茯茶多糖的消化特性和體外免疫調(diào)節(jié)活性比較研究

袁旭霜, 慕妍璐, 王 凡, 薛原野, 孫玉姣

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

多糖是一類廣泛存在于多種動(dòng)植物及微生物中的生物大分子，通常由10個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成，具有多種生物活性[1].近年來，越來越多的研究表明，植物多糖屬于非消化性多糖，即可直接通過上消化道，最終到達(dá)盲腸和結(jié)腸中被腸道微生物消化利用[2-4].因此，利用體外消化模型研究多糖的性質(zhì)越來越受到關(guān)注.另外，茶多糖因具有多種生物活性而備受關(guān)注，包括抗氧化[5,6]、抗肥胖[7]、抗血糖[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等.免疫調(diào)節(jié)是天然多糖最重要的生物功效之一[10].近年來，許多體外和體內(nèi)的研究證實(shí)了茶多糖對(duì)免疫系統(tǒng)刺激有潛在的調(diào)節(jié)作用[11,12].

茯茶起源于陜西涇陽，屬于后發(fā)酵黑茶，由其特有的冠突散囊菌(“金花”)發(fā)酵，“金花”能夠影響茯茶的滋味香氣及營養(yǎng)[13].茯茶因具有多種保健功能和其獨(dú)特的風(fēng)味已被茶愛好者廣泛接受.目前已鑒定出茯茶中的主要成分包括多酚、多糖、酚酸、黃酮類化合物等[14]，但近年來對(duì)于茯茶的研究主要集中于多酚[15]，而多糖作為另一種生物大分子活性物質(zhì)研究較少.有研究報(bào)道，茯茶多糖是一種非消化性多糖[16]，具有抗氧化、抗肥胖、抗炎等活性，并可通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善潰瘍性結(jié)腸炎和緩解高脂膳食引起的肥胖[17,18].前期報(bào)道發(fā)現(xiàn)酸提茯茶多糖、水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖具有一定的抗氧化作用[5]，并通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)堿提茯茶多糖在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型中比水提茯茶多糖擁有更優(yōu)的免疫調(diào)節(jié)活性，其中腸道菌群發(fā)揮著重要作用[19].據(jù)此本研究使用酸提、水提和堿提等不同提取方法獲得茯茶多糖，研究三種茯茶多糖在模擬胃液和腸液中的消化特性和對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7免疫調(diào)節(jié)活性的影響，為深入探討茯茶多糖的免疫調(diào)節(jié)活性作用機(jī)制和對(duì)茯茶資源的深加工利用提供理論支撐.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

茯茶，購于陜西省涇陽茯茶鎮(zhèn)，粉碎后過60目篩，備用；RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞，購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所(中國，上海)；胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、四氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Triton X-100、對(duì)硝基苯磷酸、中性紅、脂多糖、對(duì)硝基苯磺酸，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽鹽、青鏈霉素混合液(100X)，購于北京索萊寶科技有限公司；DEME高糖培養(yǎng)基，購于美國Hyclone公司；四季青胎牛血清(FBS)，購于浙江天杭生物科技股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.2 主要儀器

T2600系列分光光度計(jì)，上海佑科儀器有限公司；LYZ恒溫?fù)u床，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；BXM-30R立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海圣科儀器公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BC-J160S二氧化碳培養(yǎng)箱，博訊科技有限公司；Varioskan flash全波長掃描多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；CKX53倒置顯微鏡，美國OLYMPUS公司；高效液相色譜儀配備2 414示差折光檢測器，日本島津公司；液相色譜柱TSK-gel G4000SW(7.5 mm × 30.0 cm)，日本Tosoh公司.

1.2 茯茶多糖的制備

茯茶多糖(FBTPs)根據(jù)之前報(bào)道的文獻(xiàn)[5]制備.根據(jù)之前的報(bào)道可知酸提茯茶多糖(Ac-FBTPs)、水提茯茶多糖(W-FBTPs)和堿提茯茶多糖(A-FBTPs)中性糖的含量分別是65.58%±1.66%、58.17%±0.19%和56.99%±0.34%；糖醛酸含量分別16.82%±1.36%、20.91%±1.07%和29.76%±0.83%；分子量分別為4.70×105±2.81 Da、4.78×105±1.92 Da和4.68×105±1.51 Da.

