喬婷婷 ，張志宏 ，周俊發(fā) ，葉仕高 ，曾元寧 ，王秋紅 ， （.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/廣東省中藥飲片規(guī)范化炮制工程技術(shù)研究中心，廣州 50006；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室，哈爾濱 50040）

膽紅素（bilirubin）是我國傳統(tǒng)名貴中藥牛黃的主要指標(biāo)性成分。2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，天然牛黃中膽紅素含量不得少于25.0%[1]。國內(nèi)外大量研究表明，膽紅素具有良好的抗炎[2]、抗氧化[3]和免疫調(diào)節(jié)[4]作用。但由于膽紅素的水溶性較差，生物利用度低[5]，其臨床應(yīng)用一直受到限制。20世紀(jì)80年代以前，人們曾將膽紅素溶于強堿性溶液來增大其溶解度[6]，但溶解后的膽紅素非常不穩(wěn)定，在臨床應(yīng)用過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的不良反應(yīng)。2017年，Dekker等[7]在溶有膽紅素的堿性溶液中加入過量白蛋白，使膽紅素與白蛋白緊密結(jié)合。此法制備的膽紅素雖然穩(wěn)定性得到了提高，但由于半衰期較短，仍然不能滿足臨床使用需求。因此，如何在改善膽紅素溶解度的同時保障其穩(wěn)定性、提高其生物利用度成為了推動膽紅素應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

納米制劑是由納米載體通過靜電吸附、共價或非共價連接等方式將藥物結(jié)合在載體表面或直接將藥物包裹在載體內(nèi)部制成的一類新型藥物制劑[8]。與傳統(tǒng)藥物相比，納米制劑在促進(jìn)藥物吸收、藥物靶向遞送、提高藥物生物利用度等方面具有顯著優(yōu)勢[9]。近年來，國內(nèi)外各研究團(tuán)隊將水溶性高分子材料與疏水的膽紅素分子共價結(jié)合，通過自組裝形成納米顆粒，稱之為膽紅素納米顆粒（bilirubin nanoparticles，BRNPs）[10]。BRNPs的出現(xiàn)為推動膽紅素的臨床應(yīng)用提供了新的機遇。筆者通過查閱文獻(xiàn)，綜述了近年來BRNPs的藥理作用研究進(jìn)展，以期為膽紅素的進(jìn)一步開發(fā)研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 BRNPs的藥理作用

近年來，BRNPs已被廣泛用于炎癥、氧化應(yīng)激損傷和免疫性疾病的臨床前研究中（表1），其在胃腸道疾病、肝腎疾病、皮膚疾病、自身免疫性疾病、胰島移植以及腫瘤的靶向治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。

表1 BRNPs在炎癥、氧化應(yīng)激損傷和免疫性疾病中的應(yīng)用研究

1.1 BRNPs對胃腸道疾病的作用

Huang等[11]通過CS和膽紅素的共軛連接自組裝成殼聚糖?膽紅素（chitosan?bilirubin，CS?BR）納米顆粒，在體內(nèi)和體外研究了其對急性胃潰瘍的保護(hù)作用。結(jié)果表明，CS?BR納米顆?？捎行б种萍?xì)胞和組織中炎癥因子的分泌，改善黏膜再生，對乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍具有顯著療效。該研究還發(fā)現(xiàn)，與單獨應(yīng)用膽紅素相比，帶有正電荷的CS通過靜電相互作用與帶負(fù)電的生物膜結(jié)合，黏附在黏膜病變處，使得CS?BR納米顆粒能夠在胃中長期潴留，有效促進(jìn)了膽紅素對胃潰瘍的長效治療。

Lee等[12]制備了透明質(zhì)酸?膽紅素（hyaluronic acid?bilirubin，HA?BR）納米顆粒，用于結(jié)腸炎治療。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中，HA?BR納米顆粒靶向積聚在炎癥結(jié)腸部位，通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群，恢復(fù)緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)和腸道屏障功能，對急性結(jié)腸炎發(fā)揮強大的治療作用。

1.2 BRNPs對肝腎疾病的作用

據(jù)報道，血清總膽紅素水平與血液中三酰甘油水平呈負(fù)相關(guān)[27]。Hinds等[14]使用飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠，探究了聚乙二醇?膽紅素（polyethylene glycol?bilirubin，PEG?BR）納米顆粒對肝臟脂質(zhì)積累的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，PEG?BR組小鼠肝臟脂肪堆積明顯減少，血清載脂蛋白、三酰甘油和極低密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低，表明PEG?BR納米顆?？纱龠M(jìn)脂肪酸攝取和脂質(zhì)利用，激活肝臟β?氧化通路，抑制脂肪生成，改善脂肪肝。

