劉嬌妍 朱嘉慧 肖浩揚 麥淑桃 李琳 王麗敏 唐輝武

摘要：一個未知功能的水稻（Oryza sativa L.）MYB轉錄因子Os01g0853700被克隆，并對其進行系統(tǒng)進化分析和表達分析。結果表明，Os01g0853700與單子葉植物Os01g0853700同源蛋白具有更近的親緣關系，與雙子葉植物Os01g0853700同源蛋白具有相對較遠的親緣關系。組織表達分析結果表明，Os01g0853700在水稻根、莖、葉和幼穗中均有表達，在葉片中表達水平最高。激素處理響應表達分析結果表明，Os01g0853700對脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellicacid，GA）、生長素（indoleaceticacid，IAA）、多效唑（paclobutrazol，PAC）等激素處理的響應表達均達到顯著差異水平。脅迫處理響應表達分析結果表明，Os01g0853700對低溫（4 ℃）、高溫（42 ℃）、鹽脅迫及干旱處理的響應表達均達到顯著差異水平。由此推測，Os01g0853700可能參與水稻激素和逆境脅迫響應。本研究結果可為后續(xù)Os01g0853700轉錄因子的功能研究提供參考。

關鍵詞：水稻；MYB轉錄因子；表達分析；植物激素；非生物脅迫

中圖分類號：S511.01；Q786? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）23-0028-07

MYB轉錄因子在植物中普遍存在，并且在植物的生長發(fā)育和代謝調控中起著重要的作用，如細胞形態(tài)建成、次級代謝調控以及生物和非生物脅迫的應答等。MYB轉錄因子的N端存在一類高度保守的結構域——R結構域，它是一種由約50個氨基酸組成的折疊蛋白，其中包含了一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。在與DNA的結合過程中，氨基酸殘基以螺旋-轉角-螺旋（HTH）的形式參與其中。間隔序列在每隔18個氨基酸的位置上形成1個疏水核心，對HTH構型的維持至關重要［1-2］。MYB轉錄因子根據(jù)其所含的R結構域數(shù)量分為4個亞類。其一是含有單一R結構域的MYB蛋白，也稱為1R-MYB/MYB-related，屬于端粒結合蛋白，對于維持染色體穩(wěn)定性具有重要作用［2］。其二是含有2個R結構域的MYB轉錄因子亞類，被稱為R2R3-MYB蛋白。在植物中，這是最常見的一類蛋白，在細胞分化、激素應答、次生代謝等方面具有重要作用，此外還參與環(huán)境脅迫以及抵抗病蟲侵害的響應［3］。其三是含有3個R結構域的MYB轉錄因子。研究表明，該轉錄因子與真菌中的3R-MYB蛋白存在較近的同源關系，同時調節(jié)細胞周期和細胞分化過程，參與植物對逆境的耐受性調節(jié)［4］。其四是含有4個R結構域的MYB轉錄因子，這些蛋白擁有4個與R1/R2結構相似的重復，因此被稱為 4R-MYB 蛋白［5-6］。然而，這個亞類只在諸如擬南芥、葡萄和楊樹等植物中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)基因。目前對于這個結構的研究還很有限，其功能尚不十分清晰［7］?？傊琈YB轉錄因子是一類具有不同R結構域數(shù)量的蛋白，它們在調控基因轉錄、細胞分化、激素應答、次生代謝以及逆境響應等方面發(fā)揮著重要作用。每個亞類的蛋白在功能和調節(jié)機制上都有所不同，但它們共同構成了一個復雜而多樣化的調控網絡。MYB轉錄因子參與植物的生長發(fā)育、代謝調控和調節(jié)植物對生物和非生物脅迫的應答［8-9］。目前對水稻MYB家族基因的功能有了一定的研究，MYB轉錄因子OsPHR1、OsPHR2和OsPHR3調控水稻根的生長，任何一個功能缺失均會減弱主根根毛生長，而過表達任何一個則會導致莖部磷（P）積累［10］。OsMYB36a、OsMYB36b和OsMYB36c協(xié)同調控水稻根內皮層木質素沉積、凱氏帶的形成，并在根的養(yǎng)分選擇性吸收中扮演著重要角色［11］。水稻MYB家族的CTMyb1能通過結合蛋白酶基因（Rep1）啟動子的CARE元件，參與調控赤霉素誘導的Rep1的表達［12］。此外，MYB轉錄因子在葉綠素降解調控和鹽脅迫響應方面也有重要作用，OsRL3在黑暗誘導衰老以及鹽脅迫條件下顯著表達。同時，OsRL3的表達受脫落酸的誘導，且突變體osrl3對外源ABA的敏感性低于野生型。說明MYB轉錄因子OsRL3可通過ABA信號途徑調控葉片衰老和鹽脅迫響應［13］。OsMYB30在水稻耐冷性方面有重要作用，敲除OsMYB30基因，突變體耐冷性增強；過表達OsMYB30基因，突變體耐冷性減弱［14］，同時還發(fā)現(xiàn)過表達OsMYB30增強了稻瘟病抗性，而敲減OsMYB30會降低稻瘟病抗性，表明OsMYB30正調控免疫反應［15］。OsMYB30還能激活木質素和肉桂酸合成，增強水稻的免疫反應，包括對真菌和細菌的抗性［16］。OsMYB22是茉莉酸信號通路的關鍵組成部分，能直接與幾丁質結合蛋白基因OsCEBiP的啟動子結合，并與OsMYC2互作，協(xié)同激活OsCEBiP的表達，參與調控水稻對稻瘟病菌的基礎抗性［17］。