1.3 茯茶多糖的體外消化

1.3.1 茯茶多糖在體外模擬胃液中的消化

胃電解液的配制：NaCl(3.1 g/L)，KCl(1.1 g/L)，NaHCO3(0.6 g/L)，CaCl2·2H2O(0.15 g/L)，胃蛋白酶(350 mg/2L)，使用1M HCl調(diào)pH至2.0.

胃液的配制：取150 mL胃電解質(zhì)液加入35 mg胃蛋白酶以及1 mL CH3COONa(1 M pH5.0)，最終使用0.1 M HCl調(diào)pH至2.0.

模擬胃液消化：配制15 mL 8 mg/mL的多糖母液和15 mL胃液充分混勻，于37 ℃ 150 rpm分別反應(yīng)0、4 h和6 h后，迅速放置沸水浴中反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)，用于測定后續(xù)實(shí)驗(yàn)[16].

1.3.2 茯茶多糖在體外模擬腸液中的消化

小腸電解液的配制：NaCl(5.4 g/L)，KCl(0.65 g/L)，CaCl2·2H2O(0.33 g/L)，用0.1M NaOH調(diào)pH至7.0.

小腸液的配制：取100 g電解液加入13 mg胰酶蛋白酶、100 g胰酶(7% w/w)和200 g膽鹽(4% w/w)，攪拌均勻，最終使用0.1 M NaOH調(diào)pH至7.5.

模擬小腸液消化：取3.0 mL模擬小腸液與10.0 mL模擬胃液充分混勻，于37 ℃ 150 rpm分別反應(yīng)0、4 h和6 h后，迅速放置沸水浴中反應(yīng)5 min以終止反應(yīng)，用于測定后續(xù)實(shí)驗(yàn)[16].

1.3.3 茯茶多糖在體外模擬消化中總糖含量、還原糖含量和糖醛酸含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定消化液中總糖含量[20]；采用3,5-二硝基水楊酸法測定消化液中還原糖含量[21]；采用間羥聯(lián)苯法測定消化液中糖醛酸含量[22].

1.3.4 茯茶多糖在體外模擬消化中分子量的測定

根據(jù)高效凝膠滲透色譜法(HPGPC，High-performance size exclusion chromatography)分別測定不同提取方法獲得的茯茶多糖消化前和分別在胃液和腸液中消化6 h后分子量的變化情況[23].

1.4 茯茶多糖的體外免疫調(diào)節(jié)活性的研究

1.4.1 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW 264.7細(xì)胞使用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DEME高糖培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天進(jìn)行傳代.

1.4.2 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞活力的研究

采用MTT法[24]測定Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響.使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×105cell/mL，接種于無菌96孔板中培養(yǎng)(100 μL)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h.棄上清，分別加入100 μL不同濃度的FBTPs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL，由DEME培養(yǎng)基配制)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別以DEME培養(yǎng)基和10 μg/mL脂多糖(LPS)作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，孵育24 h.棄上清，每孔加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)，于37℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入200 μL DMSO，溫室振蕩10 min.酶標(biāo)儀于570 nm處測各孔的吸光度.細(xì)胞活力表示為：

細(xì)胞活力=樣品組吸光度值/空白組吸光度值

(1)

1.4.3 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的研究

采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)[24]測定Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的影響.使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×105cell/mL，接種于無菌96孔板中培養(yǎng)(100 μL)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h.棄上清，分別加入100 μL不同濃度的FBTPs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，由DEME培養(yǎng)基配制)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別以DEME培養(yǎng)基和10 μg/mL脂多糖(LPS)作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，孵育24 h.棄上清，每孔加入100 μL 0.1%中性紅生理鹽水溶液，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，使用PBS清洗數(shù)次至無色后，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液[1.0 M(冰乙酸∶乙醇=1∶1，(v/v)]，繼續(xù)培養(yǎng)1 h使細(xì)胞完全裂解.酶標(biāo)儀于540 nm處測各孔的吸光度.細(xì)胞吞噬指數(shù)表示為：

細(xì)胞吞噬指數(shù)=樣品組吸光度值/空白組吸光度值

(2)

