胡 楊，申美倫，周怡民，杜尚銳,，韓 倩，郭 瑩，邢俊玲(空軍軍醫(yī)大學(xué)：軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系輻射防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員三大隊(duì)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員五大隊(duì)，陜西 西安 700)

紫外線是太陽光的組成部分，過度的紫外線輻射是人體暴露皮膚細(xì)胞損傷和癌癥發(fā)病的重要因素之一，其中起作用的主要是紫外線B段(ultraviolet B，UVB)，即280～320 nm范圍內(nèi)的紫外線輻射。短期較強(qiáng)的UVB光損傷，往往會(huì)在損傷部位產(chǎn)生外周炎癥性痛覺敏化，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康[1]。

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)是初級感覺神經(jīng)元胞體聚集的部位，其中也包含傷害感受器的胞體，即傳遞疼痛信號(hào)的神經(jīng)元。作為典型的假單極神經(jīng)元，DRG發(fā)出外周突終止于外周組織，其中樞突與脊髓背角形成突觸聯(lián)系，故而是機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境與脊髓連接的紐帶[2]?，F(xiàn)有研究表明，趨化因子CC配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2，CCL2]是慢性炎癥和神經(jīng)損傷等實(shí)驗(yàn)疼痛模型中常見的上調(diào)基因，它可以直接參與痛覺的調(diào)節(jié)過程，例如通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來增加DRG感覺神經(jīng)元中TRPV1通道和Nav1.8鈉通道的表達(dá)以提高興奮性[3-7]。在UVB輻射所引起的外周痛覺敏化中，CCL2是在DRG水平顯著上調(diào)的重要分子[3]，但其在DRG水平如何起作用尚未被揭示。

在DRG神經(jīng)元胞體周圍包繞著衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(satellite glial cells，SGC)，SGC間通過縫隙連接相互聯(lián)系[8-9]。SGC對DRG神經(jīng)元胞體起到支持、保護(hù)的作用，有助于神經(jīng)元胞體的存活，也起到調(diào)控神經(jīng)元周圍環(huán)境離子穩(wěn)態(tài)的作用。在神經(jīng)病理性疼痛模型中，SGC表達(dá)的Kir 4.1通道可以通過調(diào)控神經(jīng)元周圍K+來改變神經(jīng)元的興奮性，從而導(dǎo)致痛覺異常[10-11]。

基于以上背景，我們擬探究UVB輻射后DRG內(nèi)外周痛覺敏化的機(jī)制，即對在UVB致痛過程中是否也存在SGC的激活、SGC上Kir 4.1是否參與了該致敏過程、這一過程與CCL2是否存在交互作用等重要問題進(jìn)行深入的探討，以期對UVB輻射后損傷的治療及鎮(zhèn)痛提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量(24±2)g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件控制在12 h照明/12 h黑暗光照環(huán)境，溫度25 ℃，濕度40%～50%，自由飲水和進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格依據(jù)國家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》使用準(zhǔn)則施行，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[許可證號(hào)：SCXK(陜)2019- 001]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑 311 nm UVB燈(Philips，荷蘭)；紫外線輻照測試儀(林上公司，中國)；腦立體定位儀(瑞沃德，中國)；微量注射泵(瑞沃德，中國)；手持組織勻漿器(天根，中國)；MIKRO 220R低溫高速離心機(jī)(Hettich，德國)；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀(Molecular，美國)；Von-Frey纖維絲(美國)；PCR擴(kuò)增儀(Exicycler96，韓國)；冷凍切片機(jī)(Leica，德國)；熒光顯微鏡(Nikon，日本)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)；RNA提取試劑盒(天根，中國)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根，中國)；SYBRGreen PCR擴(kuò)增試劑盒(天根，中國)；兔抗MCP-1(Affinity，中國)；兔抗KCNJ10(Affinity，中國)；HRP結(jié)合的山羊抗兔488(Abcam，美國)；一抗稀釋液(Thermo，美國)；二抗稀釋液(Thermo，美國)；DAPI(Thermo，美國)；CCL2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Elabscience，中國)；Kir 4.1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(基因美，中國)。

