李秀霞，馬瑩瑩，蔡路昀，勵建榮*，謝 晶，沈 琳

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 浙江大學(xué)寧波科創(chuàng)中心 浙江寧波 315100 3 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306 4 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連 116100）

褐藻多酚（Phlorotannin，PTN）是褐藻中多酚化合物的總稱，紅棕色粉末，為間苯三酚衍生物或聚合物，具有抗氧化、抑菌、降血脂等多種生物活性功能[1]。單寧酸（Tannic acid，TA）又稱鞣酸，淡黃色粉末，易溶于水，分子中含有大量酚羥基，可與其它物質(zhì)形成氫鍵及靜電相互作用等，熱穩(wěn)定性增加[2]。山奈酚（Kaempferol，KAE）為黃色結(jié)晶狀粉末，疏水性多酚，溶于熱乙醇，具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗菌等功效。以上3 種多酚均廣泛應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域[3]。然而，由于多酚類化合物攜帶大量活潑的酚羥基，性質(zhì)不穩(wěn)定，對pH 值和光照等環(huán)境因素敏感，易氧化失活[4]，因此，如何提高多酚的穩(wěn)定性是其應(yīng)用上所面臨的難題。

人體消化道的pH 值由低到高逐漸遞增，其中胃液pH 值約為1.2，小腸液pH 值約為6.8，開發(fā)不在胃中分解而在小腸中靶向釋放的多酚包埋材料是多酚保健品研發(fā)的關(guān)鍵。酸度敏感性材料通常具有可解離成離子的基團，隨著環(huán)境pH 值和解離程度發(fā)生變化。篩選合適的離子凝膠，可使陰陽離子聚合物通過電荷作用發(fā)生交聯(lián)，凝膠化形成納米顆粒。利用此種材料在不同pH 值條件下的收縮和膨脹性差異，可實現(xiàn)生物活性成分的腸道靶向釋放。一些高分子聚合物具有這一靶向釋放效果，殼聚糖-三聚磷酸鈉凝膠在模擬胃液（SGF，pH=1.2）和模擬腸液（SIF，pH=6.8）中的體外藥物釋放試驗表明其具有良好的pH 值響應(yīng)性[5]，而海藻酸鈉和殼聚糖等聚離子化合物形成的凝膠也具有相似的pH 值響應(yīng)性釋放效果[6]。氨基酸是生物分子最基本的單元，組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等帶電荷氨基酸有著優(yōu)異的生物學(xué)性質(zhì)和特殊功能，可用于制備pH 值敏感性材料[7]。分子中含有大量氨基或羧基的聚氨基酸，具有超強的離子凝膠形成能力[8-9]。聚賴氨酸和聚谷氨酸形成的聚離子膠束在pH 6.8 時解離更快[10]，是良好的腸道靶向釋放壁材。

為實現(xiàn)多酚在腸道中的靶向釋放，本研究選取ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸通過正、負電荷作用制備pH 值敏感性離子凝膠，通過離子凝膠自組裝作用將多酚封裝到凝膠中，實現(xiàn)復(fù)合凝膠在偏酸性環(huán)境中保持穩(wěn)定，在中性環(huán)境中膨脹釋放包埋物的目的，以提高多酚的生物利用率。本研究內(nèi)容對于多酚生物活性保持及其在食品及保健品開發(fā)中的應(yīng)用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ε-聚賴氨酸（MW<5 000 u）購自上海麥克林生化科技有限公司；聚天冬氨酸（4 000 u

