韓雨潼，岳增良，張國(guó)印，郜 靜，李 玭，王立安，李守勉，趙振重，劉曉薇，王 凌

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所，河北石家莊 050051；2.河北省羊肚菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北邢臺(tái) 055450；3.河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050051；4.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊 050024；5.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071001；6.河北省柏鄉(xiāng)縣自然資源和規(guī)劃局，河北邢臺(tái) 055450)

羊肚菌屬子囊菌門(mén)(Ascomycota)盤(pán)菌綱(Pezizomycetes)盤(pán)菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，是土生類真菌，俗名羊肚菜，有“菌王之王”的美譽(yù)[1]。它富含多糖、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、微量元素(硒、有機(jī)鍺)、氨基酸等[2]，具備極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。基于生物學(xué)特性研究，羊肚菌具有康體抗癌、促進(jìn)機(jī)體免疫活性等多種作用[3-6]，由于野生羊肚菌稀缺導(dǎo)致羊肚菌市場(chǎng)供不應(yīng)求、有價(jià)無(wú)市，故近年來(lái)人工栽培羊肚菌發(fā)展勢(shì)頭迅猛[7-8]。我國(guó)現(xiàn)有30個(gè)種類的羊肚菌，占全球總類的一半(30/61)，基于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分類：羊肚菌黑色類群13個(gè)，黃色類群17個(gè)[9-10]。目前，我國(guó)人工栽培羊肚菌成功馴化的品種主要集中在黑色類群中的六妹羊肚菌(Morchellasextelata，編號(hào)：Mel-6)、七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata，編號(hào)：Mel-7)、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna，編號(hào)：Mel-10)[11]。

研究表明，羊肚菌生長(zhǎng)與土壤環(huán)境密切相關(guān)[12]，然而目前針對(duì)羊肚菌根際土壤的相關(guān)研究甚少。國(guó)外羊肚菌相關(guān)研究現(xiàn)狀趨于在分子生物學(xué)水平上利用其生物學(xué)特性來(lái)研究羊肚菌的藥用價(jià)值[13-14]和基于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定新的羊肚菌物種[15]；國(guó)內(nèi)羊肚菌產(chǎn)業(yè)研究在野生羊肚菌及其生長(zhǎng)土壤生境相關(guān)方面取得一些進(jìn)展，最新研究進(jìn)展表明，新疆昭蘇縣黑色腐質(zhì)土上層(0～20 cm)羊肚菌根際微生物多樣性最豐富，且土樣中富含多種固氮菌[16]。甘肅省野生羊肚菌所處生境中，土壤含水量、養(yǎng)分對(duì)其根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群影響程度較大[17]，速效鉀、谷氨酰胺酶與真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(子囊菌門(mén))呈顯著正相關(guān)關(guān)系[18]。

前人研究中缺乏人工栽培羊肚菌根際土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌群與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性以及群落功能代謝途徑的研究。根據(jù)河北省羊肚菌產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀[19]，土壤生境與設(shè)施環(huán)境調(diào)控是影響羊肚菌產(chǎn)量的兩大因素，本研究通過(guò)對(duì)根際土壤微生物群落進(jìn)行高通量測(cè)序，分析不同種植年限的土壤生境中種植羊肚菌后的微生物群落多樣性、群落組成、菌群同土壤環(huán)境因子的互作關(guān)系，以及真菌群落主要代謝途徑，為探究羊肚菌根際微環(huán)境，制定適宜河北省人工栽培羊肚菌生長(zhǎng)的土壤生境標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料基本信息

供試材料采樣時(shí)間為2021年8月，試驗(yàn)田位于河北省邢臺(tái)市柏鄉(xiāng)縣(114°70′E，37°48′N)。采樣點(diǎn)種植品種為六妹羊肚菌，試驗(yàn)分設(shè)3組采樣：未種植羊肚菌的對(duì)照樣本(編號(hào)：CK)、種植1年羊肚菌的樣本(編號(hào)：OYC)、種植4年羊肚菌的樣本(編號(hào)：FYC)，上述土壤質(zhì)地分類參照《中國(guó)土壤》[20]。分別進(jìn)行根際土壤取樣[21]，每組樣品3次重復(fù)，共9個(gè)樣本，用干冰低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃冷凍柜儲(chǔ)存?zhèn)溆?。樣本理化性質(zhì)及酶活性詳見(jiàn)表1。

