李 瑩, 李印可, 周 欣, 李瑩玉, 楊文娟, 王 浩, 何佩云, 劉 歡,2*

(1.陜西科技大學 食品科學與工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究院，陜西 西安 710021)

0 引言

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是一種嗜鹽嗜溫的海洋弧菌，在夏季較高溫度下容易引起海產(chǎn)品大規(guī)模死亡，造成巨大的經(jīng)濟虧損[1].溶藻弧菌具有強致病性，可通過直接侵襲機體或食用污染的海產(chǎn)品等方式損害人類健康，引起腹瀉、敗血癥、中耳炎、食物中毒等疾病的發(fā)生[2].迄今為止，已鑒定出的溶藻弧菌毒力因子主要包括胞外蛋白酶、生物被膜、運動性、粘附素(外膜蛋白、脂多糖)和攝鐵系統(tǒng)等[3].值得注意的是，細胞密度能夠顯著影響溶藻弧菌的致病性.在溶藻弧菌生長到對數(shù)期或穩(wěn)定期時，細菌密度達到一定閾值，會產(chǎn)生大量的自誘導因子調(diào)控溶藻弧菌一系列基因的表達，從而對其生物被膜形成以及毒力因子分泌等造成影響[4-6].

sRNA是在大腸桿菌中率先發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNA(50～400 nt)，為轉錄后調(diào)控因子[7,8]，在細菌中廣泛存在，能夠感應環(huán)境變化，從而調(diào)控相關基因的表達[9].細菌sRNA主要作用機制是與靶基因mRNA通過堿基互補配對相結合，從而促進或抑制靶基因表達.根據(jù)其調(diào)控作用方式可分為順式sRNA和反式sRNA.順式sRNA主要位于噬菌體、轉座子和質(zhì)粒上，能夠與靶標mRNA完全互補配對；反式sRNA主要位于染色體，通過分子伴侶蛋白Hfq的協(xié)助與靶標mRNA部分堿基互補發(fā)揮其功能[10].sRNA參與細菌幾乎所有生理功能的調(diào)控，包括生長、代謝、毒力[11]、宿主感染以及耐藥性[12]等.在大腸桿菌中，sRNA分子EsrF在高濃度銨鹽條件可以與鞭毛合成基因flhBmRNA分子5′非編碼區(qū)直接配對，而增強其運動性和對宿主細胞的粘附[13]；sRNA分子RsaG在金黃色葡萄球菌內(nèi)化至宿主細胞的過程中誘導表達，在利用葡萄糖-6-磷酸時，RsaG通過與氧化還原轉錄抑制子Rex和乳酸脫氫酶Ldh1反應調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)，使得糖代謝由有氧氧化轉為無氧氧化(即乳酸的形成進行)，進而促進氨基酸代謝[14].Kim等[15]為了確定sRNAs在大腸桿菌和沙門氏菌抗生素敏感性中的作用，使用過表達文庫進行了Hfq依賴型sRNAs的藥敏試驗、生長分析和活力測定.發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中已知的26個Hfq依賴型sRNA中有17個調(diào)控其抗生素敏感性，如MicF、RybB、RydC等；沙門氏菌已知的9個Hfq依賴型sRNA中有8個調(diào)控其抗生素敏感性，MicF、OxyS、ChiX等.

sRNA是一種廣泛存在于細菌體內(nèi)的非編碼RNA，通過與靶標mRNA堿基互補配對影響其穩(wěn)定性或翻譯活性，是一種重要的轉錄后調(diào)控系統(tǒng).實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：在溶藻弧菌體內(nèi)存在sRNA伴侶蛋白Hfq，且對溶藻弧菌毒力具有顯著的抑制作用[16].Hfq作為一種重要的轉錄后全局調(diào)控因子，廣泛參與細菌不同生理進程，而其調(diào)控作用的發(fā)揮主要通過作為不同sRNA分子的伴侶蛋白來實現(xiàn).目前在溶藻弧菌中已鑒定功能的sRNA分子僅有少數(shù)幾個，尚存在大量未知的sRNA分子需要進行深入研究.而細胞密度相關的sRNA分子,除了實驗室前期鑒定的與哈氏弧菌高度同源的Qrr1-5分子外[17],尚未有報道.

