崔文玉，豐程鳳，夏智慧，羅凱云，程安瑋

(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙，410128)

葡萄作為世界上產(chǎn)量較大的水果作物之一，約有80%用于葡萄酒或者果汁生產(chǎn)，釀酒廠和葡萄汁行業(yè)約年產(chǎn)250萬t葡萄皮渣[1]。葡萄皮渣中含有豐富的酚類、黃酮、單寧等對人體健康有益的成分[2]，作為天然生物活性化合物，在清除體內(nèi)自由基、治療炎癥和調(diào)節(jié)糖代謝等方面發(fā)揮一定的功效[3]。酚類物質(zhì)在植物中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在，游離態(tài)可通過甲醇、乙醇等溶劑直接萃取出來，結(jié)合態(tài)需要通過化學或酶處理方法從細胞壁上分離出來[4]。

熱加工有助于植物原料釋放生物活性物質(zhì)的同時還可促進原料抗氧化能力的提升[5]。蒸汽爆破(steam explosion，SE)作為新興的預(yù)處理技術(shù)，主要是利用高溫高壓的蒸汽作用于原料，并通過瞬間釋壓過程實現(xiàn)原料組分的分離和結(jié)構(gòu)的變化。LIU等[6]以麥麩為原料經(jīng)215 ℃蒸汽爆破處理120 s后，其總酚得率相較于未處理樣品提高了39倍。利用蒸汽爆破處理芡實籽，在0.6 MPa-60 s的條件下其總酚含量提高了5.3倍，而在1.5 MPa-120 s的條件下其總酚含量卻低于未處理組[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)小麥麩皮在2.5 MPa-30 s的條件下進行爆破，游離酚酸中香草酸的含量較未處理的增加了近50%，香豆酸和阿魏酸含量均達到最大，分別為對照組的36倍和11倍[8]。橡木材在160～220 ℃提取5～15 min，總酚含量與蒸汽爆破處理時間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但在240 ℃、15 min的條件下提取的總酚含量降低[9]。LI等[10]的研究也證實蒸汽爆破處理有助于苦蕎麩皮酚類物質(zhì)的溶出及體外細胞抗氧化活性的提高。這些研究表明蒸汽爆破可大幅提升原料中多酚的提取率以及抗氧化活性。

葡萄皮渣作為釀酒加工廢棄物目前利用率較低，但其中含有豐富的多酚、黃酮、原花青素、花色苷等成分，蒸汽爆破處理對其中不同結(jié)合態(tài)的多酚、黃酮、花色苷、原花青素以及相應(yīng)的抗氧化活性產(chǎn)生的影響等，目前未見相關(guān)的報道。因此本試驗選用釀酒后剩余葡萄皮渣為原料，采用不同條件的蒸汽爆破處理，研究其對游離酚(free polyphenols，F(xiàn)P)和游離黃酮(free flavones，F(xiàn)F)、結(jié)合酚(bound polyphenols，BP)、結(jié)合黃酮(bound flavones，BF)、原花青素、花色苷的提取率及提取物的抗氧化活性的影響，并對抗氧化成分含量與其抗氧化活性之間的相關(guān)性進行分析，以期為葡萄皮渣的高值化利用提供參考，并拓展蒸汽爆破技術(shù)在食品預(yù)處理及加工行業(yè)的利用范圍。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗采用從葡萄釀酒廠回收的赤霞珠葡萄皮渣(產(chǎn)地甘肅)。福林酚試劑、沒食子酸(純度≥99%)、蘆丁(純度≥98%)、原花青素(純度≥95%)，上海源葉試劑公司；水溶性維生素E(Trolox)、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基-1,3,5-三嗪[2,4,6-tri(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ]，麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、甲醇、Na2CO3、AlCl3等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

QBS-80爆破試驗臺，鶴壁正道生物能源有限公司；FW177高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；UV—5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；AR423CN電子分析天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；KQ-800DE數(shù)控超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料的蒸汽爆破預(yù)處理

蒸汽爆破設(shè)備由高壓容器、蒸汽發(fā)生器、物料罐、接收器和速開球閥組成。將葡萄皮渣用水浸泡3 h，瀝干水分后裝入密封袋密封8 h，待設(shè)備預(yù)熱后將其投入物料罐中，并通入高溫飽和蒸汽，設(shè)定壓力0.4、0.8、1.2 MPa，維壓時間1、3 min，在距離爆破終點還有3 s時，打開氣動閥門瞬間泄壓完成后，在物料接收器處收集處理后的樣品，并在60 ℃下干燥至恒重，然后粉碎過60目篩。設(shè)定的處理分別表示為SE1(0.4 MPa-1 min)，SE2(0.4 MPa-3 min)，SE3(0.8 MPa-1 min)，SE4(0.8 MPa-3 min)，SE5(1.2 MPa-1 min)，SE6(1.2 MPa-3 min)，以未經(jīng)過蒸汽爆破處理的樣品作為對照(CK)。