1.2 方法

1.2.1 UVB造模及實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠于動(dòng)物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行以下三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。第一，取14只小鼠隨機(jī)分為2組，每組7只，進(jìn)行UVB足底照射，劑量分別為1 500 mJ/cm2和750 mJ/cm2，每秒照射劑量為0.5 mJ/cm2，從照射后第1日開始通過Von-Frey行為學(xué)測試觀察痛閾改變直至恢復(fù)；第二，選擇雙側(cè)足底1 500 mJ/cm2UVB照射后1、2、4、7 d的小鼠(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=7)，用PBS心臟灌注后取左右兩側(cè)L4、L5 DRG用于CCL2和Kir 4.1的檢測，并與未照射UVB的對照組動(dòng)物(n=5)進(jìn)行比較；第三，將1 500 mJ/cm2的UVB照射動(dòng)物分為UVB照射后的2 d對照組(n=7)、Bindarit組(n=7)、CCL2組(n=7)。Bindarit組在左側(cè)足底UVB照射1 d后在DRG內(nèi)注射Bindarit(CCL2的合成抑制劑)，CCL2組注射CCL2，在DRG注射24 h后灌注取左側(cè)L4、L5 DRG用于CCL2和Kir 4.1的檢測，并與UVB照射后的2 d對照組進(jìn)行比較。

1.2.2 DRG注射 小鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，剔除小鼠L4、L5椎骨附近毛發(fā)，剪開皮膚，分離肌肉，剪去左側(cè)L4、L5 DRG上方骨質(zhì)，使用微量注射器進(jìn)行注射，Bindarit組在左側(cè)L4、L5 DRG上方注射10 mol/L的Bindarit 2 μL，CCL2組以同樣的方式注射1.4 mg/L的CCL2 2 μL，逐層縫合后保溫蘇醒后放回動(dòng)物房。

1.2.3 Von-Frey行為學(xué)測試 測試前，將小鼠放置在金屬絲網(wǎng)為底的塑料籠子內(nèi)適應(yīng)30 min，采用0.008～2.000 g范圍的一套纖維絲(本實(shí)驗(yàn)所用纖維絲分別為0.008、0.020、0.070、0.160、0.400、0.600、1.000、1.400 g)，測試時(shí)Von-Frey纖維絲垂直、微彎，在小鼠足底照射部位停留5 s，若小鼠出現(xiàn)快速抬足或者舔足則為陽性，若無該反應(yīng)則為陰性，相鄰兩次測試之間間隔不少于5 min，共檢測10次，記錄小鼠每次測試的結(jié)果，取60%以上陽性的強(qiáng)度為其疼痛閾值。

1.2.4 免疫熒光染色 將每只小鼠取下的左側(cè)L5 DRG組織在40 mL/L多聚甲醛中于4 ℃固定4 h，后轉(zhuǎn)移至300 g/L蔗糖溶液于4 ℃過夜，使用冰凍切片機(jī)以16 μm的厚度進(jìn)行切片，晾片后將切片分為兩組，分別用兔源MCP-1單抗(1 ∶300)和兔源KCNJ10單抗(1 ∶300)的混合液室溫下孵育過夜，再用Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶400)孵育4 h，用DAPI(1 ∶1 000)孵育5 min后封片。在熒光顯微鏡下觀察，選擇上述標(biāo)記較好的切片，進(jìn)一步在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組小鼠DRG中CCL2和Kir 4.1 mRNA相對于GAPDH和β-actin的表達(dá)水平，引物序列如表1。使用總RNA提取試劑盒提取RNA，先加入100 μL裂解液RZ，用高速研磨儀磨碎后，再加入200 μL裂解液RZ，室溫放置5 min后于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無菌、無RNase的離心管中。加入200 μL氯仿，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取水相加入250 μL無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，于4 ℃、12 000 r/min 離心30 s，棄掉收集管中的廢液，加入500 μL去蛋白液RD，于4 ℃、12 000 r/min離心30 s，棄廢液，加入500 μL漂洗液RW，離心2次后棄廢液，晾干后向提取的RNA中加RNase-Free ddH2O 30 μL 。按試劑盒說明配制gDNA去除反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系后置于42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按試劑盒說明配制反應(yīng)溶液，加入相應(yīng)引物構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，實(shí)時(shí)擴(kuò)增后計(jì)算2-△△Ct值，計(jì)算各組小鼠2-△△Ct值占對照組平均值的百分比。

表1 引物序列

1.2.6 ELISA 取小鼠L4和L5，4個(gè)節(jié)段合并在1個(gè)EP管內(nèi)備用。DRG段勻漿后于4 ℃、3 500 r/min下離心20 min，收集上清液并在-80 ℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒的說明書步驟操作，每組取4個(gè)樣品，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔。制作梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，并將樣品稀釋3倍，按100 μL/孔加入96孔板內(nèi)，37 ℃孵育1 h，棄去液體洗板后按100 μL/孔加入1 ∶100稀釋的鏈霉親和素-HRP并在37 ℃孵育1 h，棄去液體洗板后按100 μL/孔加入顯色液并避光孵育15 min，待標(biāo)準(zhǔn)品呈梯度顯色后，按100 μL/孔加入終止液，測定A450 nm值，計(jì)算原樣本中相應(yīng)蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射所致后肢變化及小鼠機(jī)械痛閾的改變