表1 樣本根際土壤理化性質(zhì)及酶活性

1.2 土壤理化性質(zhì)與酶活性測(cè)定方法

采用光度法測(cè)定銨態(tài)氮含量；紫外分光光度計(jì)法測(cè)定硝態(tài)氮含量；凱式定氮法測(cè)定土壤含氮量；電位法測(cè)定土壤pH值；利用電導(dǎo)法測(cè)定電導(dǎo)率；利用乙酸銨法測(cè)定土壤陽(yáng)離子交換量；使用火焰原子吸收儀測(cè)定速效鉀含量；碳酸氫鈉浸提法測(cè)定速效磷含量；全磷、全鉀的含量均使用火焰光度計(jì)基于氫氧化鈉熔融法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)含量由重鉻酸鉀容量法測(cè)定；灼燒法測(cè)定有機(jī)磷含量；尿素殘留量法測(cè)定土壤脲酶活性；磷酸單酯酶活性的測(cè)定采用對(duì)硝基苯磷酸鹽法；易氧化性有機(jī)碳含量的測(cè)定基于高錳酸鉀氧化法[22-23]。

1.3 樣本DNA抽取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

使用試劑盒MP-soil抽提樣本土壤微生物群落全部DNA后，將利用1%瓊脂糖凝膠電泳提取的基因組DNA通過(guò)使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(編號(hào)：ND-2000)對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定；使用MiSeqPE30平臺(tái)，對(duì)真菌ITS1F_ITS2R區(qū)域利用PCR擴(kuò)增引物：ITS1F(5′-C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A-3′)和ITS2R(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′)[24]。PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，停止于10 ℃。將各樣本重復(fù)3次后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其混合后的PCR產(chǎn)物，后采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒高效回收。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于統(tǒng)計(jì)學(xué)使用貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列(相似水平97%)進(jìn)行分類運(yùn)算以獲得每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息；使用Unite數(shù)據(jù)庫(kù)[25]，對(duì)微生物群落進(jìn)行了α多樣性分析；利用R語(yǔ)言工具，分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成、屬水平物種豐度聚類分析；通過(guò)VIF方差膨脹因子分析和RDA分析，反映樣本的真菌優(yōu)勢(shì)菌群與土壤環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌根際土壤真菌群落多樣性及組成分析

2.1.1 羊肚菌根際土壤真菌多樣性分析 由表2可知，3組樣本的真菌群落覆蓋率都達(dá)到99.9%，極大地保證了本次數(shù)據(jù)分析結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性。與未種植羊肚菌的對(duì)照樣本CK相比，種植1年的OYC和種植4年的FYC這2組樣本中真菌Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)，Simpson指數(shù)相對(duì)較高，說(shuō)明種植羊肚菌后的土壤生境中真菌群落豐度、多樣性均有一定程度的降低。

表2 羊肚菌根際土壤真菌α多樣性分析

2.1.2 羊肚菌根際土壤真菌群落組成分析 門(mén)水平上，共檢測(cè)到13個(gè)真菌群落。由圖1可知，CK的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)包括子囊菌門(mén)(Ascomycota)(79.89%)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)(9.38%)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)(6.40%)；樣本OYC的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為子囊菌門(mén)(93.12%)、unclassified_k_Fungi(5.45%)；樣本FYC的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)僅有子囊菌門(mén)(95.60%)。各類樣本中排名第1位的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)都是子囊菌門(mén)，也是羊肚菌本身所屬的菌門(mén)，在OYC和FYC樣本中，子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度與CK相比，分別增加了13.23百分點(diǎn)和15.71百分點(diǎn)。說(shuō)明隨著種植年限增加，子囊菌門(mén)的菌群豐度逐年提升。

由圖2可知，綱水平上，共檢測(cè)到42個(gè)真菌群落。糞殼菌綱(Sordariomycetes)(53.35%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)(9.38%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)(9.15%)是CK的優(yōu)勢(shì)菌綱，樣本OYC的優(yōu)勢(shì)菌綱包括糞殼菌綱(59.85%)、座囊菌綱(Dothideomycetes)(15.71%)和散囊菌綱(10.00%)，樣本FYC的優(yōu)勢(shì)菌綱為糞殼菌綱(68.75%)、散囊菌綱(9.17%)。各類樣本中排名第1位的優(yōu)勢(shì)菌綱均為糞殼菌綱，其相對(duì)豐度在OYC和FYC樣本中較CK，分別提升了6.50百分點(diǎn)和15.40百分點(diǎn)。說(shuō)明隨種植年限增加，糞殼菌綱的菌群豐度逐年提升。