Free Zone2.5 真空冷凍干燥機，美國Labconco 公司；Q2000 差示掃描量熱儀，美國TA 儀器有限公司；90Plus 納米粒度分析儀，美國Brookhaven有限公司；Scimitar2000 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Agilent 公司；Ultima IV X 射線粉末衍射儀，日本Rigaku 公司；S-4000 場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸濃度比對凝膠濁度的影響 分別取5 mg/mL 的ε-聚賴氨酸水溶液5 mL 加入試管中，然后取5 mL 不同質(zhì)量濃度的聚天冬氨酸水溶液（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 mg/mL）緩慢加入到試管中，另取一個試管加入5 mL 聚天冬氨酸水溶液，不加ε-聚賴氨酸水溶液，每個樣本旋渦混合均勻，測定波長550 nm 處的吸光度[11]。

1.2.2 ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸質(zhì)量濃度比對凝膠粒徑與電位的影響 采用基于動態(tài)光散射技術(shù)的Zeta 激光粒度儀對1.2.1 節(jié)中的樣品進行粒徑與電位的測定，參數(shù)設(shè)定為：溫度25 ℃，平衡時間2 min，分散劑為水，每個樣品進行3 次試驗，蒸餾水調(diào)零[12]。

1.2.3 負載多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的制備 準(zhǔn)確稱取一定量的山奈酚、單寧酸、褐藻多酚，將其分別溶于熱乙醇、去離子水和無水乙醇，制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL 的3 種多酚溶液。將3 mL 各溶液以及3 種溶液的混合液（3 種溶液各1 mL）依次加入5 mL 5 mg/mL 的ε-聚賴氨酸水溶液中，磁力攪拌并混合均勻，而后緩慢加入5 mL 1.2.1 節(jié)中優(yōu)化出的最佳質(zhì)量濃度聚天冬氨酸水溶液，使陽離子聚合物與陰離子聚合物發(fā)生靜電相互作用，包封多酚，以不加多酚的溶液為空白對照，得到負載不同多酚的水凝膠溶液，真空冷凍干燥，備用。

1.2.4 包埋率與包載量的測定 取1.2.3 節(jié)中包埋過多酚的凝膠溶液5 mL 置于離心管中，4 500×g離心10 min，取1 mL 上清液于試管中，向試管中加入1.25 mL 的福林酚試劑，待其避光反應(yīng)5 min 之后，再加入3.0 mL 10%碳酸鈉溶液，并在室溫下避光反應(yīng)60 min 后，用紫外分光光度計測其在波長760 nm 處的吸光度值，根據(jù)多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算出游離的多酚含量，以不加多酚的水溶液為對照，每個樣品3 個平行。包埋率（LE）和包載量（LC）的計算公式如下：

式中，m總——多酚的總投入量，g；m游——溶液中游離的多酚量，g；m干燥——冷凍干燥之后微粒的質(zhì)量，g。

1.2.5 粒徑的測定 對1.2.3 節(jié)中的樣品進行粒徑的測定，每個樣品進行3 次平行試驗，用蒸餾水稀釋與調(diào)零。

1.2.6 熱穩(wěn)定性的測定 通過差示掃描量熱儀（DSC）檢測樣品的熱變性溫度與熱焓值，稱取5 mg 干燥后的粉末于坩堝中，壓蓋密封，空坩堝做對照，在氮氣下，以10 ℃/min 的升溫速率，從20℃加熱到250 ℃恒溫1 min，每組3 個平行。

1.2.7 X 射線粉末衍射的測定 利用射線衍射儀研究樣品的晶體結(jié)構(gòu)，將樣品放在樣品槽中壓平，采用Cu-Kα 射線（λ=0.1542 nm）以10°/min 的速度進行連續(xù)掃描。掃描范圍5°到90°，X 射線發(fā)生器的管流30 mA、管壓36 kV，每組3 個平行[13]。

1.2.8 掃描電鏡分析 將凍干的凝膠粉末固定在貼有導(dǎo)電膠的樣品托盤上，并在真空下噴金，在3.0 kV 的電壓下調(diào)整適當(dāng)?shù)谋稊?shù)觀察樣品的微觀形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，均值比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）以及鄧肯氏（Duncan's）法，取95%置信度（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚合物質(zhì)量濃度比對水凝膠濁度的影響