1.4.4 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7酸性磷酸酶活力的影響

采用Suzuki等[25]的方法測定Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞酸性磷酸酶活力的影響.使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×105cell/mL，接種于無菌96孔板中培養(yǎng)(100 μL)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h.棄上清，分別加入100 μL不同濃度的FBTPs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，由DEME培養(yǎng)基配制)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別以DEME培養(yǎng)基和10 μg/mL脂多糖(LPS)作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，孵育24 h.棄上清，每孔依次加入25 μL 1% Triton X-100和150 μL 1 mg/mL對(duì)硝基苯磷酸溶液，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，每孔加入3.0 M 50 μL NaOH溶液終止反應(yīng).酸性磷酸酶活力指數(shù)表示為：

酸性磷酸酶活力指數(shù)=樣品吸光度值/空白組吸光度值

(3)

1.4.5 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7分泌一氧化氮含量的影響

采用Griess法[26]測定Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌一氧化氮(Nitric Oxide，NO)含量的影響.使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為3×105cell/mL，接種于無菌96孔板中培養(yǎng)(100 μL)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h.棄上清，分別加入100 μL不同濃度的FBTPs(25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL，由DEME培養(yǎng)基配制)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)分別以DEME培養(yǎng)基和10 μg/mL脂多糖(LPS)作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，孵育24 h，收集上清.將50 μL的細(xì)胞上清液加入新的96孔板中，依次加入50 μL GriessA試劑和50 μL GriessB試劑，振蕩混勻，酶標(biāo)儀于540 nm處測各孔的吸光度.使用亞硝酸鈉(NaNO2)溶液濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L(由DMEM培養(yǎng)基配制)作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其濃度和吸光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算出細(xì)胞上清液中所含NO的量.

1.5 數(shù)據(jù)處理

Microsoft Excel 2019處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)n=5，取平均值，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用LSD分析進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，P<0.05有顯著差異,并使用Origin 2019繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 茯茶多糖的體外消化

2.1.1 茯茶多糖在體外模擬胃液和腸液中的消化

三種茯茶多糖在模擬胃和小腸消化過程中總糖含量、還原糖含量和糖醛酸含量的變化見表1所示.

在模擬胃液消化中，酸提茯茶多糖(Ac-FBTPs)、水提茯茶多糖(W-FBTPs)和堿提茯茶多糖(A-FBTPs)在未消化(0 h)前總糖含量分別為3.59±0.82、3.43±0.84和3.46±0.84 mg/mL，消化6 h后總糖含量分別為3.59±0.82、3.52±0.85和3.49±0.83 mg/mL；Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在未消化前還原糖含量分別為0.16±0.00、0.22±0.01和0.23±0.01 mg/mL，消化6 h后還原糖含量分別為0.18±0.02、0.23±0.02和0.26±0.03 mg/mL；Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在未消化前糖醛酸含量分別為0.62±0.44、0.79±0.31和1.21±0.20 mg/mL，消化6 h后糖醛酸含量分別為0.71±0.41、0.86±0.35和1.19±0.22 mg/mL.結(jié)果表明Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在胃液消化前后總糖含量、還原糖含量和糖醛酸沒有發(fā)生顯著性變化，即三種多糖在胃中不被消化；

在模擬腸液消化中，Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在未消化(0 h)前總糖含量分別為3.18±0.95、3.22±0.93和3.27±0.88 mg/mL，消化6 h后總糖含量分別為3.21±0.93、3.22±0.93和3.19±0.95 mg/mL；Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在未消化前還原糖含量分別為0.14±0.01、0.19±0.01和0.21±0.01 mg/mL，消化6 h后還原糖含量分別為0.17±0.02、0.22±0.02和0.20±0.02 mg/mL；Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在未消化前糖醛酸含量分別為0.63±0.44、0.80±0.33和1.18±0.21 mg/mL，消化6 h后糖醛酸含量分別為0.69±0.40、0.84±0.34和1.16±0.21 mg/mL.結(jié)果表明Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs在腸液消化前后總糖含量、還原糖含量和糖醛酸沒有發(fā)生顯著性變化，即三種多糖在小腸中同樣不被消化.綜上所述，Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs能夠通過消化系統(tǒng)，不被模擬胃液和腸液消化，推測其可完全到達(dá)大腸，為腸道微生物利用.