2.2 羊肚菌根際土壤真菌群落聚類分析

對(duì)3組樣本基于屬水平進(jìn)行物種分類，選擇總豐度前20的物種，依據(jù)相對(duì)豐度將其分塊聚集，并結(jié)合物種所屬的綱水平更為明晰地展現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群。被孢霉屬(Mortierella)作為CK的優(yōu)勢(shì)菌屬，它隸屬于被孢霉綱，且相對(duì)豐度為9.15%。樣本OYC的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬棘殼孢屬(Pyrenochaetopsis)，隸屬于座囊菌綱，相對(duì)豐度為12.05%。樣本FYC中的優(yōu)勢(shì)菌屬新赤殼屬(Neocosmospora)、毛殼菌屬(Chaetomium)，同屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)，相對(duì)豐度分別為16.43%、13.46%。說(shuō)明3組樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬具有很大差異性，且各組樣本優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度都高于其他2組該菌屬的相對(duì)豐度(圖3)。

2.3 羊肚菌根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析

2.3.1 VIF方差膨脹因子分析 在RDA分析之前，首先將土壤環(huán)境因子進(jìn)行VIF方差膨脹因子分析，篩選后保留多重共線性較小的土壤環(huán)境因子(VIF<5)為速效鉀含量、磷酸單酯酶活性、有機(jī)質(zhì)含量、含水率、銨態(tài)氮含量和速效磷含量(表3)。

表3 VIF方差膨脹因子分析篩選后的VIF

2.3.2 真菌與土壤環(huán)境因子的冗余分析 選取相對(duì)豐度前5的真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，且土壤環(huán)境因子對(duì)其影響程度表現(xiàn)為含水率>銨態(tài)氮含量>有機(jī)質(zhì)含量>速效磷含量>速效鉀含量>磷酸單酯酶活性。優(yōu)勢(shì)菌門(mén)排名第1位的子囊菌門(mén)與速效鉀含量、速效磷含量、銨態(tài)氮含量、含水率呈正相關(guān)關(guān)系，且與速效磷、速效鉀含量顯著正相關(guān)，而與磷酸單酯酶活性、有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；分別排在第2、3位的被孢霉門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)均與含水率、磷酸單酯酶活性呈正相關(guān)關(guān)系，與銨態(tài)氮含量等其他4個(gè)環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，捕蟲(chóng)霉門(mén)(Zoopagomycota)與銨態(tài)氮含量、速效磷含量、速效鉀含量呈正相關(guān)關(guān)系，而與含水率、有機(jī)質(zhì)含量、磷酸單酯酶活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4)。

2.4 羊肚菌根際土壤真菌群落代謝通路分析

通過(guò)FUNGuild對(duì)真菌進(jìn)行功能分類，主要功能是腐生真菌代謝，說(shuō)明腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌大量存在，其主要作用是加速土壤腐殖質(zhì)的形成和分解，促進(jìn)碳、氮循環(huán)。各樣本功能預(yù)測(cè)中排名第1的均是未定義的腐生真菌(Undefined Saprotroph)，其相對(duì)豐度在CK、OYC、FYC樣本中分別是23.57%、29.77%、38.77%，OYC、FYC樣本與CK相比，其相對(duì)豐度分別增加了6.20百分點(diǎn)、15.20百分點(diǎn)，說(shuō)明種植羊肚菌更能促進(jìn)腐生真菌代謝效率(圖5)。

通過(guò)PICRUSt2對(duì)ITS測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和豐度統(tǒng)計(jì)，由圖6可知，各樣本中相對(duì)豐度最高的是EC編號(hào)為3.6.1.3的酶，基于brenda酶數(shù)據(jù)庫(kù)(BRENDA Enzyme Database，https：//www.brenda-enzymes.info)進(jìn)行查詢統(tǒng)計(jì)，三磷酸腺苷酶(酶編號(hào)：EC3.6.1.3，簡(jiǎn)稱ATPase)，屬于水解酶，作用于酸酐，在含磷酸酐中，催化水解三磷酸腺苷(ATP)，產(chǎn)物為二磷酸腺苷(ADP)和無(wú)機(jī)磷酸，即為羊肚菌提供土壤生長(zhǎng)環(huán)境中可吸收的無(wú)機(jī)磷。

