譚祥宇, 陳瑩, 李雨欣, 尉婧, 李二峰

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院,天津 300392)

植物真菌病害是由植物病原真菌引起的病害,約占植物病害的70%～80%,種類繁多,嚴(yán)重危害了農(nóng)作物的生產(chǎn)。目前,Rab蛋白已被確定與植物病原真菌的囊泡運(yùn)輸息息相關(guān),并參與病原菌自身的生長發(fā)育、有性及無性生殖、毒素分泌,以及對(duì)寄主植物的致病力等,然而,相比于其在釀酒酵母、植物和哺乳動(dòng)物中的研究,Rab蛋白在植物病原真菌中的功能研究仍處于初級(jí)階段,缺少系統(tǒng)性。因此,為了解析各種Rab蛋白在植物病原真菌中的作用,更快更好的服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),本研究對(duì)植物病原真菌Rab蛋白的結(jié)構(gòu)特征、循環(huán)通路、上下游信號(hào)調(diào)控因子以及其生物學(xué)功能的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期為植物病原真菌致病機(jī)制及植物真菌病害的防治提供指導(dǎo)策略。

1 Rab家族蛋白概述

小GTP結(jié)合蛋白(small GTPases),又稱小GTP酶/小G蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量大約為20～25 kD,因其結(jié)合鳥苷三磷酸(GTP)而得名。小GTP結(jié)合蛋白具有內(nèi)源GTPase活性,起著分子開關(guān)的作用[1]。據(jù)報(bào)道,到目前為止,已有100多種小GTP結(jié)合蛋白在各種真核生物中被發(fā)現(xiàn),根據(jù)序列的同源性,小GTP結(jié)合蛋白可分為Ras、Arf、Rap、Rab、Rho、Ran、Rit、Rad、Rheb和Miro等多種蛋白家族[2-3]。其中Rab家族蛋白是小GTP結(jié)合蛋白中最大的家族,在多種真核生物中普遍存在。最早被發(fā)現(xiàn)和鑒定的Rab蛋白是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中參與胞吞胞吐途徑的Sec4和Ypt1蛋白[4-5]。由于哺乳動(dòng)物第一個(gè)Rab蛋白是從小鼠大腦的cDNA文庫中克隆得到的,因此該蛋白被命名為Rab(Ras-like proteins in brain)蛋白[6]。

研究表明,Rab家族蛋白主要調(diào)控囊泡出芽后的一系列過程,如囊泡沿細(xì)胞骨架的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、囊泡與受體膜的初始識(shí)別和錨定,以及囊泡與受體膜融合的調(diào)劑過程等[7]。因此,在眾多與囊泡運(yùn)輸有關(guān)的蛋白中,Rab家族蛋白是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的相關(guān)蛋白之一,在真核生物囊泡形成和運(yùn)輸中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

在哺乳動(dòng)物中,細(xì)胞中的Rab蛋白通過介導(dǎo)包裹蛋白的囊泡在細(xì)胞器間的轉(zhuǎn)運(yùn),來發(fā)揮自身的生物學(xué)功能[8]。Rab蛋白的異常表達(dá)會(huì)引起其介導(dǎo)的蛋白功能及信號(hào)通路紊亂,致使腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病及神經(jīng)退行性病變等相關(guān)疾病的發(fā)生[9-12];在高等植物中,不同基因組中Rab亞家族的基因序列相對(duì)保守,主要通過調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、囊泡運(yùn)輸、植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)來發(fā)揮功能[13-16],但其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制還在研究中;在真菌領(lǐng)域,Rab蛋白在酵母中研究較為深入,近幾年在植物病原真菌中也取得了一系列的進(jìn)展。至今在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的Rab家族蛋白主要有Sec4、Ypt11、Ypt10、Ypt8、Ypt7、Ypt6、Ypt5、Ypt4、Ypt3和Ypt1等[17],由于Rab蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域,利用生物信息學(xué)的方法,在植物病原真菌中也鑒定出多種Rab家族蛋白,其中禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中發(fā)現(xiàn)有11個(gè)假定的Rab蛋白[18],禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)中共預(yù)測有10個(gè)Rab蛋白候選基因[19],在果生炭疽菌(C.fructicola)中共預(yù)測得到10個(gè)Rab蛋白序列[20]。