本文通過轉錄組測序及生物信息學手段，對低密度和高密度生長下的溶藻弧菌進行了差異sRNA的篩選，并對高密度條件下顯著下調(diào)的sRNA0087進行生物信息學分析以及突變株及回補株的構建，檢測運動性、生物被膜以及胞外蛋白酶等功能毒力因子的表達情況，初步明確該sRNA0087對溶藻弧菌毒力調(diào)控的作用.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 實驗菌株

溶藻弧菌EPGS(WT)，pDM4，pBAD33(華東理工大學授贈)；大腸桿菌DH5α，SM10 λpir，DH5α λpir；pDM19-T載體(寶生物工程(大連)有限公司).

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉1%(w/v)，胰蛋白胨1%(w/v)，酵母粉0.5%(w/v).

LBS液體培養(yǎng)基：氯化鈉3%(w/v)，胰蛋白胨1%(w/v)，酵母粉0.5%(w/v).

固體培養(yǎng)基則添加1.5%(w/v)瓊脂.氨芐青霉素、硫酸卡那霉素及氯霉素購于生工生物工程(上海)股份有限公司.Trizol、異丙醇及氯仿購于上海捷瑞生物工程有限公司.cDNA第一條鏈合成試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及SuperReal熒光定量預混試劑盒購于北京天根生化科技有限公司.

1.2 主要儀器與設備

Micro 17型低溫高速離心機，芬蘭賽默飛世爾科技有限公司；移液器，德國Eppendorf公司；WH-3型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98 II型核酸定量儀，美國Quawell；Agilent 2100型生物電泳圖像分析系統(tǒng)，美國安捷倫；HiSeq4000型測序儀，美國Illumina.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

將溶藻弧菌接種在培養(yǎng)基LBS中，在30 ℃的條件下培養(yǎng).大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃的條件下培養(yǎng).液體培養(yǎng)基于搖床200 rpm 培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng).

1.3.2 RNA-Seq高通量測序及sRNA預測分析

抽提溶藻弧菌總RNA，檢測其濃度及質(zhì)量.檢驗合格的樣品送往上海云序生物科技有限公司完成測序分析.主要過程如下：1 μg總RNA經(jīng)磷酸酶和PNK激酶處理后，使用Illumina公司的小RNA建庫試劑盒進行文庫構建.質(zhì)控后的文庫通過Illumina HiSeq 4000測序儀進行高通量轉錄組測序.使用Q30對原始reads(Raw Data)進行質(zhì)控，之后使用cutadapt軟件(v1.9.3)去接頭，獲得clean reads.使用sRNAscanner進行sRNA的預測分析，刪除與已知基因重疊的部分.再使用Hisat2軟件將clean reads比對到參考基因組上，使用HTSeq軟件統(tǒng)計每個gene上的reads數(shù).通過edgeR軟件進行數(shù)據(jù)標準化和差異表達分析[18-22].使用Mfold軟件進行sRNA二級結構預測分析，并通過TargetRNA2對其可能的靶標mRNA分子進行預測分析[23].

1.3.3 引物

突變株Δ0087及回補株0087+引物信息如表1所示.

表1 引物信息

1.3.4 缺失株的構建

根據(jù)溶藻弧菌EPGS全基因組序列，以sRNA0087為模板，設計引物up-F/R以及down-F/R，引物具體信息如表1所示.分別進行PCR獲得上下游同源臂序列，膠回收后，以其作為模板，利用引物對up-F和down-R進行Overlap PCR，獲得Δ0087缺失片段，與pDM4進行重組，并依次轉化至大腸桿菌DH5α λpir以及SM10 λpir中，挑取陽性克隆菌株進行PCR驗證.驗證成功的含有pDM4-Δ0087質(zhì)粒的SM10 λpir與溶藻弧菌野生型(Wild type，WT)進行兩輪同源重組交換，篩選得到Δ0087缺失株.

1.3.5 回補株的構建

根據(jù)溶藻弧菌EPGS全基因組序列，以0087編碼基因為模板，設計引物com-F及com-R，引物具體信息如表1所示.通過對溶藻弧菌基因組進行PCR獲得0087+回補片段.通過進行T-A克隆及雙酶切連接將目的基因片段與pBAD33連接重組，依次轉化至大腸桿菌DH5α和SM10 λpir中.將含有目的基因質(zhì)粒的SM10 λpir與缺失株Δ0087進行接合實驗后，挑選克隆菌株，并進行菌落PCR驗證得到回補株0087+.