盡管水稻中已有若干MYB轉錄因子的功能被報道，但是該基因家族成員眾多，還有很多基因的功能依然未知。本研究鑒定到一個新的編碼MYB轉錄因子的基因Os01g0853700。通過生物信息學技術，分析該基因的理化性質和結構，構建系統(tǒng)進化樹，并利用qRT-PCR技術檢測不同條件下Os01g0853700的表達模式，旨在探討Os01g0853700的蛋白結構及進化關系、Os01g0853700在正常條件以及激素和非生物脅迫條件下的表達模式，為進一步研究該基因的功能提供理論支持和研究方向。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本試驗以粳稻（Oryza sativa ssp. japonica）中花11（Zhonghua 11，ZH11）為供試材料。試驗時間為2022年3—5月，試驗地點為廣東省廣州市。

1.2 試驗處理和取樣

1.2.1 Os01g0853700的表達模式分析取樣

水稻幼苗在自然條件下使用木村B營養(yǎng)液［18］進行培養(yǎng)，在水稻幼苗生長至3～4葉期時，收集水稻的根組織樣品，用于Os01g0853700基因的組織表達分析。孕穗期分別取大田自然生長條件下的莖、葉和幼穗（2～3 cm）組織樣品，用于Os01g0853700基因的組織表達分析。每個試驗設置3次生物學重復。

1.2.2 植物激素處理、非生物脅迫處理及取樣

1.2.2.1 植物激素處理

將在光照培養(yǎng)箱中（光照和黑暗時間均為12 h，光照時溫度28 ℃，黑暗時溫度25 ℃）培養(yǎng)至3～4葉期的水稻幼苗分別移至含有各種植物激素的木村B營養(yǎng)液中進行處理。PAC、GA、IAA和ABA等激素的處理濃度為 0.01 mmol/L，除營養(yǎng)液中加入相應的激素外，處理時其他培養(yǎng)條件與之前的培養(yǎng)條件均一致，分別于處理后 0、1、2、8、24 h收取水稻葉片。

1.2.2.2 非生物脅迫處理

將在光照培養(yǎng)箱中（光照和黑暗時間均為12 h，光照時溫度28 ℃，黑暗時溫度25 ℃）培養(yǎng)至3～4葉期的水稻幼苗分別轉移到含有0.2 mol/L NaCl、20% PEG-6000的水培營養(yǎng)液中，并在42 ℃和4 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行處理，處理0、1、2、8、24 h時進行取樣。處理時其他培養(yǎng)條件與之前的培養(yǎng)條件均一致。