2 植物病原真菌Rab蛋白

2.1 植物病原真菌Rab蛋白的結(jié)構(gòu)特征

Rab蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)通常由G結(jié)構(gòu)域(G1～G5)、RabF模體(RabF1～RabF5)、RabSF模體(RabSF1～RabSF4),以及C端的半胱氨酸模體(C motif)這幾個(gè)重要區(qū)域構(gòu)成。其中,G結(jié)構(gòu)域(G1～G5)在整個(gè)Rab家族蛋白成員中都具有高度保守性,是GTP結(jié)合和水解的區(qū)域,其二級(jí)結(jié)構(gòu)由5個(gè)α螺旋、6個(gè)β片層和5個(gè)多肽環(huán)組成,并與Mg2+相連。G結(jié)構(gòu)域中的G2和G4-a2-G5是Rab蛋白與其調(diào)控因子相互作用的位點(diǎn),其構(gòu)象可發(fā)生變化,故稱為分子開關(guān)區(qū)域(switch I和switch Ⅱ)[21]。RabF模體(RabF1～RabF5)是Rab家族蛋白所特有的5個(gè)保守的氨基酸序列,利用該模體能夠較為準(zhǔn)確鑒別Rab蛋白。而RabSF序列則可以劃定各個(gè)Rab亞家族蛋白的成員,在Rab亞家族蛋白內(nèi)部比整體序列具有更高的一致性[22]。此外,Rab蛋白C端具有膜定位信號(hào),序列常見為XXXCC、XXCCX、XCCXX、CCXXX或XXCXC,當(dāng)C端的半胱氨酸被異戊二烯化修飾后,Rab蛋白則會(huì)通過C端與膜相連。

2.2 植物病原真菌Rab蛋白循環(huán)通路

Rab蛋白在胞質(zhì)和其相應(yīng)的囊泡之間進(jìn)行周期性的循環(huán)。新合成的Rab蛋白與Rab護(hù)送蛋白(REP)結(jié)合,在Rab geranylgeranyl transferase(RabGGT)的作用下,Rab蛋白的C端會(huì)被異戊二烯化修飾。REP將修飾后的Rab蛋白傳遞到靶膜上,形成GDP-Rab蛋白,此時(shí)Rab蛋白處于失活狀態(tài)。隨后,鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)作用于靶膜上的Rab蛋白,催化GDP與GTP的交換,從而激活Rab蛋白。被激活的Rab蛋白與下游效應(yīng)因子相互作用,在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。接下來,激活態(tài)的Rab蛋白與GTP酶激活蛋白(GAP)相互作用,GAP催化Rab蛋白水解,使Rab蛋白由GTP結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為GDP結(jié)合態(tài),釋放Pi,從而使Rab蛋白失去活性。此時(shí),鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子(GDI)會(huì)將失活的Rab蛋白從膜上解離,并與之結(jié)合。Rab蛋白與GDI結(jié)合后,通過GDI置換因子(GDF)的作用,GDI與GDP結(jié)合態(tài)的Rab蛋白分離。最后,Rab蛋白將重新插入到靶膜,開始新一輪的循環(huán)[23-29]。

在真核生物中,蛋白質(zhì)先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成,經(jīng)過高爾基復(fù)合體修飾后,通過囊泡被運(yùn)送到細(xì)胞的各個(gè)部位才能發(fā)揮作用。Rab家族蛋白在囊泡的形成和運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用,是細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾肿娱_關(guān)。不同的Rab蛋白被其上游的調(diào)控因子激活后發(fā)揮功能,并與特定的下游效應(yīng)因子互相作用,從而參與囊泡運(yùn)輸過程的不同階段。除此之外,Rab蛋白作用的發(fā)揮還需要Rab蛋白與它的特定靶膜相結(jié)合。

2.3 植物病原真菌Rab蛋白調(diào)控通路

Rab蛋白行使功能需要上游調(diào)節(jié)因子和下游效應(yīng)因子共同作用。Rab蛋白的上游調(diào)控因子主要調(diào)控Rab蛋白的活性,下游效應(yīng)因子則是Rab蛋白發(fā)揮具體功能必不可少的協(xié)同者[30]。

2.3.1 植物病原真菌Rab蛋白的上游調(diào)控因子

根據(jù)Rab蛋白循環(huán)通路的解析可知,Rab蛋白循環(huán)過程中起主要作用的調(diào)控因子有Rab護(hù)送蛋白(REP),鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEFs),GTP酶激活蛋白(GAPs),鳥核苷酸解離抑制因子(GDIs)及GDI解離因子(GDF)5種,每種調(diào)控因子都在Rab蛋白循環(huán)中發(fā)揮不可或缺的作用。