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)觀察

為直觀分析蒸汽爆破對葡萄皮渣結(jié)構(gòu)的影響，利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)對原料進行分析，使用導(dǎo)電膠將干燥的葡萄皮渣樣品粉碎固定于樣品臺上，在5.0 kV電壓下，使用離子濺射技術(shù)對樣品表面進行噴金處理并放入電鏡載物腔體內(nèi)抽至真空，然后進行觀察和拍照。

1.3.3 葡萄皮渣中多酚和黃酮的提取

FP和FF的提?。簠⒄战璧萚11]的方法略微改進，利用超聲波輔助提取葡萄皮渣，料液比為1∶20(g∶mL)、乙醇50%(體積分數(shù)，下同)、560 W超聲波處理1 h，然后5 000 r/min離心10 min，取上清液用于FP、FF、花青素測定，將剩余的殘渣用于BP、BF和原花青素的提取。

BP和BF的提?。翰捎脡A水解法[12]。將上一步剩余的殘渣干燥后，加入5 mL NaOH 溶液(含10 mmol/L EDTA和質(zhì)量分數(shù)為1% 維生素C)進行水解，室溫置于搖床上振蕩2 h。然后用6 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值至(2.0±0.2)。在水解液中加入相同體積的V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1的混合液進行萃取，共萃取5次，合并上層萃取液，濃縮至干，然后加入一定量的50%乙醇溶解后用于測定BP和BF含量。

1.3.4 葡萄皮渣中FP和BP含量的測定

采用Folin-phenol法進行測定[13]。取2 mL蒸餾水加入200 μL福林-酚試劑混勻，加入100 μL葡萄皮渣提取液，吹打均勻后加入20%(質(zhì)量分數(shù))Na2CO3溶液900 μL，混勻后在暗處放置2 h，并在765 nm處測定吸光值A(chǔ)。以沒食子酸為標樣，在10～500 mg/L內(nèi)制定標準曲線(y=0.003 1x+0.017 5，R2=0.996 5)，計算提取液中多酚的含量。

1.3.5 葡萄皮渣FF和BF含量的測定

參考WU[14]的方法并稍加改進。分別取1.5 mL葡萄皮渣提取液與1.5 mL的2% AlCl3-甲醇溶液(含5%乙酸)混合均勻，靜置15 min后，于430 nm處測定吸光度值，以蘆丁為標樣在10～500 mg/L內(nèi)制定標準曲線(y=0.004 8x+0.013 8，R2=0.999)，計算提取液中類黃酮的含量。

1.3.6 葡萄皮渣花色苷含量的測定

采用pH示差法進行測定[15]，取0.9 mL提取液，分別加入2.1 mL的pH值1.0的HCl-KCl溶液和pH值4.5的HCl-乙酸鈉溶液混合，然后分別測定混合物在510和700 nm處的吸光度值A(chǔ)，花色苷濃度和吸光度差值分別按公式(1)和公式(2)計算。

花色苷濃度/(mg·mL-1)=ΔA×Mw×DF/ε

(1)

ΔA=(A510 nm-A700 nm)pH1-(A510 nm-A700 nm)pH4.5

(2)

式中：ΔA，吸光度差值；Mw，矢車菊花青素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量，449.2；DF，稀釋倍數(shù)；ε，矢車菊花青素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900。

1.3.7 葡萄皮渣提取物中原花青素的提取與測定

采用正丁醇-鹽酸比色法測定[16]，提取葡萄皮渣游離態(tài)物質(zhì)，剩余殘渣干燥后加入40 mL的V(鹽酸)∶V(丁醇)=5∶95的溶液，在100 ℃水浴1 h，冷卻后5 000 r/min離心15 min，分離沉淀和上清液，在555 nm處測定上清液的吸光度值，以原花青素(95%)為標樣在10～500 mg/L制定標準曲線(y=0.034 3x+0.066 1，R2=0.991 3)，計算原花青素的含量。

