牙齦卟啉單胞菌臨床菌株致病作用的研究進(jìn)展

吳雅潔， 李雨慶， 周芳潔， 李繼遙

1. 口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川成都（610041）； 2. 口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）

牙周炎是一種以牙菌斑生物膜為始動(dòng)因子，牙齦炎癥以及牙周支持組織破壞為主要表現(xiàn)的慢性感染性疾病，是成年人失牙的主要原因［1］。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是一種革蘭陰性厭氧球菌，口腔中的常駐菌種之一，與福賽斯坦納菌、齒垢密螺旋體共同組成“紅色復(fù)合體”，是導(dǎo)致牙周炎發(fā)生發(fā)展的主要致病菌之一［2］，即使在低豐度的情況下也可以導(dǎo)致牙周微生態(tài)失調(diào)和牙槽骨質(zhì)的吸收［3］。P. gingivalis可以產(chǎn)生多種毒力因子，這些毒力因子與侵襲牙周組織的能力密切相關(guān)，包括牙齦素、菌毛、外膜小泡等［4］。這些毒力因子一方面可以直接與宿主相互作用，對宿主組織造成損傷；另一方面，可以激活某些信號通路或調(diào)控信號分子的表達(dá)，從而引發(fā)宿主的免疫炎癥反應(yīng)，造成牙周局部組織的損害甚至推動(dòng)全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)展［4］；同時(shí)，P.gingivalis也可以與其他口腔微生物相互作用，造成牙周局部口腔微生態(tài)環(huán)境失衡，最終加劇牙槽骨的吸收［5］。

標(biāo)準(zhǔn)菌株一般是指由國內(nèi)或國際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。臨床菌株即臨床分離菌株，是從患者體內(nèi)分離并通過測序比對后鑒定得到的菌株。由于環(huán)境的選擇，口腔微生物會(huì)根據(jù)對環(huán)境的適應(yīng)實(shí)現(xiàn)表型乃至基因的改變以獲得更有利的生存能力?，F(xiàn)實(shí)驗(yàn)采用的P. gingivalis菌株多為ATCC 33277、W83 等菌株，與臨床分離得到的菌株在表型、代謝、基因序列等方面存在著差異［6］。不同口腔狀態(tài)的患者分離得到的菌株對口腔牙周局部環(huán)境和全身健康的影響未知［7］。僅通過實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株研究各種通路的激活、調(diào)控對全身造成的影響，無法全面了解P.gingivalis對不同個(gè)體的致病特點(diǎn)，也無法充分掌握疾病的變化和發(fā)展趨勢。因此，分離并研究P. gingivalis臨床菌株對于評估其臨床致病性、設(shè)計(jì)牙周炎靶向性治療藥物具有重要意義。

1 現(xiàn)階段已分離得到的牙齦卟啉單胞菌菌株

在P. gingivalis菌株水平研究最多的有ATCC 33277、W83、HG66 和W50 等。W83 菌株是在20 世紀(jì)50 年代從1 名慢性牙周炎患者中分離出來的，毒力較強(qiáng)［8］。HG66 是1970 年代亞特蘭大埃默里大學(xué)牙學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離得到的一種P.gingivalis，后期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)此種P.gingivalis以可溶性形式釋放大部分蛋白酶［8］。W50 菌株（即ATCC 53978）最初從齦下菌斑臨床標(biāo)本中分離［8］。用于基因組測序的菌株ATCC 33277 為直接從美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）中獲得，毒力較弱［8］。

P. gingivalis臨床菌株的鑒定是將臨床菌株DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與數(shù)據(jù)庫核苷酸序列比對，與已知序列的P. gingivalis同源性可高達(dá)98%～100%，序列差異主要來自于一些核苷酸點(diǎn)突變［9］。目前研究較多的P. gingivalis臨床分離菌株主要包括以下幾種：TDC60 菌株，由日本東京牙科學(xué)院分離自重度牙周病患者口腔，對小鼠牙周膿腫的致病性高于W83 和ATCC 33277 等菌株；SJD2 菌株，由上海交通大學(xué)分離自中國慢性牙周炎患者的齦下菌斑，在小鼠牙周膿腫模型中，它被證明具有與菌株W83 相當(dāng)?shù)母叨拘蕴匦裕籄JW4 菌株，由紐約州立大學(xué)布法羅分校分離自牙周炎患者牙周膿腫中，體外研究認(rèn)為其侵襲性較弱；381 菌株，由福賽斯牙科中心從慢性牙周炎患者的牙周膿腫中分離；A7A1-28 菌株，分離自1 名患有非胰島素依賴型糖尿病的牙周炎患者的牙周膿腫，是具有非典型菌毛和莢膜表型的強(qiáng)毒株［8］。