實(shí)驗(yàn)初期，我們采用了兩種UVB照射劑量(1 500 mJ/cm2和750 mJ/cm2)。圖1A顯示小鼠后肢被放置于照射裝置中，與未照射后肢(圖1B)相比，受照后約1 d小鼠足底出現(xiàn)明顯的皮膚紅斑、腫脹(圖1C)。為明確UVB照射后小鼠機(jī)械痛閾值的改變及恢復(fù)趨勢，我們從受照后24 h開始用Von-Frey纖維絲持續(xù)觀測UVB組小鼠痛閾的變化。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB照射后第1日機(jī)械痛閾值短時(shí)間內(nèi)顯著下降，第2日降至最低(最低閾值0.008 g)，其后基本維持閾值較低狀態(tài)直至1周左右，隨后開始恢復(fù)，第14日恢復(fù)至正常水平(圖1D)。這表明，較強(qiáng)的UVB照射使小鼠產(chǎn)生了痛覺敏化表現(xiàn)。兩組動(dòng)物行為變化趨勢相似，而1 500 mJ/cm2照射組變化更為典型，故后期造模均采用了此照射劑量。

A：小鼠后肢被放置于照射裝置中；B：未照射后肢；C：照射后1 d小鼠足底出現(xiàn)明顯的皮膚紅斑、腫脹；D：照射后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠機(jī)械痛閾值變化規(guī)律，n=7， bP<0.01 vs UVB照射前(1 500 mJ/cm2照射組)， dP<0.01 vs UVB照射前(750 mJ/cm2照射組)，橫坐標(biāo)“0”對應(yīng)的縱坐標(biāo)數(shù)值為每組動(dòng)物UVB照射前的對照值。圖1 UVB照射后動(dòng)物后肢變化及不同時(shí)間點(diǎn)小鼠機(jī)械痛閾值變化規(guī)律

2.2 UVB照射后CCL2的改變

從圖2A～F可以看出，與對照組相比，UVB組照射后第1日CCL2表達(dá)明顯增多，且持續(xù)至第2日，隨后熒光水平下降，在第7日與對照組沒有差別。用PCR檢測造模后不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、7 d)CCL2水平的改變。如圖2G所示，UVB照射后CCL2的mRNA水平在第1日上升至值峰(P<0.01)，第2日顯著下降(P<0.01)，隨后繼續(xù)下降(P=0.002 8)，第4日之后降至最低，與對照組無顯著性差異。另外,我們同步取材進(jìn)行了ELISA檢測。結(jié)果顯示(圖2H)，與對照組相比CCL2蛋白表達(dá)第1、2日均處于高值(P<0.01)。

A～E：分別為對照組、UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、7 d)的CCL2免疫熒光圖，藍(lán)色熒光標(biāo)記的是DAPI，綠色熒光標(biāo)記的是CCL2(標(biāo)尺為200 μm)；F：CCL2相對熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；G：CCL2的PCR檢測統(tǒng)計(jì)圖；H：CCL2的ELISA檢測統(tǒng)計(jì)圖。對照組：n=5，UVB照射后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組：n=7。 aP<0.05， bP<0.01。圖2 UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)CCL2變化的免疫熒光檢測、mRNA及ELISA檢測

2.3 UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)Kir 4.1的變化

Kir 4.1的免疫熒光檢測顯示，與對照組相比，UVB組照射后第1日Kir 4.1表達(dá)明顯增多，第2日持續(xù)增高(P<0.01)，隨后蛋白表達(dá)雖下降，但在第4、7日仍然高于對照組(圖2A～F)。用PCR檢測造模后不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、7 d)Kir 4.1水平的改變，同樣顯示了隨時(shí)間先升高后降低的變化過程(圖3G)，但是UVB照射后Kir 4.1的mRNA水平峰值不僅僅在第1日，還延伸至了第2日(P<0.01)。ELISA的檢測結(jié)果與免疫熒光結(jié)果基本一致(圖2H)。通過比較我們發(fā)現(xiàn)，Kir 4.1的mRNA及蛋白水平表達(dá)的變化在時(shí)間上落后于CCL2的改變，但二者之間是否存在相關(guān)性甚至因果關(guān)系，尚不能確定。