聚合物溶液是澄清透明的，而帶相反電荷的兩種聚合物發(fā)生靜電相互作用可能形成不可溶的物質(zhì)[14-15]。濁度測定可以檢測混合物中不溶性物的存在，ε-聚賴氨酸水溶液澄清透明，隨著聚天冬氨酸質(zhì)量濃度的增加，濁度先增加再降低（圖1），直到聚天冬氨酸的質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，濁度達到最大3.143，濁度達到最大值時，溶液的電位接近于零，聚合物之間的靜電斥力減小而發(fā)生聚集[11]，而濁度越大靜電相互作用越強，物質(zhì)被包埋的越完全，因此，聚天冬氨酸質(zhì)量濃度為4～6 mg/mL 是適宜范圍。

圖1 聚天冬氨酸質(zhì)量濃度對水凝膠溶液濁度的影響Fig.1 Effect of mass concentration of polyaspartic acid on turbidity of hydrogel solution

2.2 聚合物質(zhì)量濃度對粒徑和電位的影響

ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸的質(zhì)量比不同，使得陰、陽離子聚合物上所帶電荷密度比值發(fā)生變化，直接影響聚合物之間的靜電相互作用，溶液的性質(zhì)也會發(fā)生改變。從圖2 可見，聚天冬氨酸的質(zhì)量濃度為4～5 mg/mL 時粒徑較大，此質(zhì)量濃度下陰、陽離子之間存在較強的靜電相互作用，可形成包裹活性物質(zhì)的體系。隨著聚天冬氨酸質(zhì)量濃度的增加，溶液的電荷由正到負，當(dāng)聚天冬氨酸的質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時，溶液的ζ 值為-0.83，溶液電荷接近于零。繼續(xù)增加陰離子的質(zhì)量濃度，電荷逐漸降低到-13.2，這表明陽離子聚合物已經(jīng)完全與陰離子聚合物結(jié)合，增大陰離子的質(zhì)量濃度后溶液中存在大量未結(jié)合的COO-，因此電荷為負[16]。齊寶坤等[17]研究發(fā)現(xiàn)溶液的|ζ|值越大，溶液表面帶電荷越多，分子間排斥力越強，靜電相互作用減弱，有效粒徑降低，與本試驗中的結(jié)果一致。

圖2 聚天冬氨酸質(zhì)量濃度對水凝膠溶液粒徑與電位的影響Fig.2 Effect of mass concentration of polyaspartic acid on particle size and potential of hydrogel solution

2.3 包埋率與包載量的分析

包埋率是指在藥物載體中所包封的藥物總量，包載量是指藥物載體系統(tǒng)單位重量的載藥量。由圖3 可知，山奈酚、褐藻多酚、單寧酸和3種多酚混合物的包埋率均達到80%以上，并且ε-聚賴氨酸-單寧酸-褐藻多酚-山奈酚-聚天冬氨酸組（ε-PL-TA-PTN-KAE-PASP）組的包埋率與另兩組【ε-聚賴氨酸-褐藻多酚-聚天冬氨酸（ε-PL-PTN-PASP）和ε-聚賴氨酸-單寧酸-聚天冬氨酸（ε-PL-TA-PASP）】的包埋率相比顯著降低（P<0.05），與ε-聚賴氨酸-山奈酚-聚天冬氨酸（ε-PL-KAE-PASP）的包埋率相比無顯著性差異（P>0.05），這是因為山奈酚和褐藻多酚具有疏水性，而單寧酸是水溶性多酚，能更大程度的進入到ε-PL-PASP 溶液中，從而使包埋率增加。同時對其包載量的測定結(jié)果也更明顯的表現(xiàn)出了這一特征，ε-PL-KAE-PASP 和ε-PL-PTN-PASP 的包載量顯著降低（P<0.05），單寧酸的加入能夠增加凝膠對山奈酚和褐藻多酚的包埋率與包載量，這可能是由于單寧酸的加入改變了溶液中粒徑的大小，體系變得更加穩(wěn)定，加強了包埋的效果。