2 牙齦卟啉單胞菌臨床菌株毒力表型差異

2.1 莢膜

莢膜是細(xì)菌表面的特殊結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞表面的一層松散的黏液物質(zhì)。在P. gingivalis表面莢膜厚度與毒力及多種表面性質(zhì)相關(guān)［10］，如疏水性質(zhì)、自凝集作用等［8］。高毒菌株W83 較低毒菌株ATCC 33277 有更厚的莢膜結(jié)構(gòu)，莢膜親水性更強(qiáng)［11］。Davey 等［12］發(fā)現(xiàn)，ATCC 33277 自凝集現(xiàn)象明顯，菌體易凝結(jié)成團(tuán)，細(xì)菌間的黏附功能較強(qiáng)，更容易形成生物膜，這可能是由于莢膜更薄，更多地暴露了細(xì)菌表面的黏附素，使得細(xì)菌能快速黏附并侵入牙齦細(xì)胞。臨床分離的381 菌株與ATCC 33277 表面莢膜結(jié)構(gòu)相似［12］。然而高毒菌株比低毒菌株莢膜厚度更大這一特點(diǎn)并不適用于所有的P. gingivalis菌株，菌株毒性與較多因素相關(guān)，與莢膜的厚度并非線性關(guān)系。

2.2 內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）

P. gingivalis的LPS 由類脂A、核心低聚糖和O-特異性多糖（O-Antigenic Regions，OAG）組成，在牙周組織中具有很強(qiáng)的致病作用［13］，可以刺激牙齦上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子導(dǎo)致牙周組織的破壞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從慢性牙周炎患者中分離出的臨床菌株中可檢查到完整的LPS 結(jié)構(gòu)，而健康患者齦下菌斑重分離得到的菌株卻缺乏其中的OAG［14-15］。擁有完整OAG 區(qū)域的菌株（如W50），可誘導(dǎo)TLR4 mRNA 的表達(dá)增加近6 倍［15］。由此研究者們推測，LPS 組成不同也會(huì)影響著細(xì)菌的致病性［14,16］，牙周炎患者可能具備更多毒力更強(qiáng)的P.gingivalis的菌株類型。

2.3 耐藥性

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，體內(nèi)諸多細(xì)菌都通過分離得到了抗生素耐藥菌株［17］。研究表明，過去幾十年間，從多名慢性牙周炎患者菌斑中分離到的56 株P(guān).gingivalis（未命名）對口腔疾病常用抗生素甲硝唑、克林霉素、多西環(huán)素等藥物的最小抑菌濃度無明顯變化［17］。學(xué)者猜測，可能是由于P.gingivalis在口腔中一般位于牙周袋深部氧濃度低、血運(yùn)差的地方，抗生素難以直接作用，藥物的有效成分難以發(fā)揮作用。

2.4 菌毛

菌毛是革蘭陰性菌菌體表面密布的短而直的絲狀結(jié)構(gòu)。P. gingivalis表面的菌毛有助于其定植于牙周組織，菌毛由FimA 和Mfa1 兩種基因編碼［18］。FimA 是最早被發(fā)現(xiàn)與P. gingivalis多樣性有關(guān)的基因，共6 種基因型（Ⅰ到Ⅴ和Ⅰb），其中Ⅱ型和Ⅳ型基因主要在重度牙周炎患者中檢出，認(rèn)為Ⅳ型菌毛多與菌株高致病性相關(guān)，而Ⅰ型基因在健康或輕度牙周炎患者中普遍存在［19］。

3 臨床菌株宿主致病性差異

3.1 牙周局部致病性

P. gingivalis的黏附在牙周組織的侵襲過程中起重要作用。現(xiàn)有研究表明，381 菌株對口腔內(nèi)皮細(xì)胞的黏附率最高，AJW4 菌株黏附率稍低，菌株W50 黏附最少，約為AJW4 的1/10。然而成功黏附的381 菌株和W50 菌株對口腔內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲率分別為22.6%和25.9%，AJW4 的侵襲率僅為0.02%。另外，菌株381 對表皮樣癌細(xì)胞的侵襲能力比菌株AJW4 大1 000 倍。W50 對于牙齦屏障的侵襲和破壞作用最強(qiáng)，AJW4 致病能力較弱［20］。

P.gingivalis主要通過表達(dá)絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶以及半胱氨酸蛋白酶等毒力因子導(dǎo)致牙周局部組織的破壞［21］。不同菌株的牙齦素分布及活性不同，其毒力特征也不同。W50 及其牙齦素缺失突變株構(gòu)建的動(dòng)物牙周炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼f明Kgp 比Rgp 對毒力的貢獻(xiàn)更大，造成的骨吸收更嚴(yán)重［22］。W50 和A7A1-28（ATCC 53977）的蛋白酶活性，特別是Kgp 活性高于菌株381 和ATCC 33277，具有更高的致病性［23］。