此外，BRNPs還可用于改善急性肝腎損傷。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在暴露于過氧化氫的原代肝細(xì)胞中，PEG?BR納米顆粒具有強大的抗氧化和抗凋亡活性；在小鼠肝缺血再灌注損傷模型中，PEG?BR納米顆粒優(yōu)先積聚在炎癥病變部位，通過減少氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞黏附分子表達(dá)和中性粒細(xì)胞的招募，對肝細(xì)胞損傷發(fā)揮顯著的保護(hù)作用。Huang等[16]報道了一種由透明質(zhì)酸包被的ε?聚賴氨酸膽紅素結(jié)合物納米顆粒（hyaluronic acid coatedε?polylysine?bilirubin conjugate，nHA/PLBR），其可靶向積聚于腎損傷部位，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能，抑制腎小管細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎臟恢復(fù)。

1.3 BRNPs對皮膚疾病的作用

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，與細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，激活促炎信號級聯(lián)有關(guān)[28]。Jiang等[17]在小鼠銀屑病模型中評估了水凝膠?膽紅素納米顆粒的治療效果。結(jié)果顯示，經(jīng)該納米顆粒局部治療可有效改善銀屑病癥狀，且與皮質(zhì)類固醇相比，不會引起全身細(xì)胞毒性。機制研究結(jié)果表明，BRNPs很容易被角質(zhì)形成細(xì)胞吸收，通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)外ROS水平，抑制銀屑病相關(guān)促炎細(xì)胞因子的釋放和自身抗原的產(chǎn)生，從而有效減緩銀屑病皮膚炎癥的進(jìn)展。

除了用于炎癥性皮膚病的治療，BRNPs還可用于皮膚創(chuàng)面愈合。pluronic F?127是一種非離子共聚物表面活性劑，Kamothi等[19]用其包裹膽紅素，制備了粒徑為100～150 nm的球形膽紅素納米顆粒（pluronic?bilirubin nanoparticles，P?BRNPs）；局部應(yīng)用14 d后，可使大鼠皮膚創(chuàng)面面積顯著縮小、創(chuàng)面收縮顯著增加，且該組大鼠皮膚上皮化程度和創(chuàng)面成熟度在所有治療組中最高。該研究表明，P?BRNPs可通過調(diào)節(jié)參與創(chuàng)面炎癥和增殖階段的不同細(xì)胞因子和生長因子的水平，顯著提高大鼠皮膚創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

1.4 BRNPs對自身免疫性疾病的作用

膽紅素能夠誘導(dǎo)成熟免疫細(xì)胞壞死和凋亡，對機體的先天免疫和適應(yīng)性免疫均具有不同程度的抑制作用[29]。Kim等[20]在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，評估了PEG?BR納米顆粒作為治療藥物的潛力。結(jié)果表明，多次靜脈注射PEG?BR納米顆粒能夠顯著降低該疾病的發(fā)病率，抑制疾病進(jìn)展，控制疾病嚴(yán)重程度，且不存在系統(tǒng)性免疫抑制。該研究發(fā)現(xiàn)，PEG?BR納米顆粒通過清除樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中過量產(chǎn)生的ROS來抑制抗原遞呈細(xì)胞成熟，從而負(fù)向調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。另有研究發(fā)現(xiàn)，PEG?BR納米顆?？赏ㄟ^直接抑制CD4+T細(xì)胞激活，減輕小鼠過敏性哮喘癥狀，并顯著改善其肺部炎癥[21]?？梢姡琍EG?BR納米顆粒有潛力作為一種新的納米藥物用于治療各種與CD4+T細(xì)胞相關(guān)的自身免疫性疾病。

1.5 BRNPs對胰島移植的作用

胰島移植常用來治療胰島素依賴性1型糖尿病，通過將產(chǎn)生胰島素的B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到糖尿病患者體內(nèi)，從而恢復(fù)其血糖濃度的生理調(diào)節(jié)功能。但胰島移植常常因為胰島移植物遭受氧化應(yīng)激和非特異性炎癥而失敗。為此，Yao等[24]將活化的β?環(huán)糊精偶聯(lián)到ε?聚賴氨酸的側(cè)鏈上，將此共軛物（β?cyclodextrin?conjugatedε?polyly‐sine，PLCD）作為載體，通過主?客體相互作用來裝載膽紅素，構(gòu)建膽紅素超分子體系（PLCD?BR）。體外實驗結(jié)果表明，PLCD?BR能夠顯著增強胰島對過度氧化應(yīng)激和炎癥的抵抗力，最大限度地維持胰島功能；PLCD?BR隨胰島移植到小鼠體內(nèi)后，可顯著延長糖尿病小鼠的血糖穩(wěn)定時間。另外，Kim等[10]也曾報道，PEG?BR納米顆?？赏ㄟ^清除ROS分子來保護(hù)胰島細(xì)胞免受化學(xué)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而顯著延長移植胰島的存活時間。