A～E：分別為對照組、UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、7 d)的Kir 4.1免疫熒光圖，藍(lán)色熒光標(biāo)記的是DAPI，綠色熒光標(biāo)記的是Kir 4.1(標(biāo)尺為200 μm，C圖中右上角是左側(cè)虛線小框內(nèi)影像的放大圖，其中標(biāo)尺為20 μm，白色箭頭所指輪廓為衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞)；F：Kir 4.1相對熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；G：Kir 4.1的PCR檢測統(tǒng)計(jì)圖；H：CCL2的ELISA檢測統(tǒng)計(jì)圖。對照組：n=5，UVB照射后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組：n=7。 bP<0.01。圖3 UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)Kir 4.1變化的免疫熒光檢測、mRNA及ELISA檢測

2.4 抑制/激活CCL2對Kir 4.1表達(dá)的影響

我們對UVB造模后2 d的動(dòng)物進(jìn)行了藥物注射的指標(biāo)觀察。在DRG內(nèi)注射Bindarit，可以減少CCL2在DRG水平的表達(dá)，反之，DRG內(nèi)注射CCL2會(huì)增強(qiáng)其作用。為了確保注射的有效性，我們首先檢測了CCL2的變化。免疫熒光結(jié)果顯示，相較于UVB造模2 d的對照組(圖4A)，Bindarit注射使得CCL2表達(dá)降低(圖4B)，而CCL2的注射會(huì)導(dǎo)致其在DRG內(nèi)普遍增多(圖4C)，圖4D為該變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。此外，CCL2的PCR及ELISA檢測分別在mRNA及蛋白水平給予了進(jìn)一步支持(圖4E～F)。

A～F：藥物注射有效性的確認(rèn)(A～C分別對應(yīng)于UVB造模2 d的對照組、Bindarit及CCL2注射組的典型熒光檢測結(jié)果，標(biāo)尺為200 μm；D～F分別對應(yīng)于3組檢測中CCL2的PCR、免疫熒光及ELISA統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。G～L：CCL2對Kir 4.1表達(dá)的正相關(guān)影響(G～I(xiàn)分別對應(yīng)于UVB造模2 d的對照組、Bindarit及CCL2注射組的典型熒光檢測結(jié)果，標(biāo)尺為200 μm；J～L分別對應(yīng)于3組檢測中Kir 4.1的PCR、免疫熒光及ELISA統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。n=7， aP<0.05， bP<0.01。藍(lán)色熒光標(biāo)記的是DAPI，綠色熒光標(biāo)記的是CCL2(A～C)或Kir 4.1(G～I(xiàn))。 圖4 DRG內(nèi)注射Bindarit與CCL2對Kir 4.1的影響

在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了DRG注射對其內(nèi)Kir 4.1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Kir 4.1的變化與CCL2的變化呈正相關(guān)關(guān)系，即相較于對照組(圖4G)，Bindarit注射使得Kir 4.1表達(dá)降低(圖4H)，而CCL2的注射會(huì)導(dǎo)致Kir 4.1在DRG內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)(圖4I)，圖4J為該變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。同樣，Kir 4.1的PCR及ELISA檢測分別在mRNA及蛋白水平給予了相應(yīng)支持(圖4K～L)。

3 討論

紫外線輻射對機(jī)體既可造成皮膚損傷，又存在致痛效應(yīng)，而目前對該損傷后外周炎癥性痛覺敏化的機(jī)制研究并不透徹[12-13]。本研究采用UVB動(dòng)物模型證明，CCL2在UVB照射后發(fā)生了明顯的上調(diào)，這與DAWES等[3]的研究結(jié)果相吻合，因而提示CCL2很可能在紫外線照射后的外周痛敏中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，CCL2的這種變化與在外周損傷導(dǎo)致炎性疼痛中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用是相一致的[14-16]。現(xiàn)有的研究表明，CCL2可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路增加河豚毒素不敏感(TTX-R)鈉通道Nav1.8電流的功能活性來增強(qiáng)感覺神經(jīng)元的興奮性[7，17-18]，也能通過上調(diào)感覺神經(jīng)元TRPV1離子通道的表達(dá)和功能來驅(qū)動(dòng)痛覺過敏狀態(tài)[19]。在我們的研究中，UVB照射后第1日CCL2顯著上調(diào)，此時(shí)，也很可能通過上述作用機(jī)制使神經(jīng)元維持一個(gè)較高的興奮性。

但是，將CCL2升高的時(shí)間過程與動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)相對照，我們可以發(fā)現(xiàn)，痛敏的持續(xù)時(shí)間遠(yuǎn)長于CCL2的上調(diào)時(shí)間，表明UVB痛敏的維持還存在其他因素的參與。與CCL2第1日上調(diào)至最高不同，在弗氏完全佐劑炎癥損傷模型中，PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用較慢，LIANG等[20-22]發(fā)現(xiàn)p-Akt在第3日上調(diào)至高峰。因而UVB照射后第2日，CCL2開始下調(diào)但機(jī)械痛閾值仍持續(xù)下降至最低，其原因很可能與CCL2下游通道效應(yīng)的延遲作用仍會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性升高有關(guān)。