P. gingivalis臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株在體外都表現(xiàn)出相同的誘發(fā)促炎反應(yīng)的潛力，在相同的體外環(huán)境條件下培養(yǎng)有著相似的生物活性，但刺激不同的細(xì)胞時(shí)卻會(huì)發(fā)生不同程度的反應(yīng)［24］。研究表明P. gingivalis和人類血小板之間存在至少4 種單獨(dú)的相互作用模式，臨床分離菌株的單核苷酸多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致菌株聚集能力和黏附能力的改變。Jockel-Schneider 等［25］發(fā) 現(xiàn)A7A1-28 菌 株 通 過 與FcγRIIA 受體結(jié)合被激活，但聚集能力僅為其團(tuán)隊(duì)分離臨床菌株的54%。

3.2 全身致病性

現(xiàn)階段研究已證實(shí)P. gingivalis與動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥等多種全身系統(tǒng)性疾病具有關(guān)聯(lián)。不同菌株的致病性差異會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同程度的免疫反應(yīng)。在小鼠灌胃模型中，不同菌株引起牙周骨丟失，血清和唾液抗體表達(dá)能力不同，其中A7A1-28 毒株灌胃后，只有36%的小鼠死亡，而W50 毒株在48 h 內(nèi)導(dǎo)致100%的動(dòng)物死亡，說明這些毒株的致病性不同［26］。同時(shí)，灌胃W50 和W83 菌株的小鼠有主要表現(xiàn)為白細(xì)胞介素-4（interleukin，IL-4）增加，局部牙槽骨丟失嚴(yán)重；灌胃A7A1-28 菌株的小鼠則主要表現(xiàn)為IL-10 和γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）增加，而局部牙槽骨丟失的誘導(dǎo)較少［27］。研究表明，當(dāng)使用不同菌株刺激樹突狀細(xì)胞后，并沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子表達(dá)模式的差異，所有菌株均可刺激IFN-γ、IL-1β、IL-12、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-6 和IL-10 的表達(dá)，可能與P. gingivalis的mRNA 與蛋白表達(dá)的差異有關(guān)［28］。

P. gingivalis與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系受到越來越多學(xué)者的關(guān)注［29］。某些臨床分離菌株在硝普鈉（血小板聚集抑制劑）存在的情況下仍可誘導(dǎo)血小板聚集，增強(qiáng)血小板激活和聚集能力。但這些臨床菌株對血小板聚集抑制劑產(chǎn)生的拮抗作用對患者臨床結(jié)局的影響需要進(jìn)一步研究［26］。部分P.gingivalis，如W83，能引發(fā)心血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致心血管系統(tǒng)的炎癥與損傷。Baek 等［30］根據(jù)對心血管細(xì)胞的侵襲能力，將其分離的20 株P(guān).gingivalis分為了高、中、非侵入型。結(jié)合臨床資料發(fā)現(xiàn)，隨著探診深度的增加，位于牙周袋深部的P.gingivalis顯示出更強(qiáng)的侵襲能力。Dolgilevich等［31］使用基因組學(xué)分析不同臨床分離菌株侵襲能力不同的原因，發(fā)現(xiàn)在非入侵菌株的基因組中，有100 多個(gè)基因是缺失的。

P. gingivalis與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）也存在著密切的聯(lián)系［32］。瓜氨酸化是指在蛋白質(zhì)精氨酸脫亞胺酶（peptidylarginine deiminases，PADs）作用下蛋白質(zhì)肽鏈中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸殘基的過程。這一過程與RA 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但只有部分P. gingivalis能產(chǎn)生這種酶［21］。Gabarrini 等［22］發(fā)現(xiàn)不同程度牙周疾病的患者或牙周健康人群的P. gingivalisPAD 基因無差異，從RA 和非RA 患者分離的P. gingivalis的瓜氨酸化模式?jīng)]有差異。

炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）患者認(rèn)知能力下降的重要原因之一。P. gingivalis可以促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展，也可以從口腔進(jìn)入血液，通過破壞跨上皮膜，損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，增加血腦屏障的通透性。與ATCC 33277 相比，具有較厚莢膜的W83可通過其表面特殊的A 型-脂多糖誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子麻痹，增強(qiáng)細(xì)菌的定植能力，使細(xì)菌的毒力更強(qiáng)，從而加重大腦的病理性損害。莢膜更厚、毒力更強(qiáng)的P.gingivalis可能增加AD 的患病風(fēng)險(xiǎn)［33-34］。

4 小 結(jié)

P. gingivalis被認(rèn)為是牙周炎發(fā)生過程中的關(guān)鍵細(xì)菌［35］，其毒力與致病性與牙周疾病密切相關(guān)，然而對于P. gingivalis臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的差異與關(guān)聯(lián)缺乏系統(tǒng)性的研究。通過對臨床菌株基因組多態(tài)性的研究，可進(jìn)一步了解P. gingivalis基因序列中的重要毒力基因位點(diǎn)，便于更有針對性地構(gòu)建突變株并進(jìn)行深入的探究，指導(dǎo)治療方法的改進(jìn)和相關(guān)藥物的研制。

【Author Contributions】 Wu YJ wrote the article. Li YQ, Zhou FJ,Li JY revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.