在酵母中對(duì)Mon1和Ccz1基因的研究表明,這2個(gè)基因在液泡的同型融合和調(diào)控囊泡運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用[31-33]?；谇叭说难芯炕A(chǔ),LI等[34]利用基因敲除、酵母雙雜交和GST-pull down等分子生物學(xué)技術(shù),發(fā)現(xiàn)在禾谷鐮刀菌中,Ccz1-Mon1蛋白復(fù)合物是Rab7的鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),證實(shí)了FgMon1與FgRab7相互作用,并證明FgMon1和FgRab7是調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸,內(nèi)吞作用和自噬的關(guān)鍵成分,從而影響禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育,致病性和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON毒素)的產(chǎn)生。為了探究Rab5-Mon1-Rab7調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在禾谷鐮刀菌囊泡運(yùn)輸過程中的作用,李穎等[35]進(jìn)行了基因敲除、亞細(xì)胞定位、酵母雙雜交和GST-pull down等一系列相關(guān)試驗(yàn),結(jié)果表明FgMon1可能與FgRab5A、FgRab5B、FgRab7組成一個(gè)復(fù)合調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)控囊泡運(yùn)輸、胞吞作用和細(xì)胞自噬,進(jìn)而影響禾谷鐮刀菌的生長發(fā)育、毒素產(chǎn)生和致病性。

YANG等[36]通過基因敲除、亞細(xì)胞定位、qRT-PCR以及酵母雙雜交試驗(yàn)表明,FgVps9作為FgRab51和FgRab52的GEF來調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用,對(duì)禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、無性發(fā)育、自噬、DON毒素產(chǎn)生和侵染植物有顯著影響。而在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中,何曉娟[37]利用基因敲除和酵母雙雜技術(shù)對(duì)Vps9基因的功能及Vps9a與MoYpt5的互作關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)MoVps9a敲除突變體生長緩慢,產(chǎn)孢量下降,致病性減弱,菌絲內(nèi)部呈現(xiàn)出許多小液泡,MoVps9a分別與處于DN(dominant negative:通過基因突變改變氨基酸的性質(zhì),使之持續(xù)失活)狀態(tài)的MoYpt51和MoYpt52互作,而不與CA(constitutively activate:通過基因突變改變氨基酸的性質(zhì),使之持續(xù)激活)狀態(tài)的MoYpt51和MoYpt52結(jié)合,說明MoVps9a有可能是稻瘟病菌中MoYpt51/52的鳥嘌呤核苷酸交換因子。此外,郭偉藝[38]對(duì)稻瘟病菌MoSec2進(jìn)行基因敲除及表型觀察,發(fā)現(xiàn)MoSec2可能是MoSec4的GEF蛋白,并能調(diào)節(jié)MoSec4的活性,從而調(diào)控稻瘟病菌的生長發(fā)育、孢子產(chǎn)生和致病力,為進(jìn)一步闡明MoSec4的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

ZHENG等[39]通過基因敲除、表型觀察和GTP酶活性測定發(fā)現(xiàn)FgGyp1是FgRab1的GTP酶激活蛋白(GAP),對(duì)禾谷鐮刀菌的營養(yǎng)生長、分生孢子產(chǎn)生和致病力至關(guān)重要,并負(fù)調(diào)節(jié)禾谷鐮刀菌中DON毒素的生物合成。此外,ZHENG等[40]利用基因敲除技術(shù)和結(jié)構(gòu)域缺失載體構(gòu)建進(jìn)行基因功能研究,結(jié)果表明,FgGyp8是營養(yǎng)生長、分生孢子發(fā)生、致病性所必需的,能夠催化FgRab1上的GTP水解為GDP,表明FgGyp8是FgRab1的GTP酶激活蛋白(GAP),并發(fā)現(xiàn)它與FgGyp1功能冗余。李玲萍等[41]為研究Rab GTP酶調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從SMART數(shù)據(jù)庫中鑒定了禾谷鐮刀菌所有含有TBC結(jié)構(gòu)域的12個(gè)假定GAPs,對(duì)這個(gè)蛋白家族的基因進(jìn)行敲除、亞細(xì)胞定位和表型分析。結(jié)果顯示,FgMSB3主要定位于菌絲頂端,該基因缺失導(dǎo)致突變體生長變慢,對(duì)小麥麥穗的致病力基本喪失,同時(shí)在遺傳上證實(shí)了FgMsb3可作為FgRab8的GAP發(fā)揮功能。