另一方面，本研究證明了UVB照射后SGC中Kir 4.1隨時(shí)間出現(xiàn)的先升高后降低情況也與痛行為的維持有一定關(guān)系。SGC與大腦中的星形膠質(zhì)細(xì)胞有許多相似之處，內(nèi)向整流K+通道(Kir)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和SGC中高度表達(dá)[23-27]。在DRG組織內(nèi)，SGC具有調(diào)控神經(jīng)元胞體周圍離子平衡并進(jìn)一步調(diào)控神經(jīng)元興奮性的作用?，F(xiàn)有的研究表明，內(nèi)向整流鉀通道Kir 4.1的表達(dá)被抑制后，三叉神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元會(huì)過度興奮且對于傷害性感受高度敏感[28-29]；VIT等[11]的研究表明在大鼠眶下神經(jīng)損傷后，三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)SGC的Kir 4.1表達(dá)下調(diào)，MANDGE等[30]的研究表明Kir 4.1與DRG胞體內(nèi)的交叉敏化密切相關(guān)。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)得到了一個(gè)不同的結(jié)果，在UVB照射后的第1日和第2日，Kir 4.1表達(dá)上調(diào)，這很可能因?yàn)樵谠撗装Y損傷模型下，CCL2作為一種較強(qiáng)的趨化因子，招募了大量炎性因子在外周起作用，而激發(fā)的強(qiáng)烈神經(jīng)元的興奮性升高導(dǎo)致局部神經(jīng)元細(xì)胞外空間K+濃度過高，而SGC的Kir 4.1通道作為一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，起到避免神經(jīng)元興奮性過高，抑制去極化的作用。Kir 4.1表達(dá)的升高，可以使更多的K+流入SGC，從而降低神經(jīng)元周圍的K+濃度，促進(jìn)超極化，在一定程度上緩解神經(jīng)元的過度興奮?？梢钥吹?，在目前一次UVB照射引發(fā)痛敏的過程中，后期痛敏的表現(xiàn)隨時(shí)間有一個(gè)自限性過程，可能也與Kir 4.1的這一變化規(guī)律有關(guān)。事實(shí)上，有關(guān)Kir 4.1這一變化繼發(fā)于CCL2的改變也從我們的試驗(yàn)中得到了證明。我們從mRNA和蛋白這兩個(gè)層面上均證明了在DRG注射Bindarit使CCL2表達(dá)降低后，小鼠DRG內(nèi)Kir 4.1的表達(dá)也下降。而CCL2作用增強(qiáng)時(shí)，小鼠DRG內(nèi)Kir 4.1的表達(dá)也顯著上調(diào)，該結(jié)果說明，CCL2在使神經(jīng)元興奮性升高的同時(shí)，也激活了SGC內(nèi)的Kir 4.1通道，從而對神經(jīng)元的興奮性做出調(diào)控，使神經(jīng)元的興奮性適當(dāng)降低。至于兩者之間聯(lián)系的細(xì)節(jié)是如我們上面推測的空間K+濃度的繼發(fā)作用，還是CCL2作用于其受體CCR的下游效應(yīng)，尚不得而知。但從SGC上未有發(fā)現(xiàn)CCR的事實(shí)來看，后者可能性不大。因此，雖然我們目前并不確定具體的調(diào)控通路，但在UVB模型導(dǎo)致的炎癥性痛覺敏化中，這種調(diào)控是存在的，我們也會(huì)在接下來的研究中對作用的細(xì)節(jié)進(jìn)行逐步揭示。此外，上述作用環(huán)節(jié)中，我們也不能排除UVB照射后，尚存在其他內(nèi)向整流鉀通道類型的作用。這種可能性也會(huì)在未來的研究中結(jié)合多種形態(tài)和功能的研究手段進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了在UVB所致炎癥性外周痛覺敏化中，DRG內(nèi)的CCL2發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，Kir 4.1通道的繼發(fā)變化可能起到了抑制神經(jīng)元興奮性過度升高的作用，提示CCL2可以調(diào)節(jié)DRG內(nèi)SGC中Kir 4.1通道的表達(dá)。本研究為UVB照射后痛覺敏化產(chǎn)生的機(jī)制提供了方向，為紫外線照射后疼痛的干預(yù)治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和借鑒。