1.3.8 葡萄皮渣提取物抗氧化活性的測定

ABTS自由基清除能力的測定：參照文獻[17]的方法略加改進，取0.1 mL不同蒸汽爆破處理的葡萄皮提取液，加入3 mL ABTS反應(yīng)液，混勻后于室溫下靜置反應(yīng)6 min，在波長734 nm下測定樣品的吸光值。以溶于甲醇的Trolox溶液為標樣在20～250 mg/L制定標準曲線(y=0.475 2x-0.813 3，R2=0.999 3)，結(jié)果用水溶性維生素E的抗氧化能力(trolox equivalent andoxidant capacity，TEAC)表示。

鐵離子還原能力 (ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)測定：參照文獻[18]的方法略微改進，取4.9 mL的FRAP試劑與0.1 mL提取液混勻后，37 ℃水浴保溫15 min，于593 nm處測定吸光值。以溶于甲醇的Trolox溶液為標樣在20～250 mg/L制定標準曲線(y=0.003 1x+0.008 2，R2=0.999 4)，結(jié)果用TEAC表示。

DPPH自由基清除能力的測定：參照文獻[19]的方法，提取液0.1 mL加入到1.5 mL DPPH甲醇溶液(200 μmol/L)中。室溫避光反應(yīng)60 min，在517 nm處測定吸光度。以溶于甲醇的Trolox溶液為標樣在20～250 mg/L制定標準曲線(y=0.317 3x-2.052 5，R2=0.997 3)，結(jié)果用TEAC表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，P<0.01表示樣品之間具有極顯著差異，P<0.05表示樣品之間具有顯著性差異；使用Origin 2010進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸汽爆破處理對葡萄皮渣微觀結(jié)構(gòu)特性的影響

不同條件處理葡萄皮渣粉碎后，用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)的變化，圖1分別列出500和1 000放大倍數(shù)的微觀圖。未經(jīng)SE處理的葡萄皮渣SEM圖(圖1-a、圖1-a1)表面結(jié)構(gòu)相對完整且致密，隨著壓力的不斷增大和維壓時間的延長，葡萄皮渣的結(jié)構(gòu)破裂程度愈發(fā)嚴重，其結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，當爆破壓力增至1.2 MPa時，皮渣表面結(jié)構(gòu)變得粗糙且疏松，形成大量的碎片物質(zhì)(圖1-f、圖1-f1、圖1-g及圖1-g1)。

a～g-1 000×;a1～g1-500×圖1 葡萄皮渣掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of grape pomace

2.2 蒸汽爆破對葡萄皮渣中多酚和黃酮含量的影響

如表1所示，蒸汽爆破壓力和時間對原料中多酚和黃酮的提取率有明顯的影響。蒸汽爆破處理后，游離態(tài)提取物的含量明顯增加，而結(jié)合態(tài)提取物的含量明顯下降。隨著汽爆強度的增加，F(xiàn)P和FF總體上呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，在SE5(1.2 MPa-1 min)時FP含量達最大為26.76 mg/g，是未爆破葡萄皮渣含量的2.41倍。而對FF的含量在SE4(0.8 MPa-3 min)、SE5(1.2 MPa-1 min)、SE6(1.2 MPa-3 min)這3個條件下沒有明顯的差異。對BP和BF含量，隨著汽爆強度的增加，提取率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這是由于在高溫高壓下部分結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化成游離態(tài)?？傮w來看，葡萄皮渣中BP的含量遠遠高于FP的含量。在低處理強度下，葡萄皮渣中BF的含量高于FF含量，而隨著汽爆強度的增加，F(xiàn)F的含量又高于BF的含量。將游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的部分相加分別得到總多酚(total content of phenolics，TCP)和總黃酮(total content of flavonoids，TCF)，TCP的提取率明顯高于TCF。TCP的含量隨著汽爆強度增加呈下降趨勢，在SE1(0.4 MPa-1 min)時含量最高；當汽爆強度增加到SE3(0.8 MPa-1 min)后，TCF的含量基本呈穩(wěn)定狀態(tài)。

表1 蒸汽爆破對葡萄皮渣中多酚和黃酮含量的影響 單位：mg/g DW

2.3 蒸汽爆破對葡萄皮渣提取物花色苷和原花青素含量的影響

分別采用pH示差法和正丁醇-鹽酸比色法測定了葡萄皮渣提取物中總花色苷和總原花青素的含量。由圖2可知，總體而言，葡萄皮渣中總花色苷的含量明顯高于總原花毒素的含量。經(jīng)過蒸汽爆破處理后，葡萄皮渣原花青素和總花色苷含量明顯下降，隨著壓力的增強及處理時間的增加兩者含量的下降趨勢更加明顯，未處理組中總花色苷和總原花青素含量最高分別為(84.10±3.45) mg/g、(41.76±1.37) mg/g，是SE6組的26和5倍。