1.3 RNA提取和qRT-PCR擴增

1.3.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

利用TRIzol試劑將細胞或組織破碎，并與RNA結合形成復合物，然后通過乙醇沉淀將RNA分離出來，再根據(jù)南京諾唯贊生物科技公司的反轉錄試劑盒（Vazyme，R312-01）說明書的操作步驟，進行反轉錄合成cDNA的第1鏈。

1.3.2 qRT-PCR分析

根據(jù)Os01g0853700的CDS序列，設計qRT-PCR特異引物MYB-F/MYB-R（表1），以水稻Actin1作為內參基因。采用ABI PRISM 7500HT實時熒光定量PCR儀檢測Os01g0853700的表達量，根據(jù)南京諾唯贊生物科技公司的qRT-PCR試劑盒（Vazyme，Q711-02）說明書配置反應體系。反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品均設置3個技術重復，采用2-ΔΔCT計算Os01g0853700的相對表達量。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取Os01g0853700的編碼區(qū)和氨基酸序列。利用MEGA 7.0的ClustalW軟件進行氨基酸序列多重比對，再使用近鄰法構建系統(tǒng)進化樹。同時，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析工具對Os01g0853700的啟動子序列（起始密碼子ATG上游2 000 bp的基因組序列）進行順式作用元件分析。

2 結果與分析

2.1 Os01g0853700基因及蛋白結構分析

通過NCBI網站比對分析顯示，Os01g0853700基因包含2個外顯子、1個內含子，編碼區(qū)全長900 bp，共編碼299個氨基酸。Os01g0853700包含2個高度保守的SANT結構域（圖1），屬于含有2個R結構域的MYB轉錄因子亞類、R2R3-MYB蛋白。

2.2 Os01g0853700同源蛋白序列比對及進化分析

將Os01g0853700與其他植物的同源蛋白進行氨基酸序列比對，結果顯示，Os01g0853700與其他同源蛋白在47～259位之間的氨基酸高度相似（圖2）。構建的Os01g0853700及其同源蛋白的系統(tǒng)進化樹表明，Os01g0853700與沼生菰（Zizania palustris）的同源蛋白聚為一支，與小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）和稷（Panicum miliaceum）的同源蛋白的親緣關系相對較近；與毛地黃（Digitaria exilis）、黃桐（Endospermum chinense）、大麥草（Hordeum secalinum）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的同源蛋白親緣關系相對較遠（圖3）。

2.3 Os01g0853700基因啟動子區(qū)域的順式作用元件分析

將Os01g0853700起始密碼子ATG上游 2 000 bp 的基因組序列設置為該基因的啟動子序列，然后利用PlantCARE在線分析軟件對Os01g0853700的啟動子序列進行順式作用元件分析。結果表明，Os01g0853700的啟動子區(qū)域存在23個脫水響應元件、11個光響應元件、3個低溫響應元件、1個水楊酸響應元件、3個熱激響應元件、3個MYB轉錄因子結合的相關元件和1個脫落酸響應元件（表2）。

2.4 Os01g0853700的表達分析

2.4.1 Os01g0853700表達模式分析

為了分析Os01g0853700的表達模式，本研究提取了ZH11苗期的根以及孕穗期的莖、葉和幼穗的總RNA，并利用qRT-PCR進行檢測。結果（圖4）顯示，Os01g0853700在水稻根、莖、葉和幼穗中均有表達，但在葉片中的表達水平相對較高。

2.4.2 外源激素處理對Os01g0853700的表達影響分析

為了研究Os01g0853700對激素的響應特征，本試驗分別檢測不同激素處理下水稻葉片中Os01g0853700的表達水平。結果表明，脫落酸（ABA）處理后，Os01g0853700的表達水平呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢；處理24 h時，Os01g0853700的表達水平達到最低（圖5-A）。赤霉素（GA）處理2 h時，Os01g0853700的表達水平呈現(xiàn)最高狀態(tài)，隨后有所下降（圖5-B）。生長素（IAA）處理后，Os01g0853700的表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；處理2 h時，Os01g0853700的表達水平達到峰值（圖5-C）。多效唑（PAC）處理后，Os01g0853700的表達量總體呈現(xiàn)上升的趨勢；在處理24 h時表達水平相對最高（圖5-D）。說明Os01g0853700受以上4種激素誘導表達。