2.1.2 茯茶多糖在體外模擬胃液和腸液中分子量的變化

(1)Ac-FBTPs在體外模擬胃液和腸液中分子量的變化

圖1表示Ac-FBTPs在未消化前、胃液消化6 h后及腸液消化6 h后分子量的分布情況.Ac-FBTPs在消化前后只有一個(gè)單一的對(duì)稱峰，隨著消化時(shí)間的增加，經(jīng)胃液和腸液消化后Ac-FBTPs峰的保留時(shí)間未發(fā)生偏移，表明胃液和腸液對(duì)Ac-FBTPs分子量沒有影響.

圖1 Ac-FBTPs體外模擬胃液消化6 h后的HPGPC色譜圖

(2)W-FBTPs在體外模擬胃液和腸液中分子量的變化

圖2表示W(wǎng)-FBTPs在未消化前、胃液消化6 h后及腸液消化6 h后分子量的分布情況.同樣，W-FBTPs在消化前后，隨著消化時(shí)間的增加，胃液和腸液消化后W-FBTPs峰的保留時(shí)間沒有顯著性差異，表明胃液和腸液對(duì)W-FBTPs分子量沒有影響.

圖2 W-FBTPs體外模擬胃液消化6 h后的HPGPC色譜圖

(3)A-FBTPs在體外模擬胃液和腸液中分子量的變化

圖3表示A-FBTPs在未消化前、胃液消化6 h后及腸液消化6 h后分子量的分布情況.與Ac-FBTPs和W-FBTPs類似，隨著消化時(shí)間的增加，胃液和腸液消化后A-FBTPs峰的保留時(shí)間一致，表明胃液和腸液對(duì)A-FBTPs分子量沒有影響.

圖3 A-FBTPs體外模擬胃液消化6 h后的HPGPC色譜圖

綜上所述，三種茯茶多糖在模擬胃液和腸液中分子量保留時(shí)間沒有發(fā)生顯著性變化，表明這三種多糖在消化系統(tǒng)中不被消化，這與前面測定結(jié)果保持一致.

2.2 茯茶多糖的體外免疫調(diào)節(jié)活性的研究

2.2.1 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

巨噬細(xì)胞的活力可以作為免疫激活的一個(gè)指標(biāo)[27].如圖4所示，不同濃度的Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs相較于空白對(duì)照，均能夠顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的細(xì)胞活力.其中LPS陽性處理對(duì)照與空白對(duì)照相比，RAW 264.7的細(xì)胞活力達(dá)到1.75；Ac-FBTPs濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL時(shí)與空白對(duì)照相比細(xì)胞活力分別達(dá)到1.62、1.58、1.54、1.49、1.51和1.48；W-FBTPs濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL時(shí)與空白對(duì)照相比細(xì)胞活力分別達(dá)到1.80、1.79、1.83、1.81、1.64和1.38；A-FBTPs濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL時(shí)與空白對(duì)照相比細(xì)胞活力分別達(dá)到2.05、1.90、1.90、1.89、1.73和1.42.結(jié)果表明，Ac-FBTPs、W-FBTPs及A-FBTPs均能顯著性提高巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力，W-FBTPs和A-FBTPs在濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)與空白對(duì)照相比，RAW 264.7細(xì)胞活力提升效果顯著(P<0.05).由此可知三種FBTPs對(duì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞增殖的順序是Ac-FBTPs

圖4 茯茶多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響(圖中不同字母代表顯著性差異(P<0.05))

2.2.2 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞在體內(nèi)通過吞噬作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，巨噬細(xì)胞受到免疫調(diào)節(jié)藥物刺激后，其吞噬功能會(huì)增強(qiáng)，因此測定巨噬細(xì)胞的吞噬功能可以評(píng)價(jià)藥物的免疫活性[24].如圖5所示，Ac-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞RAW 264.7的細(xì)胞吞噬能力相對(duì)于空白對(duì)照無顯著性差異(P>0.05)；W-FBTPs在各濃度下均有顯著提高細(xì)胞吞噬能力(P<0.05)，且當(dāng)濃度為25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞吞噬能力提升0.75倍；A-FBTPs在各濃度下均能夠顯著性提高細(xì)胞吞噬能力(P<0.05)，且濃度為50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞吞噬能力分別提升0.63、0.70和0.78倍.本研究發(fā)現(xiàn)A-FBTPs對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)效果優(yōu)于W-FBTPs.由此可知，三種FBTPs對(duì)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的順序是Ac-FBTPs

圖5 茯茶多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞吞噬能力的影響(圖中不同字母代表顯著性差異(P<0.05))

