 min，60 min和120 min的細胞存活率依次為85.2%±4.67%，80.88%±4.08%，71.20%±3.27%，較正常組均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1)。上述結(jié)果表明：氧糖剝奪對HUVECs細胞的損傷呈時間依賴性，隨著氧糖剝奪時間的延長，HUVECs細胞損傷越嚴重。

2.2 氧糖剝奪對HUVECs細胞通透性的影響

HUVECs細胞培養(yǎng)3 d后，TEER值穩(wěn)定至(93.5±2.78)Ω·cm2進行氧糖剝奪實驗，結(jié)果顯示:氧糖剝奪可導(dǎo)致HUVECs細胞TEER值以時間依賴性方式下降。與0 h(93.5±2.78Ω·cm2)相比, 氧糖剝奪0.5 h后, TEER值開始下降至(46.5±2.60)Ω·cm2, 氧糖剝奪4 h時降至最低水平(10.5±3.97)Ω·cm2, 氧糖剝奪各組較正常培養(yǎng)組細胞通透性均明顯減低, 具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01, 圖2)。以上結(jié)果表明：隨著氧糖剝奪時間的延長，HUVECs細胞TEER值逐漸降低；氧糖剝奪導(dǎo)致HUVECs細胞通透性升高，屏障功能受損。

Fig. 2 The effects of oxygen-glucose deprivation on transendothelial electrical resistance (TEER) of HUVECs (n=3) The permeability of HUVECs was assessed by TEER measurements**P<0.01vs0 h

2.3 氧糖剝奪后HUVECs細胞間緊密連接相關(guān)蛋白的表達降低

Western blot結(jié)果顯示，緊密連接蛋白Occludin的表達在OGD處理1 h后開始減弱，4 h下降最為明顯，較正常組具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。此外介導(dǎo)細胞粘附連接的VE-cadherin也隨著氧糖剝奪時間的延長而表達下降，OGD處理4 h后下降最為明顯，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05, 圖3)。上述結(jié)果表明：氧糖剝奪破壞HUVECs細胞間的緊密連接和粘附連接，增加細胞的通透性，破壞內(nèi)皮細胞的屏障功能。

3 討論

HUVECs細胞是人臍靜脈內(nèi)皮細胞。我們通過檢測其TEER值在100 Ω·cm2左右，與大多數(shù)目前發(fā)表的各種屬腦血管內(nèi)皮細胞的TEER值相當(dāng)，這說明該HUVECs細胞具有良好的屏障功能，并且HUVECs細胞具有純度高、穩(wěn)定性好、傳代快等諸多優(yōu)點。

血管通透性增加是腦血管病的重要病理變化, 研究表明：緊密連接蛋白Occludin連接細胞內(nèi)的細胞骨架，維持內(nèi)皮細胞間通透性，缺氧可激活VEGF等使Occludin磷酸化導(dǎo)致其功能受損，下調(diào)Occludin

Fig. 3 The effects of oxygen-glucose deprivation on protein expressions of HUVECs (n=3) A: The protein expressions of VE-cadherin and Occludin detected by Western blot. β-actin was used as an internal control; B: The quantitative analysis of VE-cadherin and Occludin*P<0.05vs0 h

表達，增加內(nèi)皮細胞通透性[11]。而緊密連接的形成同時也依賴粘附連接的存在。粘附連接蛋白VE-cadherin通過和胞內(nèi)β-catenin相互作用維持細胞結(jié)構(gòu)[12]，VEGFR2的激活介導(dǎo)VE-cadherin內(nèi)吞和降解，下調(diào)其表達影響正常功能[13]，最終降低內(nèi)皮細胞通透性。本研究發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪影響HUVECs的存活及屏障功能，其通透性的變化尤為明顯，Western blot結(jié)果表明緊密連接蛋白Occludin及粘附連接蛋白VE-cadherin在氧糖剝奪后均表達下調(diào)，尤其在4 h后最明顯，說明Occludin和VE-cadherin的下調(diào)破壞內(nèi)皮細胞的屏障功能。同時研究表明緊密連接相關(guān)蛋白可通過重排及表達下調(diào)影響內(nèi)皮細胞的形態(tài)及其存活[14,15,16]，本實驗發(fā)現(xiàn)HUVECs的TEER值變化與細胞存活趨勢相似，且蛋白表達的顯著下調(diào)發(fā)生在氧糖剝奪4 h后，推測該緊密連接相關(guān)蛋白的重排在這其中也發(fā)揮重要作用。因此，探討氧糖剝奪模型下內(nèi)皮細胞屏障功能的變化及其作用機制對于腦缺血損傷屏障功能的通透性研究具有重要的意義。

綜上所述, 本實驗證明氧糖剝奪可以引起HUVECs細胞通透性升高, 細胞存活率降低，其機制為緊密連接蛋白Occludin和粘附連接蛋白VE-cadherin表達下調(diào); 這些提示氧糖剝奪抑制內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白的表達，增加其細胞通透性，進而導(dǎo)致細胞的死亡。本研究為腦缺血損傷后血腦屏障通透性的研究提供理想的細胞模型和實驗方法，為深入探討腦缺血損傷后細胞緊密連接及其對通透性的研究提供依據(jù)。

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Effects of oxygen-glucose deprivation on the permeability of human umbilical vein endothelial cells

HAN Xue1, HUANG Xin2, ZHU Ling-ling2△, FAN Ming1,2△

(1. Department of Neurobiology， Capital Medical University, Beijing 100069;2. Department of Cognitive Science, Beijing Institute of Basic Medical Science， Beijing 100850, China)

Objective: To investigate the effects of oxygen-glucose deprivation (OGD) on the functions of blood-brain barrierinvitro, we established an OGD model to mimic cerebral ischemic injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods: Cells were cultured in DMEM without glucose under hypoxic conditions (0.3% O2) for different time point. The survival rate of HUVECs was detected by CCK-8 assay. The permeability of HUVECs was measured by epithelial volt-ohm meter. The expression of tight junction protein was detected by Western blot analysis. Results: In OGD group, the survival rate of HUVECs was obviously decreased. The permeability of HUVECs also decreased in OGD-treated cells. And the expression of tight junction protein was reduced after OGD treatment. Conclusion: Our data indicate that OGD treatment disrupt the barrier function of tight junctions and increase permeability of HUVECs and finally accelerated cell death.

oxygen-glucose deprivation; tight junction; permeability; HUVEC

2016-03-29

2016-11-25

R743.31；R364.4

A

1000-6834(2017)02-105-04

△【通訊作者】Tel: 010-66931315; E-mail: fanmingchina@126.com; linglingzhu@hotmail.com