肖仲久，劉 婷，錢正敏，李小霞，楊 澤，陸錚錚，宋培勇，陳模芳

1.遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，貴州遵義 563002；2.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院（食品科技學(xué)院），貴州遵義563002；3.貴州省赤水河流域植物資源保護(hù)與應(yīng)用特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563002

Beltraniella由 SUBRAMANIAN[1]在馬德拉斯（印度港市）從枯死的厚皮樹Odina wodierRoxb.[≡Lannea coromandelica(Houtt.) Merr.]的葉片上獲得菌株，以B.odinaeSubram.為模式種建立的。目前該屬在 Index Fungorum中共有 29個(gè)種被記錄，其中B.porosaPiroz.& S.D.Patil [≡Porobeltraniella porosa(Piroz.& S.D.Patil) Gusm?o]和B.patiliiK.G.Karand.& Patw.[≡Porobeltraniella patilii(K.G.Karand.& Patw.)Gusm?o]2個(gè)種的分生孢子最寬處有圓形孔帶，因此 FERNANDO等[2]將這 2個(gè)種移入PorobeltraniellaGusm?o中，現(xiàn)今Belraniella有效種共 27個(gè)。該屬典型特征如下：剛毛狀分生孢子梗的隔膜處易產(chǎn)生側(cè)向分枝，分枝可進(jìn)一步分支形成產(chǎn)孢細(xì)胞或分離細(xì)胞，其上以頂側(cè)生方式產(chǎn)生鼻甲或倒圓錐形，0個(gè)隔膜，光滑，半透明至淺褐色，具明顯透明橫帶的分生孢子。該屬產(chǎn)孢方式及分生孢子的形狀與BeltraniaPenz.、BeltraniopsisBat.& J.L.和Porobeltraniella相似，Beltrania的分生孢子梗產(chǎn)生于剛毛的基部細(xì)胞或單獨(dú)的放射狀淺色細(xì)胞，分生孢子雙錐形，頂端常具透明絲狀附屬物；Beltraniopsis不分枝或分枝的剛毛狀分生孢梗產(chǎn)生不對稱雙錐形且頂端具短喙的分生孢子；Porobeltraniella不育的側(cè)剛毛上產(chǎn)生產(chǎn)孢裝置（產(chǎn)孢細(xì)胞），其上產(chǎn)生具透明、多個(gè)赤道孔的分生孢子[2-4]。

Subulispora由TUBAKI等[5]在日本的長尾栲（Castanopsis cuspidataSchottky var.sieboldii）獲得菌株，以S.procurvataTubaki作為模式種建立，隨后在瓜達(dá)爾卡納島、坦桑尼亞、肯尼亞、印度、巴西和中國臺(tái)灣等有報(bào)道。目前該屬在 Index Fungorum中有16個(gè)種，其中S.hareaeB.Sutton因分生孢子鏈生，KIRK[6]將S.hareae[≡Polyscytalum hareae(B.Sutton) P.M.Kirk]移入PolyscytalumRiess中；而S.gracile(Matsush.) de Hoog和S.variabilede Hoog分生孢子梗的薄壁、透明，CASTA?EDA 等[7]將這 2個(gè)種移入CylindrosympodiumW.B.Kendr.& R.F.Casta?eda中，故該屬目前共有13個(gè)有效種。該屬典型特征如下：粗大，褐色，曲膝延伸，具明顯鋸齒形的分生孢子梗頂生單生，蒼白色，錐形或圓柱形，直或彎曲，基部平截，具0或多個(gè)隔膜的分生孢子。Subulispora在產(chǎn)孢方式及分生孢子形狀上與Cylindrosympodium、Polyscytalum、MirandinaG.Arnaud ex Matsush.和ParasympodiellaPonnappa四個(gè)屬相似，其中Cylindrosympodium分生孢子梗半透明至透明；Polyscytalum分生孢子梗合軸式延伸，但具不明顯鋸齒，分生孢子鏈生；Mirandina分生孢子梗頂部區(qū)域膨大、聚集圓柱形小齒，分生孢子紡錘形；Parasympodiella分生孢子梗以體生式方式產(chǎn)生鏈生分生孢子。