1.6 BRNPs的抗腫瘤作用

Yang等[26]采用聲化學(xué)法制備了牛血清白蛋白?膽紅素 （bovine serum albumin?bilirubin，BSA?BR）納米顆粒，并經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)其對HepG2腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移具有較強的抑制作用，能夠顯著抑制腫瘤生長，抑制率達(dá)40.6%。

此外，由于膽紅素具有良好的ROS響應(yīng)和光響應(yīng)特性，在抗腫瘤治療中，BRNPs還常常作為藥物遞送載體負(fù)載抗腫瘤藥物并發(fā)揮聯(lián)合治療作用。作為一種強大的內(nèi)源性抗氧化劑，膽紅素能夠清除各種ROS，保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化損傷。在清除ROS的過程中，疏水的膽紅素被氧化為水溶性更高的膽綠素[30]。同時，因膽紅素對光照敏感，故在適當(dāng)波長的光照射下，其分子內(nèi)的氫鍵被打破，發(fā)生光異構(gòu)化，轉(zhuǎn)化為幾種水溶性更強的光異構(gòu)體[31]。ROS和光照所導(dǎo)致膽紅素溶解度的變化使得膽紅素成為理想的藥物遞送載體。當(dāng)BRNPs接觸到ROS或受到光照時，膽紅素溶解度發(fā)生改變，導(dǎo)致BRNPs結(jié)構(gòu)被快速破壞，從而釋放被包裹的藥物。

BRNPs負(fù)載抗腫瘤藥物在腫瘤的靶向治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。一方面，由于高通透性和滯留效應(yīng)（腫瘤部位血管通透性增加，大分子物質(zhì)就可進(jìn)入腫瘤組織，而由于腫瘤內(nèi)部功能性淋巴回流系統(tǒng)的缺陷性，致使大分子物質(zhì)的清除減少，從而出現(xiàn)滯留現(xiàn)象）[12，23]，BRNPs會被動積聚在腫瘤部位，在ROS或其他因素的影響下響應(yīng)性釋放其所負(fù)載的抗腫瘤藥物。另一方面，通過對BRNPs進(jìn)行表面修飾，還可提高其主動靶向性。Lee等[32]利用BRNPs裝載抗腫瘤藥物阿霉素（doxorubi‐cin，DOX），組裝成納米顆粒DOX@BRNPs，并在荷瘤小鼠模型中驗證其抗腫瘤活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRNPs在650 nm波長的光照下被快速破壞，5 min內(nèi)超過80%的藥物被釋放；DOX組小鼠的腫瘤生長抑制率為27.8%，DOX@BRNPs組小鼠的腫瘤生長抑制率為55.0%，而DOX@BRNPs結(jié)合激光輻照組小鼠的腫瘤生長抑制率高達(dá)71.9%。Lee等[33]進(jìn)一步在負(fù)載DOX的BRNPs表面用生物素進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后的BRNPs能夠靶向過表達(dá)生物素轉(zhuǎn)運載體的癌細(xì)胞；與未標(biāo)記的BRNPs相比，前者的靶向性大大提高，抗腫瘤作用顯著增強。目前，BRNPs負(fù)載抗腫瘤藥物已被用于多種腫瘤的治療研究，詳見表2。

表2 BRNPs負(fù)載抗腫瘤藥物的應(yīng)用研究

2 展望

目前，BRNPs仍處于臨床前研究階段，尚未推廣到臨床應(yīng)用。大部分相關(guān)研究都缺乏藥物代謝動力學(xué)信息，因此亟待補充和完善其藥動學(xué)研究，推動臨床試驗進(jìn)行。此外，雖然BRNPs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究尚未廣泛開展，但有研究顯示，帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生及發(fā)展與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激損傷等因素息息相關(guān)[40]。考慮到膽紅素具有良好的抗炎、抗氧化等活性，BRNPs對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥理作用值得進(jìn)一步探究。

3 結(jié)語

BRNPs的劑型優(yōu)勢有效消除了膽紅素溶解性低的限制，使其能夠最大化地發(fā)揮抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫的藥理活性，在炎癥、氧化損傷、免疫性疾病的治療中取得較好的療效。當(dāng)作為藥物遞送系統(tǒng)負(fù)載抗腫瘤藥物時，BRNPs能夠顯著增強抗腫瘤效果，尤其在經(jīng)過表面修飾后，其靶向性大大提高，有潛力作為一種有效的靶向系統(tǒng)來治療各種腫瘤，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。目前我國對膽紅素的研究還主要集中在高膽紅素血癥上，但實際上，無論作為治療藥物，還是單純的藥物遞送系統(tǒng)，膽紅素都具有巨大的應(yīng)用潛力，而對膽紅素納米制劑的研究將極大地推動膽紅素的臨床應(yīng)用和相關(guān)的新藥研發(fā)。