平板計(jì)數(shù)法與紙片法檢測(cè)食品微生物菌落總數(shù)的比較分析

◎劉 珂，余 希

（南昌市西湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330009）

菌落總數(shù)是指食品在一定條件下經(jīng)過(guò)處理后，所得1 g 或1 mL 檢樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，其目的在于了解食品從原料加工到成品包裝受外界污染的情況。在此過(guò)程中，無(wú)論采取何種方式加工食品，都不可避免地發(fā)生微生物污染食品的情況，但只要食品中的微生物含量在合理范圍內(nèi)就不會(huì)給人體健康帶來(lái)威脅。通過(guò)采用合理的計(jì)數(shù)方法確定食品微生物菌落總數(shù)，不僅可以提升食品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以提高食品安全管理水平，對(duì)推動(dòng)食品行業(yè)發(fā)展有著積極的意義。

平板計(jì)數(shù)法是指利用瓊脂、明膠等凝膠型固體培養(yǎng)基制成一個(gè)平面，并在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，若干天后，對(duì)已形成菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌落總數(shù)的方法。該方法在具體應(yīng)用過(guò)程中的流程如下：首先，將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞；然后，取一定量的稀釋樣液涂布到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞；最后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。該方法在使用過(guò)程中，具有培養(yǎng)結(jié)果易于辨認(rèn)、計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性較高等優(yōu)勢(shì)，但也存在不足，如檢測(cè)周期較長(zhǎng)、受環(huán)境影響較大等。紙片檢測(cè)方法是利用快檢紙片代替培養(yǎng)基，利用菌落顯色藥劑指示菌落總數(shù)，從而得到相應(yīng)的計(jì)數(shù)結(jié)果。其具體操作流程如下：在進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)前，需要確保樣品以外所有需要和紙片進(jìn)行接觸的物品，如移液管、燒杯等，都在前期進(jìn)行無(wú)菌化處理。同時(shí)，計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)人員需要佩戴口罩、頭套、手套（均經(jīng)過(guò)無(wú)菌化處理），方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)人員將紙片從盒中抽出后，利用生理鹽水進(jìn)行浸泡，這樣可以確保紙片和樣品充分接觸，整個(gè)過(guò)程維持30 s，隨后將紙片從樣品中取出，并將其放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h 后根據(jù)菌落顯示進(jìn)行計(jì)數(shù)。該方法在使用過(guò)程中，由于具有采樣過(guò)程污染小、攜帶便捷性強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、結(jié)果方便統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)受到研究者的青睞。另一方面，該技術(shù)在應(yīng)用中也有一些不足之處，如細(xì)菌數(shù)量較大時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果不可用，并且檢測(cè)內(nèi)容比較固定，一次只能檢測(cè)一類菌種，具有一定的局限性[1]。

1 菌落總數(shù)相關(guān)內(nèi)容論述

除上述提到的基本概念外，菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)基礎(chǔ)是每一個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)基中可以逐漸形成一個(gè)能夠肉眼觀察到的單獨(dú)菌落。另外，培養(yǎng)菌體需要在有氧環(huán)境下進(jìn)行，部分細(xì)菌（如厭氧的乳酸菌、硝化細(xì)菌等）在此環(huán)境下無(wú)法生存，而且一些特殊細(xì)菌（如硫化細(xì)菌等）在生長(zhǎng)過(guò)程中需要某些特殊營(yíng)養(yǎng)物。因此，所統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)并不代表樣品中實(shí)際存活的細(xì)菌總數(shù)。需要明確的是，在培養(yǎng)基中所得到的細(xì)菌數(shù)量主要以喜愛中溫、有氧型、兼性厭氧的細(xì)菌種類為主，而其他類型的菌種，還需要采取其他的處理方式進(jìn)行檢測(cè)，從而得到準(zhǔn)確的檢測(cè)數(shù)據(jù)，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)食品微生物檢測(cè)工作中有關(guān)菌落技術(shù)檢測(cè)的要求，主要遵循《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。該規(guī)則主要以平板計(jì)數(shù)法作為主要檢測(cè)方法，該方法具有培養(yǎng)結(jié)果易于辨認(rèn)、計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性較高等優(yōu)勢(shì)。但也有一些檢測(cè)機(jī)構(gòu)將紙片法作為主要檢測(cè)方法，其參考了《食品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)再水化干膜法》中的相關(guān)內(nèi)容。紙片法目前主要是在加拿大、美國(guó)等地區(qū)進(jìn)行推廣，國(guó)內(nèi)對(duì)于紙片法的應(yīng)用尚處于討論階段，目前仍是以平板計(jì)數(shù)法作為主要的檢測(cè)手段。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