2.2.3 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活力的影響

酸性磷酸酶是巨噬細(xì)胞活化的一種信號(hào)酶，由溶酶體產(chǎn)生.巨噬細(xì)胞中酸性磷酸酶的活性隨著巨噬細(xì)胞的激活而增加[28].如圖6所示，當(dāng)Ac-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶活力分別增加0.24、0.48、0.37和0.62倍；當(dāng)W-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞酸性磷酸酶活力分別增加0.30、0.23、0.49和0.53倍；當(dāng)A-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞酸性磷酸酶活力分別增加0.32、0.43、0.40和0.26倍.結(jié)果表明，Ac-FBTPs、W-FBTPs和A-FBTPs均能夠顯著提高巨噬細(xì)胞RAW 264.7酸性磷酸酶活力(P<0.05)，且與陽性對(duì)照LPS提升效果媲美(0.43倍).此外，研究發(fā)現(xiàn)Ac-FBTPs、W-FBTPs及A-FBTPs對(duì)增加巨噬細(xì)胞RAW 264.7酸性磷酸酶活力組間沒有顯著性差異.

圖6 茯茶多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活力的影響(圖中不同字母代表顯著性差異(P<0.05))

2.2.4 茯茶多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7分泌NO的影響

研究表明NO水平的增加可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的免疫刺激活性[24].如圖7所示，當(dāng)Ac-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，NO的分泌量分別是3.00 μmol/L、7.09 μmol/L、5.98 μmol/L和3.83 μmol/L；當(dāng)W-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，NO的分泌量分別是8.77 μmol/L、6.35 μmol/L、4.72 μmol/L和5.17 μmol/L；當(dāng)A-FBTPs濃度為200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL時(shí)，NO的分泌量分別是2.79 μmol/L、1.87 μmol/L、6.52 μmol/L和2.36 μmol/L.其中濃度為100 μg/mL Ac-FBTPs、200 μg/mL和100 μg/mL W-FBTPs及50 μg/mL A-FBTPs對(duì)NO的分泌促進(jìn)效果顯著(P<0.05)，較空白對(duì)照分別提升了147.56%、206.37%和121.91%及127.68%.結(jié)果表明三種FBTPs能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO水平.

圖7 茯茶多糖對(duì)RAW 267.4細(xì)胞分泌NO的影響(圖中不同字母代表顯著性差異(P<0.05))

研究報(bào)道，水提茯茶多糖不能被唾液、模擬胃液和腸液所消化[16]，并發(fā)現(xiàn)純化后茯茶多糖組分在細(xì)胞水平上具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性[9].本研究發(fā)現(xiàn)通過酸提、水提和堿提等不同方法獲得的茯茶多糖同樣均不被模擬胃液和腸液消化，屬于非消化性多糖.通過對(duì)三種茯茶多糖在細(xì)胞水平上的免疫調(diào)節(jié)活性研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的酸提茯茶多糖、水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖均能夠提升細(xì)胞活力，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，提高細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活力及促進(jìn)NO的分泌水平，綜合分析發(fā)現(xiàn)水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖擁有更優(yōu)的免疫調(diào)節(jié)活性，可能是這二種茯茶多糖具有更高糖醛酸含量的原因[5].大量研究表明，糖醛酸的存在會(huì)更有效地提升多糖的生物活性[17,29].據(jù)此，后續(xù)將進(jìn)一步研究水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖的體外酵解中腸道菌群的組成和代謝，深入解剖茯茶多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制.

3 結(jié)論

本文研究了酸提、水提和堿提等三種提取方法對(duì)茯茶多糖在模擬胃液和腸液中消化特性和細(xì)胞水平上免疫調(diào)節(jié)活性的影響.結(jié)果表明，酸提茯茶多糖、水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖均不能被模擬胃液和腸液所消化，屬于非消化性多糖；另外，酸提茯茶多糖、水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖在細(xì)胞水平上均具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，主要表現(xiàn)在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬能力、酸性磷酸酶活力以及提高NO分泌的能力，綜合分析，水提茯茶多糖和堿提茯茶多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性更優(yōu).通過研究不同提取方法對(duì)茯茶多糖消化特性和免疫調(diào)節(jié)活性的影響，為進(jìn)一步探究茯茶多糖的免疫調(diào)節(jié)活性提供理論支撐，有助于茯茶資源的深入開發(fā)利用.