3 討論與結(jié)論

早期研究表明，植物根際是一個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)境，植物種類和土壤類型兩大主要因素決定作物根系附近微生物群落結(jié)構(gòu)，且根際微生物群落組成與植物互相影響[27-29]。羊肚菌作為草腐菌，不同于木腐菌生長(zhǎng)與林木具有菌根關(guān)系[30]，而人工栽培羊肚菌，缺乏森林、草木等多元環(huán)境，必然更多受到土壤理化性質(zhì)、微生物優(yōu)勢(shì)菌群等多種自然因素及人為施用農(nóng)田投入品因素的影響。本次研究結(jié)果表明，在北方pH值呈堿性土壤中種植羊肚菌不同年限后，其根際土壤真菌菌群組成發(fā)生變化，物種多樣性大幅降低，相較于陳誠(chéng)等在四川酸性土壤中得出的羊肚菌栽培后真菌多樣性降低的結(jié)論[31]，說(shuō)明種植羊肚菌后真菌多樣性降低這一結(jié)果可能與土壤pH值沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。未種植羊肚菌時(shí)，優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)包括子囊菌門(mén)、被孢霉門(mén)及擔(dān)子菌門(mén)，而種植羊肚菌后，隨著年限增長(zhǎng)，子囊菌門(mén)趨向于最優(yōu)勢(shì)菌群。通過(guò)對(duì)比趙玉卉等在甘肅野生羊肚菌根際土壤樣本中得出的優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)[18]這一結(jié)論，表明在野生羊肚菌與人工栽培羊肚菌這2種不同生境中，羊肚菌所在的子囊菌門(mén)始終占優(yōu)勢(shì)，且其下的糞殼菌綱隨種植年限增長(zhǎng)，其優(yōu)勢(shì)型亦更為明顯，表明土壤中的真菌多樣性隨種植年限的增加而逐漸趨于單一化。

已有研究表明，羊肚菌子實(shí)體生長(zhǎng)需要大量養(yǎng)分?jǐn)z入，保持土壤中氮、磷等元素的平衡可促使羊肚菌出菇[32-33]。本次研究結(jié)果表明，含水率、銨態(tài)氮含量、有機(jī)質(zhì)含量、速效磷含量、速效鉀含量、磷酸單酯酶活性這些土壤環(huán)境因子對(duì)羊肚菌生長(zhǎng)確實(shí)具有顯著影響，且速效磷、速效鉀含量與羊肚菌所在的子囊菌門(mén)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而磷酸單酯酶活性、有機(jī)質(zhì)含量與其呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。目前，報(bào)道的研究成果中，閻威文等研究發(fā)現(xiàn)，影響吉林遼源地區(qū)羊肚菌根際真菌優(yōu)勢(shì)菌群的最重要的土壤環(huán)境因子是全氮、有機(jī)碳[34]。全氮是土壤當(dāng)中全部的氮養(yǎng)分，而銨態(tài)氮是土壤中無(wú)機(jī)氮里最易被作物直接吸收的活性氮，故本研究結(jié)果有更進(jìn)一步的細(xì)化，同時(shí)也作為甘肅野生羊肚菌根際土壤中子囊菌門(mén)與速效鉀含量、谷氨酰胺酶活性、脲酶活性等呈正相關(guān)關(guān)系這一結(jié)論的差異對(duì)比及內(nèi)容補(bǔ)充[18]。

在同一地塊連續(xù)多年種植羊肚菌后，腐生真菌隨著年限增長(zhǎng)，土壤中腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度增長(zhǎng)了6.20百分點(diǎn)(樣本OYC)、15.20百分點(diǎn)(樣本FYC)，腐生真菌易攜帶病原體，說(shuō)明土壤病蟲(chóng)害隱患增加，故在田間管理中需注意土傳病害感染的預(yù)防，應(yīng)選擇適宜的土壤調(diào)理劑品類，在今后的研究中將作進(jìn)一步探究。且真菌功能作用的主要代謝途徑為三磷酸腺苷酶(ATPase)通過(guò)催化水解釋放能量的過(guò)程，即轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供羊肚菌吸收。ATP酶配體相互作用，土壤中有機(jī)物對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制或活化作用，基于功能預(yù)測(cè)結(jié)果中腐生真菌的大量衍生，可以猜測(cè)腐生真菌對(duì)ATP酶具有活化作用。

綜上，本研究作為人工栽培羊肚菌根際土壤相關(guān)研究的重要發(fā)現(xiàn)，探討了土壤環(huán)境與種植年限導(dǎo)致羊肚菌根際土壤真菌群落多樣性與群落組成變化，發(fā)現(xiàn)了人工栽培過(guò)程中對(duì)真菌優(yōu)勢(shì)菌群最具影響的土壤環(huán)境因子，明確了真菌優(yōu)勢(shì)菌群主要功能及酶代謝途徑，對(duì)今后河北省羊肚菌人工栽培管理措施的標(biāo)準(zhǔn)化制定具有重要意義。