2.3.2 植物病原真菌Rab蛋白的下游效應(yīng)因子

Rab蛋白通過與下游各種效應(yīng)蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)各自的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。一些可溶性的效應(yīng)因子被激活態(tài)的Rab蛋白招募后,將GTP信號(hào)傳遞給下游的效應(yīng)蛋白,且每個(gè)Rab蛋白可以和多個(gè)效應(yīng)因子互作,從而調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的不同過程[42-44]。

目前,關(guān)于植物病原真菌Rab蛋白下游效應(yīng)因子的研究缺少詳細(xì)報(bào)道,其中涉及Retromer復(fù)合體和HOPS復(fù)合體的內(nèi)容相對(duì)較多。在釀酒酵母中,Retromer是1個(gè)由Vps26、Vps29、Vps35共3個(gè)大亞基和Vps5、Vps17共2個(gè)小亞基組合形成的蛋白復(fù)合體;HOPS則是1個(gè)六亞基復(fù)合體,由Vps11、Vps16、Vps18、Vps33、Vps39和Vps41組成[45]。

王亞君[46]利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)禾谷鐮刀菌FgRab7的互作蛋白進(jìn)行研究,結(jié)果表明,Vps26是Rab7的一個(gè)效應(yīng)因子,FgRab7通過與Vps26的相互作用調(diào)控DON毒素的生物合成,揭示了Rab7調(diào)控病原菌DON毒素合成的分子機(jī)制;孟瑤[47]通過酵母雙雜交和qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)Rabring7是Rab7的效應(yīng)因子,Rabring7在禾谷鐮刀菌的DON毒素合成、對(duì)脅迫的敏感性、致病性等方面具有調(diào)控作用,為揭示禾谷鐮刀菌的致病機(jī)制和DON毒素合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。LI等[48]利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌HOPS復(fù)合體的亞基FgVps41是FgRab7的效應(yīng)因子,其對(duì)病原菌的生長發(fā)育、分生孢子形態(tài)、DON毒素產(chǎn)生及致病力均起重要作用。

此外,在稻瘟病菌中,李忠春[49]通過基因敲除、表型分析和酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)MoYIP3可能是MoRab51的效應(yīng)因子。試驗(yàn)證明,MoYIP3與MoRab51的CA(GTP結(jié)合狀態(tài))和DN(GDP結(jié)合狀態(tài))狀態(tài)下均不互作,推測該蛋白雖不與MoRab51直接互作,但它的表達(dá)可能受到MoRab51的調(diào)控,從而參與了MoRab51的信號(hào)傳導(dǎo)與物質(zhì)運(yùn)輸。而吳淙賢[50]利用基因敲除、表型分析和免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行試驗(yàn),推測稻瘟病菌Retromer復(fù)合物核心成員MoVPS35可能是MoYPT7的效應(yīng)因子,Co-IP試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),稻瘟病菌中MoYpt7和MoVps35存在互作關(guān)系,并使MoVps35與晚期內(nèi)涵體結(jié)合,且MoYpt7兩種不同結(jié)合狀態(tài)蛋白MoYpt7-CA和MoYpt7-DN都能和MoVps35互作,但MoVps35可能不是作為MoYpt7的效應(yīng)蛋白發(fā)揮功能。張曉杰等[51]利用基因敲除、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)對(duì)稻瘟病菌HOPS復(fù)合體進(jìn)行研究,并構(gòu)建了ΔMoVps41缺失突變體,結(jié)果表明,在ΔMoVps41突變體中找不到GFP-MoYpt7在液泡膜的定位,也沒有明顯的液泡形態(tài),即在MoVps41缺失的情況下,液泡融合受阻,說明稻瘟病菌中HOPS復(fù)合體與MoYpt7可能在功能上有互作關(guān)系。