2.4 蒸汽爆破對葡萄皮渣提取物抗氧化活性的影響

通過測定DPPH自由基清除能力、FRAP還原力、ABTS陽離子自由基清除能力來研究蒸汽爆破對葡萄皮渣提取物抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2 蒸汽爆破對葡萄皮渣中花色苷和原花青素的影響Fig.2 Effects of SE on anthocyanins and procyanidins of grape pomace注：不同小寫字母表示組間具有顯著性差異(P<0.05)，下同

a-游離態(tài)提取物ABTS陽離子自由基清除能力；b-游離態(tài)提取物FRAP還原力；c-游離態(tài)提取物DPPH自由基清除能力； d-結(jié)合態(tài)提取物ABTS陽離子自由基清除能力；e-結(jié)合態(tài)提取物FRAP還原力；f-結(jié)合態(tài)提取物DPPH自由基清除能力圖3 蒸汽爆破對葡萄皮渣提取物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of SE to antioxidant activity of extracts from grape pomace

經(jīng)過爆破后葡萄皮渣游離態(tài)提取物的抗氧化能力均高于未爆破組，且不同處理組提取物的抗氧化活性的變化與提取物多酚含量變化趨勢基本一致，隨著爆破壓力和時間的不斷增大，葡萄皮渣游離態(tài)提取物的抗氧化能力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在SE5時其抗氧化能力達到最高，DPPH自由基清除能力、FRAP還原力、ABTS陽離子自由基清除能力分別為(9.54±0.13.14)、(6.59±0.47)、(66.02±0.22) mg/g。蒸汽爆破處理對葡萄皮渣結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性整體呈逐漸降低的趨勢，與蒸汽爆破處理的葡萄皮渣結(jié)合酚含量大體呈現(xiàn)一致的趨勢，且在CK組其抗氧化能力達最高，DPPH自由基清除能力、FRAP還原力、ABTS陽離子自由基清除能力的值分別為(74.06±1.8)、(91.15±5.57)、(138.07±3.20) mg/g。由于結(jié)合態(tài)提取物的含量明顯高于游離態(tài)，所以結(jié)合態(tài)提取物的抗氧活性也明顯高于游離態(tài)提取物的抗氧化活性。

2.5 葡萄皮渣提取物與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

將葡萄皮渣中活性成分的含量與抗氧化活性進行了相關(guān)性分析，結(jié)果見表2?？寡趸钚耘c葡萄皮渣FP、FF、BP及BF含量存在極顯著的相關(guān)性，其中最高的為BP含量與DPPH自由基抗氧化能力之間相關(guān)系數(shù)為0.985，最低的為FF含量與ABTS陽離子自由基抗氧化能力之間相關(guān)性系數(shù)為0.899。這表明提取物的抗氧化活性主要是歸因于提取物中含有的酚類及黃酮等活性成分。

表2 葡萄皮渣提取物與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between extracts from grape pomace and antioxidant activities

3 討論

植物自身組成結(jié)構(gòu)為其內(nèi)部有效成分的提取構(gòu)筑了一道多尺度的天然屏障，包括細胞壁組成的復(fù)雜性、結(jié)構(gòu)不均一性、木質(zhì)化程度以及表皮系統(tǒng)等。這些物理屏障不可避免地限制著提取過程的2個關(guān)鍵步驟：一是溶質(zhì)與溶劑的可及接觸性和溶解過程，二是溶劑夾帶溶質(zhì)通過植物結(jié)構(gòu)的擴散過程。因此，在對有效成分提取前有必要對原料進行預(yù)處理，打破上述提取屏障，達到理想的提取效果。爆破加工是一項近年來迅速發(fā)展起來的預(yù)處理技術(shù)，逐漸應(yīng)用到食品加工行業(yè)。該技術(shù)是利用高溫和高壓共同作用于原料，并通過瞬時釋壓的過程實現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)的變化，通過與其他分離技術(shù)的結(jié)合，可實現(xiàn)物料在組分、細胞和組織水平的分級分離。蒸汽爆破過程中存在類酸性水解、熱降解、類機械斷裂、氫鍵破壞以及結(jié)構(gòu)重排等作用[20]。通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破處理后葡萄皮渣出現(xiàn)明顯破裂，顆粒變小，形成許多孔隙，相對表面積增大等現(xiàn)象，因此增加了原料中有效活性成分與溶劑的可接觸面積，增加溶解過程，同時有效減弱細胞壁的屏障作用，在一定程度上提高了葡萄皮渣中多酚、黃酮等活性物質(zhì)的釋放與提取。MARTNEZ-MEZA等[21]采用可控瞬時壓差技術(shù)處理葡萄皮渣，證明該法也能使原料形成許多孔隙，增大比表面積，提高活性成分的提取率。