①平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，校核是否變質(zhì)，按要求對(duì)其進(jìn)行存儲(chǔ)。②3M Petrifilm 菌落總數(shù)測(cè)試片，校核是否變質(zhì)，按要求對(duì)其進(jìn)行存儲(chǔ)。③質(zhì)控樣品2 份，作為參考組使用。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣液制備

為了對(duì)比平板計(jì)數(shù)法和紙片檢測(cè)方法的優(yōu)劣，需要進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。①質(zhì)控樣品。在無(wú)菌環(huán)境下打開裝有凍干樣品的西林瓶，在30 s 內(nèi)用滴定管（5 mL）吸取4 mL 無(wú)菌生理鹽水加入西林瓶中，使凍干樣品中的粉末充分溶解，隨后將混合溶液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌錐形瓶中，再用剩余的生理鹽水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，經(jīng)多次沖洗后得到的混合液體也轉(zhuǎn)移到無(wú)菌錐形瓶中，共得到50 mL 混合液體，即待測(cè)樣品原液。②食品樣品樣液。與質(zhì)控樣品制作過(guò)程相類似，在無(wú)菌操作臺(tái)上，對(duì)食品進(jìn)行切塊、粉碎、稀釋等處理，從而得到食品樣品樣液。③稀釋溶液。將上述2 種樣品樣液取出1 mL 添加到9 mL 無(wú)菌生理鹽水試管中，用滴管攪拌均勻后制備成10 倍稀釋度樣液，隨后再?gòu)闹谐槿? mL 樣液將其轉(zhuǎn)移到9 mL 無(wú)菌生理鹽水試管中，攪拌均勻后制備成100 倍稀釋度樣液，待測(cè)[2]。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 平板計(jì)數(shù)法

在無(wú)菌條件下，用滅菌后的吸管（容量為1 mL）從上述制備的稀釋液中吸取1 mL，放入2 個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，隨后利用滅菌吸管（容量為1 mL）吸取1 袋生理鹽水，注入平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，提前將溫度調(diào)整到46 ℃，培養(yǎng)基容積為5～20 mL，按要求進(jìn)行搖勻操作，等待其冷卻凝固后，將其放置在（36±1）℃環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間控制在（48±2）h。

2.3.2 紙片法

在無(wú)菌條件下，用滅菌吸管（容量為1 mL）從上述制備的稀釋液中吸取1 mL，放入2 個(gè)測(cè)試紙片，完成此操作后，覆蓋好紙片，將其放置在（36±1）℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間控制在（48±2）h。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法和計(jì)算方法

利用平板計(jì)數(shù)法和紙片法對(duì)培養(yǎng)后的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，所得到的數(shù)據(jù)可利用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，若P ＜0.05，說(shuō)明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用“Z-比分?jǐn)?shù)”進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)得到的計(jì)算數(shù)值可以進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。①如果|Z|≤2，那么此次測(cè)試結(jié)果為“滿意”。②如果2 ＜|Z|＜3，那么此次結(jié)果中存在問(wèn)題，需要采取措施進(jìn)行處理。③如果|Z|≥3，那么此次測(cè)試結(jié)果為“不滿意”[3]。