2.4.3 逆境脅迫處理對Os01g0853700基因的表達影響分析

啟動子順式作用元件分析表明，Os01g0853700啟動子區(qū)域存在多個與逆境脅迫響應相關的元件，推測Os01g0853700基因可能參與水稻逆境脅迫響應。因此，對水稻幼苗進行低溫、干旱、鹽害和高溫脅迫處理，并檢測Os01g0853700的表達變化。結果表明，低溫處理后，水稻葉片中Os01g0853700的表達水平呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，處理24 h時的表達水平達到最高（圖6-A）。

PEG-6000處理24 h時，水稻葉片中Os01g0853700的表達量達到最大值（圖6-B）。NaCl處理后，Os01g0853700的表達水平呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，處理8 h時，Os01g0853700的表達量達到最高（圖6-C）。高溫處理后，Os01g0853700的表達量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，在處理24 h時表達水平最高（圖6-D）。說明Os01g0853700的表達受低溫、高溫、干旱和鹽脅迫誘導。

3 結論與討論

MYB蛋白在多種生物中呈現(xiàn)出多種多樣的細胞功能［19-20］。本研究克隆了1個新的水稻MYB基因家族成員Os01g0853700，其編碼的氨基酸序列包含2個MYB蛋白家族典型的結構域（圖1），具有MYB蛋白家族成員的典型基序。系統(tǒng)進化分析表明，Os01g0853700轉錄因子與單子葉植物物種中MYB102同源蛋白具有更近的親緣進化關系，與雙子葉物種中MYB102同源蛋白具有相對較遠的進化關系（圖3），形成了有明顯差異的亞類分枝，推測MYB102蛋白在物種進化過程中被選擇。Os01g0853700[JP+1]啟動子區(qū)域存在多個與水稻生長發(fā)育和逆境脅迫相關的順式作用元件（表2），說明Os01g0853700可能參與水稻相關細胞活動的調控。

研究表明，植物的激素和非生物脅迫對MYB基因家族的調控起著重要作用［21］。以鹽脅迫為例，研究發(fā)現(xiàn)，OsMYB2基因的表達在鹽脅迫下上調，這表明OsMYB2轉錄因子對鹽脅迫具有響應能力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)高表達OsMYB2基因的水稻品種種子在ABA的誘導下表現(xiàn)出更高的萌發(fā)敏感性，這進一步說明ABA參與了水稻OsMYB2基因對鹽脅迫的響應機制［22］。有研究表明，編碼水稻MYB家族轉錄因子的基因OsMPS也受到鹽脅迫和ABA的誘導，但其表達受到赤霉素和生長素的抑制［23］。本研究中的植物激素響應表達分析結果顯示，在不同激素處理（ABA、GA3、IAA、PAC）下，葉片中Os01g0853700的表達量均與對照達到顯著差異水平，這說明Os01g0853700可能參與多種激素調控響應（圖5）。同時，Os01g0853700的表達受鹽脅迫誘導（圖6-C），說明Os01g0853700可能通過上述激素信號轉導途徑參與鹽脅迫響應。MYB轉錄因子中OsMYB4、OsMYB3R-2、OsMYBS3參與水稻冷脅迫響應［24-26］。OsMYBR1、OsMYB6參與水稻干旱脅迫響應［27-28］。Os01g0853700的表達在低溫、高溫和干旱脅迫中出現(xiàn)顯著變化，推測Os01g0853700可能參與水稻逆境脅迫響應（圖6）。

MYB轉錄因子在各物種細胞活動中必不可少，本研究克隆了水稻MYB轉錄因子家族基因Os01g0853700，并了解其蛋白的演化關系、蛋白結構域和保守基序、基因啟動子順式作用元件等，鑒定了Os01g0853700的組織表達模式、激素和脅迫處理的響應表達模式，為后續(xù)通過其他方式驗證Os01g0853700及其同源基因的功能提供了研究方向和科學依據(jù)。

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