Beltraniella和Subulispora隸屬于暗色絲孢菌（dematiaceous hyphomycetes），該類群真菌在自然生態(tài)系統(tǒng)中對木質(zhì)素、纖維素降解，物質(zhì)和能量循環(huán)轉(zhuǎn)化及在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡中具有重要的生態(tài)學(xué)作用[8-10]。因此，目前深入系統(tǒng)地開展暗色絲孢真菌的鑒定，對豐富我國該類真菌資源及后續(xù)對該類真菌開展降解有機(jī)物、維持生態(tài)系統(tǒng)平衡等研究均具有重要的支撐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2018—2019年7 —8月、10—12月，采集貴州省習(xí)水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)和貴州省寬闊水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的不同生境下的凋落枯枝落葉（腐爛適中），標(biāo)注采集地、時(shí)間、基質(zhì)（可辨認(rèn)）、海拔和經(jīng)緯度等。

1.2 方法

將采集的凋落枯枝裁剪成6~7 cm小段，置入鋪有濕潤吸水紙的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)（落葉可整片保濕在磁盤內(nèi)），不定期保濕，25℃培養(yǎng)，以備鏡檢。將上述凋落枯枝落葉置于SMZ 745T體視顯微鏡下，用細(xì)挑針挑取菌株制成臨時(shí)玻片，在Eclipse E200生物顯微鏡下選取合格的臨時(shí)玻片制成永久玻片；隨后在 ECLIPSE Ni微分干涉顯微鏡和SMZ745T體視顯微鏡下分別根據(jù)菌株的形態(tài)大小和基質(zhì)上菌落大小在相應(yīng)的倍數(shù)下拍照，用Image-Pro Plus 5.0軟件和Adobe Photoshop CS6進(jìn)行測量及組圖，通過查閱相關(guān)資料，結(jié)合菌株形態(tài)特征及相關(guān)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行屬、種的形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離成功的菌株進(jìn)行基因組 DNA提取[真菌基因組 DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司]，選擇引物 ITS4/ITS5和28S1/28S3[11]；使用 50 μL的 PCR反應(yīng)體系，包括正反向引物各 2 μL，DNA 模板 2 μL，2×PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增 ITS 的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火50 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將獲得的DNA溶液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。序列剪接使用Chromas軟件，序列對比使用 NCBI中的Blast工具。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用Mega X的ML（maxium likelihood）法，自展重復(fù)次數(shù)設(shè)置為 1000。參與分析的序列包括自測序列（其DNA序列均提交至GenBank）和GenBank中下載的相似屬和同屬相似種的序列（表1和表2）。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的菌株及GenBank登錄號(hào)Tab.1 Strains used in phylogenetic analyses and their corresponding GenBank accession numbers

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的菌株及GenBank登錄號(hào)Tab.2 Strains used in phylogenetic analyses and their corresponding GenBank accession numbers

2 結(jié)果與分析

2.1 可育小貝氏孢（Beltraniella fertilis Heredia, R.M.Arias, M.Reyes & R.F.Casta?eda）

在腐爛的枯葉上腐生。有性態(tài)：未發(fā)現(xiàn)。無性態(tài)：菌落腐生在葉片的兩面，舒展，薄壁，灰褐色；在PCA培養(yǎng)基上，菌落最初白色，隨后變?yōu)榛疑粱液稚?。菌絲部分埋生在基質(zhì)內(nèi)，由具隔、分枝、壁光滑、半透明至淺褐色，寬1.5~2 μm的菌絲體組成。剛毛簡單，產(chǎn)生于放射狀、淺裂的基部細(xì)胞，寬6.5~15.5 μm，直立，直或稍彎曲，單生或少部分聚集，黑褐色，薄壁，0~3個(gè)隔膜，長57~125 μm，基部和頂部光滑，中下部具有稀疏的疣狀突起，中下部寬4~5 μm，頂部逐漸變細(xì)，淺褐色。分生孢子梗粗大，單生，具長的剛毛狀和短的非剛毛狀2種類型：長的剛毛狀的分生孢子梗產(chǎn)生于放射狀、淺裂的基部細(xì)胞，單生或小數(shù)聚生，直，7~12個(gè)隔膜，大小156~392 μm×4.5~8 μm，基部和頂部光滑，中下部具有稀疏的疣狀突起，厚壁，頂部區(qū)域分枝；短的非剛毛狀分生孢子梗分枝，0~2個(gè)隔膜，壁光滑，半透明至透明，薄壁，6~12 μm×3.5~5.5 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞多芽生，合生，端生，棍棒狀至圓柱形，頂端或亞頂端具小齒，淺褐色，6~12 μm×3~5 μm。分離細(xì)胞卵圓形或倒卵形，薄壁，光滑，透明，6.5~11 μm×3.5~5.5 μm，兩端各具一個(gè)小齒。分生孢子直接產(chǎn)生與產(chǎn)孢細(xì)胞上或產(chǎn)生于分離細(xì)胞上，遠(yuǎn)極端平截，近極端具喙?fàn)钔蛊?，光滑，赤道帶以上具半透明至淺橄欖色的橫帶，17~23 μm×5~7 μm（圖1）。