多酚類與黃酮類物質(zhì)在葡萄皮渣中含量豐富，由于結(jié)合方式和提取方法不同，主要分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)。本實驗結(jié)果表明葡萄皮渣的酚類化合物主要以結(jié)合態(tài)形式存在，約占總酚類提取物含量的60%以上，這一結(jié)論在玉米、小麥、大米等谷物中也得到了證實[22]。由于多酚和類黃酮的結(jié)合方式不同，蒸汽爆破對游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物多酚與黃酮的釋放量也存在差異，可能引起之間的遷移轉(zhuǎn)化。本實驗的研究結(jié)果表明，蒸汽爆破處理后增強了游離酚和黃酮的提取率，但隨著強度的增加其含量有下降的趨勢。而結(jié)合態(tài)酚和黃酮與游離態(tài)相反，蒸汽爆破降低了其提取率。相似的研究結(jié)果在紅小豆[23]、黑稻米[24]以及茶渣[25]中也被證實。這可能歸結(jié)于蒸汽爆破過程中的高溫、高壓作用于原料造成糖苷鍵、酯鍵、醚鍵等發(fā)生斷裂，以及木質(zhì)素、纖維素類物質(zhì)發(fā)生降解，進而引起細胞內(nèi)結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)促使游離酚含量增加，而過度的蒸汽爆破處理將會導(dǎo)致酚類物質(zhì)受熱分解產(chǎn)生損失[26]。蒸汽爆破是一個自水解過程，可形成小分子的有機酸，促使可溶性結(jié)合物酸性水解轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，也可導(dǎo)致羧基和酚羥基的增加以及β-O-4結(jié)構(gòu)的顯著降低[27]。由于蒸汽爆破過程中物理化學協(xié)同作用，酚類物質(zhì)的形成和降解是共存的過程，需要達到一個平衡狀態(tài)，因此隨著蒸汽爆破程度的增加，趨勢表現(xiàn)為先增加后減少[28]。蒸汽爆破處理葡萄皮渣游離態(tài)提取物DPPH自由基清除能力、FRAP還原能力及ABTS陽離子自由基清除能力得到了明顯提升，而結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性呈下降趨勢，通過相關(guān)性分析表明提取物的抗氧化活性與提取物的含量之間呈顯著相關(guān)。

原花青素是葡萄中的一類重要活性成分，其穩(wěn)定性較差，易受光和溫度的影響。蒸汽爆破處理后葡萄皮渣中原花青素含量明顯降低，QIN等[29]以無花果葉為原料也證明具有相同的影響趨勢。這主要是蒸汽爆破具有的高溫高壓作用導(dǎo)致原花青素的降解和氧化，且SE強度越大，降解越明顯[30]。相似地，花色苷的穩(wěn)定性也較差，因此蒸汽爆破處理后葡萄皮渣花色苷也會進一步降解，降低其含量。姜彥光等[31]研究表明超高壓處理會降低藍莓花色苷的穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

葡萄皮渣中結(jié)合態(tài)的多酚和黃酮含量明顯高于游離態(tài)的含量。隨著蒸汽爆破強度的增加，葡萄皮渣中FP、FF的釋放和提取率呈現(xiàn)出先增加后減低的趨勢，分別在1.2 MPa-1 min、1.2 MPa-3 min條件時，含量達到最大。但蒸汽爆破后BP、BF、原花青素和花色苷的提取率大幅度降低。蒸汽爆破處理后游離態(tài)提取物的抗氧化活性也呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，而結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化能力逐漸降低，由于結(jié)合態(tài)提取物的含量明顯高于游離態(tài)，所以結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性明顯高于游離態(tài)提取物。提取物中酚類和黃酮類物質(zhì)的含量與抗氧化性之間具有顯著相關(guān)性。因此，適度的蒸汽爆破對葡萄皮渣酚類物質(zhì)的釋放及抗氧化活性的提升具有良好的效果，為提升葡萄皮渣的綜合利用提供一定參考。隨著研究的深入，會進一步拓展爆破技術(shù)在食品原料預(yù)處理及加工行業(yè)的利用范圍。