圖3 ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠對褐藻多酚、山奈酚、單寧酸的包埋率和包載量的影響Fig.3 Effect of ε-polylysine/polyaspartic acid hydrogels on the encapsulation efficiency and loading capacity of polyphenols，kaepferol and tannic acid

2.4 粒徑與電位分析

在未包封多酚之前的ε-PL-PASP 的粒徑是824.61 nm（圖4），包封山奈酚和褐藻多酚之后，凝膠粒徑分別減小到411.03 nm 和628.43 nm，包封單寧酸之后粒徑增加到2 160.33 nm，包埋3 種混合多酚的溶液粒徑雖有所增加，但無顯著性差異（P>0.05），這可能是因為山奈酚和褐藻多酚與ε-PL-PASP 之間的疏水相互作用使粒徑減小[18]。單寧酸是親水性多酚，加入之后能快速進入到ε-PLPASP 溶液中使粒徑增加，3 種多酚混合之后由于疏水作用大于親水作用粒徑略微增加。由此可知，單寧酸的加入增進了凝膠對疏水多酚的包埋效果。

圖4 負載不同多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠溶液的粒徑分布圖Fig.4 Particle size distribution of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyaspartic acid hydrogel solution

2.5 熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱法是一種熱分析方法，通過溫度范圍的掃描可以測定各組分之間的熱穩(wěn)定性，熱變性溫度越高說明穩(wěn)定性越強，破壞其結(jié)構(gòu)所需的能量越大，△H值就越大[19]。由圖5 可知，各樣品組之間均有2 個放熱峰，且第1 個峰比第2個峰更為明顯，從表1 中可以看出，以未包封多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸（ε-PL-PASP）作為空白組，它的第1 個峰的熱變性溫度（Tm）為137.16℃，焓值（△H）為63.67 J/g，與空白組相比，包封單寧酸之后Tm增加，△H顯著增加（P<0.05），包埋褐藻多酚和山奈酚之后水凝膠的Tm降低，△H無顯著性差異（P>0.05），負載3 種混合多酚之后Tm降低，△H增加，峰形無明顯的差異，這說明3 種多酚都被包封，并且以非晶態(tài)存在[20]。負載單寧酸之后溶液體系的穩(wěn)定性更強，而山奈酚和褐藻多酚存在疏水基團，減弱了ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸之間的相互作用，導(dǎo)致溶液體系的穩(wěn)定性變差。第2 個熱變性溫度在205～215 ℃之間，負載多酚之后Tm升高，△H增加，這說明破壞其結(jié)構(gòu)所需要的能量更大。結(jié)果表明，ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸溶液體系能夠達到包封不同多酚的作用，且更利于水溶性多酚的包封，3 種多酚混合之后親水性多酚可以促進疏水性多酚的包埋[21]。

圖5 負載不同多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠溶液的DSC 圖Fig.5 DSC of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid hydrogel solution

表1 負載不同多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的熱變性溫度和焓值Table 1 Thermal denaturation temperature and enthalpy of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine- polyaspartic acid hydrogel