2.4 植物病原真菌Rab蛋白的功能

真菌常見的Rab家族蛋白主要由Ypt1、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7和Sec4組成,各蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能不同。Ypt1在分泌途徑的早期調(diào)控囊泡從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn);Ypt3參與深層次的胞吞作用;Ypt5負(fù)責(zé)將蛋白質(zhì)從高爾基體和質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)絻?nèi)涵體;Ypt6調(diào)控蛋白質(zhì)從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體內(nèi)的運(yùn)輸;Ypt7蛋白介導(dǎo)液泡融合;Sec4則主要參與極性生長和相關(guān)分泌途徑,介導(dǎo)來源于TGN(順面高爾基體網(wǎng)狀膜囊)的囊泡進(jìn)入芽體[42]。

除此之外,植物病原真菌Rab家族蛋白的表達(dá)也參與指導(dǎo)病原菌自身的各種表型特征。研究報(bào)道,在多種植物病原真菌中,Rab家族蛋白均與菌絲的形態(tài)及生長速率、分生孢子產(chǎn)量及孢子萌發(fā)率、致病性、毒素產(chǎn)生等息息相關(guān)。

YUAN等[52]利用重疊延伸PCR構(gòu)建禾谷鐮刀菌FgRab1(Rab1/Ypt1同源基因)缺失突變體,并對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位和表型分析,研究表明,該基因定位于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和菌絲尖端,與野生型相比,禾谷鐮刀菌ΔFgRab1營養(yǎng)生長減弱、細(xì)胞壁厚度增加、菌絲分枝增多,致病力減弱。

齊堯堯等[53]用同源重組的方法對(duì)禾谷炭疽菌CgRab4(Rab4/Ypt4同源基因)進(jìn)行基因敲除,結(jié)果表明,基因缺失促進(jìn)菌絲生長,但不影響菌絲形態(tài),且不參與對(duì)外界脅迫響應(yīng)的調(diào)控,突變體菌株的分生孢子形態(tài)和產(chǎn)量、附著胞的產(chǎn)生以及對(duì)玉米的致病力都沒有顯著變化。

PENALVA等[54]對(duì)構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)RabB(Rab5/Ypt5同源蛋白)的功能進(jìn)行了基因敲除、亞細(xì)胞定位、GST-pull down等研究,結(jié)果表明,RabB調(diào)控早期內(nèi)涵體的降解過程,并協(xié)調(diào)早期內(nèi)涵體向高爾基體的運(yùn)輸、長距離轉(zhuǎn)運(yùn)以及早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的成熟過程。楊文晟[55]對(duì)荔枝霜疫霉(Peronophythoralitchii)PlRAB5A(Rab5/Ypt5同源基因)進(jìn)行基因敲除、亞細(xì)胞定位及一系列表型研究,結(jié)果表明,PlRAB5A定位于囊泡膜和初級(jí)內(nèi)涵體上,可能在整個(gè)荔枝霜疫霉生活史中均行使功能,在孢子囊階段更加重要,而在休止孢萌發(fā)階段相對(duì)較弱,且敲除突變體生長速率顯著降低,菌絲形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則膨大且隔膜增多,釋放的游動(dòng)孢子數(shù)降低,致病力顯著降低。在大豆疫霉(Phytophthorasojae)中進(jìn)行基因沉默和表型分析,結(jié)果表明,PsVPS21(Rab5/Ypt5同源基因)缺失突變體的生長速率顯著降低,產(chǎn)孢量下降,休止孢萌發(fā)形態(tài)異常,菌絲呈現(xiàn)多分支、頂端和分支處膨大,細(xì)胞壁成分的分布明顯發(fā)生改變,缺失突變體致病性降低,胞外蛋白分泌顯著減少,對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力也更加敏感[56]。