圖1 可育小貝氏孢（HMZNC0810）Fig.1 Beltraniella fertilis (HMZNC0810)

研究標(biāo)本：貴州省習(xí)水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，28°31′2.04″N，106°23′56.05″E，海拔 1033.9 m；基質(zhì)為廣玉蘭（Magnolia GrandifloraL.）凋落枯葉；2019年7月25日；標(biāo)本號(hào)為HMZNC0810。

Beltraniella所記錄的27個(gè)有效種中與菌株相似的種為B.fertilisHeredia, R.M.Arias, M.Reyes& R.F.Casta?eda、B.ramosiphoraC.G.Lin & K.D.Hyde和B.pseudoportoricensisCrous，其中B.ramosiphora的長分生孢子梗不分枝，且短的分生孢子梗較長（20~55 μm）[12]，B.pseudoportoricensis的分生孢子較長些（25~27 μm）[13]；而B.fertilis與本菌株相比分生孢子的長度（19~22 μm vs 17~23 μm）基本一致[14]，同時(shí)在剛毛、2種類型的分生孢子梗、分離細(xì)胞上也基部一致。從圖2可知，各菌株明顯分為2支，Beltraniella所供試菌株均在一個(gè)亞枝上，菌株（HMZNC 0810）與B.fertilis的親緣關(guān)系最近，與Beltraniella的其他種能明顯分開；另外，菌株在形態(tài)與相似屬種也存在較大差異。結(jié)合形態(tài)特征和系統(tǒng)學(xué)分析，將菌株（HMZNC 0810）定為B.fertilis。B.fertilis在墨西哥韋拉克魯斯、泰國、巴西有報(bào)道，但在中國屬于首次報(bào)道，故將其定為中國新記錄種。

圖2 基于LSU和ITS序列對可育小貝氏孢構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.2 Phylogentic tree of Beltraniella fertilis generated based on combined LSU and ITS sequences

2.2 柱孢錐孢（Subulispora cylindrospora P.M.Kirk）

在枯枝上腐生。有性態(tài)：未發(fā)現(xiàn)。無性態(tài)：菌落舒展，薄壁，絨毛狀，灰褐色。菌絲部分埋生在基質(zhì)內(nèi)，由光滑、分枝、具隔、淺褐色菌絲體組成。分生孢子梗粗大，單生，直立，簡單，直或稍彎曲，上部具明顯的膝曲狀，呈“之”字形，褐色，頂部淺色，光滑，2~5個(gè)隔膜，大小33~78 μm×2.5~4.3 μm，基部寬 3~5.7 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞合生，端生，多芽生，合軸式延伸，具明顯的產(chǎn)孢痕。分生孢子單生，干質(zhì)，頂側(cè)生，光滑，透明，圓柱形，稍錐型，頂部鈍圓，基部平截，并具一個(gè)增厚、稍顯色素的疤痕，(2-) 5~6 (-8)個(gè)真隔膜，大小 34.7~77 μm×2~3 μm（圖3）。

圖3 柱孢錐孢（HMZNC0813）Fig.3 Subulispora cylindrospora (HMZNC0813)

研究標(biāo)本：貴州省寬闊水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，28°02′3.2″N，107°10′51.24″E；海拔 1103 m；基質(zhì)為未鑒定枯枝；2019年 7月 26日；標(biāo)本號(hào)為HMZNC0813。