2.6 X 射線粉末衍射分析

X 射線粉末衍射是研究先進材料的結(jié)晶性質(zhì)和成分的最常用的方法，原材料ε-聚賴氨酸（ε-PL）、聚天冬氨酸（PASP）、單寧酸（TA）、山奈酚（KAE）、褐藻多酚（PTN）以及ε-PL-PASP、ε-PLTA-PASP、ε-PL-PTN-PASP、ε-PL-KAE-PASP、ε-PL-TA-PTN-KAE-PASP 5 種水凝膠的XRD表征如圖6所示，特征峰的尖銳度代表復(fù)合材料的結(jié)晶程度[22]。從圖6 中可以看出，ε-聚賴氨酸的2θ=23.5°，聚天冬氨酸的2θ=20.3°，這是ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸特有的晶體結(jié)構(gòu)，當(dāng)ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸通過靜電相互作用結(jié)合之后，原有的特征峰發(fā)生左移2θ=19.7°，并且在28.1°，31.2°，40.8°，55.7°，67.9°，72.8°和82.4°出現(xiàn)新的特征峰，根據(jù)布拉格方程d（?）=λ/2sinθ（λ=1.54?）得出對應(yīng)間距d值為1.63，1.49，1.18，0.93，0.83，0.81，0.78 ?，這可能與ε-聚賴氨酸和聚天冬氨酸中CH 鍵和C=O 鍵的伸縮振動有關(guān)，也可能是NH+和COO-之間的靜電相互作用所引起的[23]。負載不同多酚之后所有的特征峰均存在，19.7°的峰變得平緩，新的特征峰的峰值減小，這可能是由于ε-聚賴氨酸中的-NH2和多酚中-OH 之間氫鍵的形成有關(guān)，從而導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)被破壞。結(jié)果表明，不同的多酚以非晶態(tài)結(jié)構(gòu)成功包裹在ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠中。

圖6 負載不同多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的XRD 圖Fig.6 XRD of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid hydrogel

2.7 微觀形貌分析

負載不同多酚的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的表面形貌如圖7所示，從圖7 中可以看出，由于ε-聚賴氨酸與聚天冬氨酸之間的靜電相互作用，水凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)類似球狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能改善體系的穩(wěn)定性，增強水凝膠的溶脹，達到包封不同生物活性成分的效果，更有利于藥物的遞送[24]。包封不同多酚之后微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生很大的差異，負載單寧酸和3 種混合多酚的水凝膠呈現(xiàn)出大小均勻的球型結(jié)構(gòu)，在水凝膠中分布松散的現(xiàn)象，這更好地說明了溶液體系的基質(zhì)已經(jīng)完全被生物活性分子所占據(jù)，單寧酸已經(jīng)被包裹在溶液體系中。負載山奈酚和褐藻多酚之后球形結(jié)構(gòu)出現(xiàn)黏連現(xiàn)象，并呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，表面平滑度降低，這可能是因為山奈酚和褐藻多酚屬于疏水性物質(zhì)與ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸之間的親水基團發(fā)生靜電斥力，導(dǎo)致一部分多酚滯留在溶液外而未被包裹，結(jié)果表明，ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠對3 種多酚的包埋效果是單寧酸>3 種多酚混合物>褐藻多酚>山奈酚。

圖7 負載不同多酚的的ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope（SEM）of encapsulation of different polyphenols in ε-polylysine-polyphenol-polyaspartic acid solution

3 結(jié)論

通過陽離子ε-聚賴氨酸和陰離子聚天冬氨酸之間的靜電相互作用自組裝成ε-PL-PASP 水凝膠，并應(yīng)用于親水性多酚單寧酸和疏水性多酚山奈酚、褐藻多酚及3 種多酚混合物的包封，并對包封多酚后凝膠的理化性能進行了分析。結(jié)果表明，在5 mg/mL ε-聚賴氨酸溶液中加入等量4 mg/mL 聚天冬氨酸溶液時，ε-聚賴氨酸/聚天冬氨酸水凝膠的穩(wěn)定性最好；此聚合物體系更適合于親水性多酚的包封，并且單寧酸的加入可以促進對疏水多酚的包埋；包埋單寧酸之后體系較穩(wěn)定，而包埋山奈酚和褐藻多酚后體系穩(wěn)定性差，熱變性溫度和焓值降低；多酚以無定形的非晶態(tài)結(jié)構(gòu)包被于復(fù)合水凝膠中，包埋效果順序為：單寧酸>3種多酚混合物>褐藻多酚>山奈酚。