OHSUMI等[57]發(fā)現(xiàn),構(gòu)巢曲霉avaA(Rab7/Ypt7同源基因)基因缺失突變體導(dǎo)致菌株液泡高度碎片化,該基因過表達(dá)嚴(yán)重抑制菌絲生長,并導(dǎo)致液泡異常腫脹。在稻瘟病菌中構(gòu)建綠色熒光蛋白載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位,MoYpt7(Rab7/Ypt7同源蛋白)主要定位于液泡膜,敲除MoYPT7基因后,突變體的分生孢子畸形,不能形成附著胞,不具有致病性,且表現(xiàn)出自噬損傷、破壞細(xì)胞壁完整性以及對(duì)鈣和重金屬脅迫更高的敏感性[58]。在果生炭疽菌中進(jìn)行基因敲除和一系列表型觀察,結(jié)果顯示突變體ΔCfrab7(Rab7/Ypt7同源基因)的菌落直徑顯著減小,產(chǎn)孢量和附著孢顯著減少,不能穿透玻璃紙,H2O2脅迫下生長受到明顯抑制;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變體ΔCfrab7液泡無法正常融合,對(duì)油茶的致病力顯著下降[59]。張小龍等[60]通過基因敲除和表型觀察對(duì)蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,VmRAB7(Rab7/Ypt7同源基因)基因的缺失使菌絲生長速率降低了約40%,致病力降低了約50%,突變體喪失了產(chǎn)孢能力,ΔVmrab7敲除突變體具有小且多的碎片化液泡,液泡中無球狀的自噬體結(jié)構(gòu)。在禾谷鐮刀菌中進(jìn)行FgRab7基因敲除和表型觀察后發(fā)現(xiàn),與野生型相比,缺失FgRab7基因?qū)е戮晟L速度減慢,產(chǎn)孢量明顯下降,并且敲除FgRab7菌株的DON毒素合成量顯著降低[61-62]。

ZHANG等[63]利用基因敲除、Southern blot、qRT-PCR等技術(shù)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)灰霉病菌(Botrytiscinerea)Bcsas1(Rab8/Sec4同源基因)突變體抑制了病原菌菌絲發(fā)育和孢子形成,降低了對(duì)寄主番茄、蘋果等的毒力,并顯著抑制多糖水解酶和蛋白酶的分泌。POWERS等[64]在煙曲霉(A.fumigatus)中研究了Sec4的同源蛋白SrgA(Rab8/Sec4同源蛋白),亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,GFP-SrgA融合蛋白優(yōu)先在菌絲尖端和成熟的分生孢子梗處積累,突變體的表型試驗(yàn)顯示,ΔSrgA菌絲生長速率受到抑制,并導(dǎo)致分生孢子梗畸形,分生孢子形態(tài)異常,且SrgA突變體的每個(gè)分離株(A/B/C)顯示出不同的耐熱性、體外應(yīng)激反應(yīng)和致病性。黃彩敏等[65]利用同源重組方法構(gòu)建了大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)VdSec4(Rab8/Sec4同源基因)敲除突變體,分別以纖維素、果膠為單一碳源進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)突變體菌株較野生型的生長能力延緩,暗示突變體果膠酶、纖維素酶等胞外蛋白的分泌能力受限,并利用蛋白定量技術(shù)(iTRAQ)比較了突變體菌株和野生型菌株的胞外蛋白譜,發(fā)現(xiàn)有332個(gè)蛋白因VdSec4缺失無法分泌,且突變體菌株對(duì)寄主棉花的致病力顯著下降。而在辣椒疫霉中(P.capsici)進(jìn)行了基因敲除和表型分析試驗(yàn),結(jié)果表明,敲除Sec4同源基因后辣椒疫霉菌絲生長受到一定程度的抑制,但游動(dòng)孢子產(chǎn)量和休止孢萌發(fā)無明顯影響,致病力顯著下降,初步推測辣椒疫霉中Sec4同源基因可能與辣椒疫霉的致病力相關(guān)[66]。

3 展望

Rab家族蛋白是真核生物中一類具有重要生物學(xué)功能的蛋白,研究數(shù)據(jù)表明,植物病原真菌中的Rab蛋白對(duì)其自身生命活動(dòng)和對(duì)寄主植物的寄生致病非常重要,并能與其上下游信號(hào)因子互作,通過Rab蛋白循環(huán)途徑不斷地發(fā)揮功能。到目前為止,對(duì)植物病原真菌Rab蛋白的功能研究已取得了一定的進(jìn)展,但植物病原真菌中仍然缺少系統(tǒng)性的針對(duì)Rab蛋白家族的研究,每種Rab蛋白的上下游信號(hào)調(diào)控因子尚未完全解析,此外,植物病原真菌中的Rab蛋白能否與寄主植物直接互作,或Rab蛋白是否能通過調(diào)控效應(yīng)蛋白的分泌從而引發(fā)植物免疫反應(yīng)等問題仍未涉及。加深對(duì)植物病原真菌中Rab蛋白家族功能的了解,將更加有利于多角度解析多種植物病原真菌的致病機(jī)制,為制定合理的病害防治策略提供理論指導(dǎo)意義。