Subulispora所記錄的13個(gè)有效種中，分生孢子為圓柱形且頂端無附屬物的種為S.minimaP.M.Kirk、S.africanaP.M.Kirk和S.cylindrosporaP.M.Kirk。S.minima的分生孢子梗較短（4~15 μm）且透明；S.africana的分生孢子隔膜數(shù)較少（3~4個(gè)），且較短（31~33 μm）；S.cylindrospora在分生孢子梗長度（24~68 μm）、分生孢子隔膜數(shù)（5個(gè)）及大小（37~56 μm）（Kirk 1985）與菌株基本一致[15-17]。HMZNC 0813菌株在PDA、PCA等不同培養(yǎng)基質(zhì)上進(jìn)行單孢分離，通過平板劃線分離法進(jìn)行分離純化，可能由于自然基質(zhì)上存在過多的雜菌、目的菌株數(shù)量較少、不集中、目的菌株上表面附帶其他菌類等原因，最終未獲得純菌種，但通過形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及測量數(shù)據(jù)，可將其明確定為S.cylindrospora。S.cylindrospora在國外肯尼亞有報(bào)道，但在中國未見報(bào)道，因此將該菌株定為中國新記錄種。

2.3 前彎錐孢（Subulispora procurvata Tubaki）

在枯枝上腐生。有性態(tài)：未發(fā)現(xiàn)。無性態(tài)：菌落生長在葉子的兩面，舒展，薄壁，絨毛狀，灰褐色；在PCA培養(yǎng)基上最初白色，后期灰色至灰褐色，而PCA的反面深褐色。菌絲部分埋生在基質(zhì)內(nèi)，由光滑、分枝、具隔、淺褐色，寬2~2.5 μm的菌絲體組成。分生孢子梗粗大，單生或少數(shù)聚生，直立或稍彎曲，上部明顯的膝曲彎曲，呈“之”字形，褐色，頂端淺色，光滑，具長和短2種類型：長的分生孢子梗 4~6個(gè)隔膜，大小 72~145(-179)μm×3~5 μm，產(chǎn)生于放射狀淺裂的基部細(xì)胞，寬9.3~15 μm；短的分生孢子梗0~2 (-3)的隔膜，42.5~52.5 μm×3~5 μm，產(chǎn)生于放射狀淺裂的基部細(xì)胞，褐色，寬 5~7 μm。產(chǎn)孢細(xì)胞合生，端生，多芽生，合軸式延伸，具明顯的產(chǎn)孢痕。分生孢子單生，干質(zhì)，頂側(cè)生，光滑，透明，錐形，0~3個(gè)隔膜，長25~33.5 μm（不包括附屬喙），平截的基部寬 2.2~3.5 μm，基部彎曲的頂端延伸形成一個(gè)細(xì)長的附屬喙，6~11.6 μm×0.8~1.1 μm（圖4）。

圖4 前彎錐孢（HMZNC0814）Fig.4 Subulispora procurvata (HMZNC0814)

研究標(biāo)本：貴州省寬闊水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，28°15′2.25″N，107°11′18.70″E，海拔 1314.5 m；基質(zhì)為未鑒定的凋落枯葉；2019年7月26日；標(biāo)本號(hào)為HMZNC0814。

Subulispora所記錄的 13個(gè)種中，在形態(tài)上分生孢子錐形、頂端不分枝且具一定程度彎曲的附屬絲的種為S.procurvataTubaki和S.longirostrataNawawi & Kuthub。S.longirostrata的分生孢子具較長的附屬絲（15~25 μm），在附屬絲的拐點(diǎn)上具弧形缺口[18]；S.procurvata的分生孢子梗長度（20~190 μm）、分生孢子的隔膜數(shù)（3個(gè)）、分生孢子大?。?8~40 μm）（不包含附著絲）等[18]特征基本與HMZNC 0814菌株一致，但模式種S.procurvata未提到有2種類型的分生孢子梗，本菌株形態(tài)上具明顯的2種類型的分生孢子。從圖5可知，各菌株明顯分為2支，Subulispora所供試的菌株均聚在一個(gè)亞分枝上，其中HMZNC 0814菌株和S.procurvata以94%進(jìn)化支持率聚為一分支，親緣關(guān)系最近，與Subulispora屬的其他種能明顯分開。結(jié)合形態(tài)特征和系統(tǒng)學(xué)分析，將HMZNC 0814菌株定為S.procurvata。S.procurvata在日本、巴西、澳大利亞、中國香港等有報(bào)道過，故將其定為大陸新記錄種。

圖5 基于LSU和ITS序列對前彎錐孢構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogentic tree of Subulispora procurvata generated based on combined LSUand ITS sequences