1.3.6 運動性的測定

參考鄧益琴等[24]的方法對運動性進行測定，將溶藻弧菌WT、Δ0087加入含有100 μg/mL氨芐的LBS培養(yǎng)基中，回補株0087+加入含有14 μg/mL氯霉素、0.04%(w/v)L-阿拉伯糖的LBS培養(yǎng)基中，30 ℃條件下200 rpm于搖床中培養(yǎng)，并將培養(yǎng)物OD600調(diào)整為1.0.吸取2 μL菌液分別點樣至含有0.3%(w/v)瓊脂和1.5%(w/v)瓊脂的LBS固體平板中心，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其運動情況.

1.3.7 生物被膜的測定

使用結晶紫染色法測定生物被膜形成[25].加入300 μL菌液至含有相應抗生素的10 mL LBS液體培養(yǎng)基中.另外，回補株需加0.04%(w/v)的L-阿拉伯糖.30 ℃靜置48 h培養(yǎng)，用2%(w/v)的結晶紫染色液染色5 min，將培養(yǎng)液倒出，用去離子水沖洗至清澈，加入冰乙酸溶解，并測定570 nm處的吸光值(OD570).

1.3.8 胞外蛋白酶測定

活化溶藻弧菌WT、Δ0087和0087+，并將其OD600調(diào)整為1.0.配置含有2%(w/v)脫脂奶粉液的LBS固體平板，吸取2 μL菌液滴到平板中央，晾干后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，觀察其透明圈直徑并進行拍照.

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均設有3個平行，且至少重復3次，使用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，顯著性水平為5%.

2 結果與討論

2.1 細胞密度相關sRNA的篩選

對溶藻弧菌EPGS在低密度(2 h)和高密度(9 h)下總RNA進行質(zhì)量分析，結果如圖1所示.

由圖1可以看到，23S rRNA和16S rRNA兩條明亮清晰的條帶，且沒有受到gDNA的污染，OD260/OD280分別為1.95和1.97，所提取的總RNA質(zhì)量符合后續(xù)轉錄組測序要求，之后進行RNA文庫制備和Illumina HiSeq高通量測序.對低密度條件下(2 h)和高密度條件下(9 h)溶藻弧菌的reads進行統(tǒng)計，結果如表2所示.低密度條件下共獲得34 070 768個clean reads，比對到基因組中的reads有21 367 976個，Mapped ratio為62.72%；高密度條件下共產(chǎn)生了35 719 972個clean reads，比對到基因組的reads有26 783 063個，占74.98%.

圖1 RNA完整性和gDNA污染電泳分析(Lane 1:2 h; Lane 2:9 h)

表2 Reads 統(tǒng)計

對高密度及低密度溶藻弧菌的表達差異進行分析，共有1 327個基因在高密度條件下較低密度條件轉錄水平上調(diào)，1 235個基因下調(diào)，結果如圖2所示.之后進一步通過sRNAscanner進行sRNA分析預測，結果如表3所示.低密度時表達的sRNA 109個，高密度時表達的sRNA 107個，高密度較低密度共有82個差異表達sRNA分子，其中47個sRNA表達上調(diào)，35個表達下調(diào).其中，sRNA0087為新型sRNA分子，其在高密度培養(yǎng)條件下表達水平顯著下調(diào)(-9.38倍)，選取其進行后續(xù)研究.

表3 sRNA表達譜及差異表達情況統(tǒng)計

圖2 差異表達基因散點圖

2.2 sRNA0087二級結構分析

使用Mfold預測sRNA0087的二級結構，結果如圖3所示.sRNA0087具有典型的RNA二級結構，包含4個莖環(huán)、3個內(nèi)環(huán)、2個凸環(huán)以及未能堿基配對的單鏈結構區(qū)組成，此外，其3′端為5個尿嘧啶組成的poly(U)尾巴，為與伴侶蛋白Hfq近端面進行結合的保守區(qū)，促進形成sRNA-Hfq的RNA-蛋白復合物.

圖3 sRNA0087二級結構預測圖

2.3 sRNA0087靶標mRNA的分析

使用Target RNA2對sRNA0087在溶藻弧菌中的靶標mRNA分子進行預測分析，部分靶標mRNA信息如表4所示.sRNA0087在溶藻弧菌體內(nèi)擁有多個靶標mRNA，包括假定的三型分泌蛋白、酰基載體蛋白，質(zhì)粒穩(wěn)定系統(tǒng)蛋白、O-甲基轉移酶相關蛋白、HesA/MoeB/ThiF家族蛋白以及核糖體小亞基的形成等.其中三型分泌系統(tǒng)伴侶分子SycN可以激活T3SS效應物的分泌，促進病原菌對宿主的侵染.

表4 部分靶標mRNA預測結果

2.4 Δ0087缺失株的篩選鑒定

關于Δ0087缺失株的構建，結果如圖4所示.1號泳道為WT，2號泳道為篩選到的Δ0087菌株，可以看到Δ0087菌株擴增片段較WT減少200 bp左右，與設計缺失的221 bp片段大小相符.將構建成功的菌株進行測序，Δ0087缺失株所缺失的堿基與設計敲除的221 bp的堿基一致，說明缺失株構建成功.

圖4 缺失株驗證(M:DNA marker 2 000 bp;1:WT；2:Δ0087)

2.5 回補株0087+的篩選鑒定

關于回補株0087+的構建，結果如圖5所示.篩選到的回補株0087+，擴增得到大小約為220 bp的特異性條帶，與sRNA0087完整片段大小(222 bp)基本一致.利用TCBS培養(yǎng)基將回補株進一步分離純化，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，進行測序分析，發(fā)現(xiàn)回補片段堿基組成正確，證明回補株0087+構建成功.

圖5 回補株驗證(M:DNA marker 2000 bp；1:0087+)

2.6 sRNA0087對運動性的影響

溶藻弧菌WT、Δ0087和0087+的游動性和爬動性結果如圖6所示.在瓊脂含量分別為0.3%和1.5%的LBS平板上，溶藻弧菌游動以及爬動的距離均明顯變小，說明sRNA0087的缺失造成了溶藻弧菌游動性和爬動性的減弱.另外，回補株0087+的爬動和游動能力較缺失株得到明顯的增加，但仍然達不到野生株的水平.可見，sRNA0087對溶藻弧菌的運動性具有正向調(diào)控作用.

圖6 運動性測定

2.7 sRNA0087對生物被膜的作用

結晶紫染色法對溶藻弧菌WT、突變株Δ0087和回補株0087+的生物被膜形成的檢測結果如圖7(a)所示.由圖7(a)可知，溶藻弧菌WT、突變株Δ0087和回補株0087+都形成了生物被膜，但突變株Δ0087的生物被膜形成量顯著降低，而回補株0087+的生物被膜形成能力較突變株有所增加，但仍然達不到野生株的水平.突變株Δ0087的生物被膜生成量為野生株的46.7%，而回補株0087+的生物被膜生成量達到野生株的78.7%(如圖7(b)所示).可見，sRNA0087對溶藻弧菌生物被膜的形成具有促進作用.

圖7 野生株WT、突變株Δ0087和回補株0087+生物被膜測定

2.8 sRNA0087對胞外蛋白酶合成的影響

通過脫脂牛奶平板定性測定溶藻弧菌WT、突變株Δ0087和回補株0087+的胞外蛋白酶變化，結果如圖8所示.突變株Δ0087菌落直徑相對于野生株而言變小，且在其菌落四周并未形成肉眼可見的透明圈；回補株0087+能夠形成與野生株幾乎相同的透明圈，但其菌落直徑小于野生株.由此可見，sRNA0087對溶藻弧菌胞外蛋白酶的合成具有正向調(diào)控作用.溶藻弧菌胞外蛋白酶、運動性以及生物被膜等均受到群體感應系統(tǒng)的影響，而sRNA0087作為一個高細胞密度下表達水平顯著下調(diào)的sRNA分子，其是否通過與細胞密度響應調(diào)控系統(tǒng)-群體感應的相互作用而實現(xiàn)對溶藻弧菌毒力因子的影響，后續(xù)可進行深入研究.

圖8 胞外蛋白酶測定

3 結論

通過高通量轉錄組測序及生物信息學方法，篩選出了表達差異顯著的sRNA分子0087，發(fā)現(xiàn)其具有非常典型的二級結構，且其靶標mRNA有假定的三型分泌蛋白，核糖體小亞基依賴型ATP酶等.成功構建無標記的Δ0087缺失株和其回補株0087+.sRNA0087對溶藻弧菌運動性、生物被膜形成以及胞外蛋白酶的合成均具有正向的調(diào)控作用.本研究為溶藻弧菌的毒力調(diào)控機制帶來了新思路，并進一步豐富了人們對該病原菌毒力調(diào)控系統(tǒng)的認識.