3 結(jié)果與分析

3.1 食品檢測(cè)結(jié)果比較

在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了40 組樣品（平板計(jì)數(shù)法與紙片法各20 組）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨后利用平板計(jì)數(shù)法與紙片法進(jìn)行計(jì)數(shù)處理，對(duì)得到的檢測(cè)結(jié)果利用T檢驗(yàn)展開分析，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。由表1 知：①平板計(jì)數(shù)法所得到的計(jì)算結(jié)果為235.6 CFU·g-1，t值為-0.345，同時(shí)P＞0.05，表明采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落總數(shù)結(jié)果不顯著。②紙片法得到的計(jì)算結(jié)果為278.9 CFU·g-1，t值為-0.366，同時(shí)P＞0.05，與平板計(jì)數(shù)法相比，二者在顯著性方面并沒(méi)有明顯區(qū)別。由標(biāo)準(zhǔn)樣液的參考值253.3 CFU·g-1來(lái)看，平板計(jì)數(shù)法更具備應(yīng)用價(jià)值[4]。

表1 食品檢測(cè)結(jié)果表

3.2 菌落數(shù)區(qū)間結(jié)果比較

參考2.1 內(nèi)容對(duì)菌落區(qū)間進(jìn)行等級(jí)劃分，分別為0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和＞1 000 CFU·g-1，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析結(jié)果見表2。由表2 可知：①平板計(jì)數(shù)法所得到0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和＞1 000 CFU·g-1的菌落區(qū)間對(duì)應(yīng)t值分別是-0.345、-0.376、-0.843，同時(shí)P＞0.05，表明平板計(jì)數(shù)法在使用過(guò)程中，其檢測(cè)菌落區(qū)間差異不顯著。②紙片法所得到的不同菌落區(qū)間t值分別是-1.753、-1.766、-1.466，同時(shí)P＞0.05，表明紙片法在使用過(guò)程中，其檢測(cè)菌落區(qū)間差異不顯著。標(biāo)準(zhǔn)樣液0～100 CFU·g-1、100～1 000 CFU·g-1和 ＞1 000 CFU·g-1的菌落區(qū)間對(duì)應(yīng)t值為-0.435、-0.436、-0.703。將平板計(jì)數(shù)法與紙片法不同菌落區(qū)間的t值和標(biāo)準(zhǔn)樣液的t值對(duì)比之后可以發(fā)現(xiàn)，在該實(shí)驗(yàn)中平板計(jì)數(shù)法更具備應(yīng)用價(jià)值[5]。

表2 菌落數(shù)區(qū)間結(jié)果表

3.3 質(zhì)控樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)，隨后利用平板計(jì)數(shù)法與紙片法進(jìn)行計(jì)數(shù)處理，得到的檢測(cè)結(jié)果利用T檢驗(yàn)展開分析，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果見表3。由表3 可知：①平板計(jì)數(shù)法的平均菌落數(shù)為16 000 CFU·g-1，t值為-0.325，同時(shí)P＞0.05，Z值為1.2，表明平板計(jì)數(shù)法在使用過(guò)程中，其檢測(cè)菌落總數(shù)結(jié)果之間的差異不顯著。②紙片法的平均菌落數(shù)為為20 000 CFU·g-1，t值為-0.336，同時(shí)P＞0.05，Z值為1.5，表明紙片法在使用過(guò)程中，其檢測(cè)菌落總數(shù)結(jié)果之間的差異不顯著。此外，根據(jù)Z值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在質(zhì)控樣品的實(shí)驗(yàn)中，2 種方法都可以滿足相應(yīng)的檢測(cè)要求，其均適用于該樣品檢測(cè)。

表3 質(zhì)控樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果表

4 討論

在此次研究中，通過(guò)組建實(shí)驗(yàn)的方式討論平板計(jì)數(shù)法與紙片法在食品菌落總數(shù)校核中的應(yīng)用情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 種方法在應(yīng)用中并不存在顯著性差異，均具有應(yīng)用價(jià)值。在平板計(jì)數(shù)法的應(yīng)用過(guò)程中，一個(gè)稀釋梯度需要使用2 個(gè)平板，而檢測(cè)某一個(gè)樣品的菌落總數(shù)，則需要使用多個(gè)梯度，也會(huì)使用數(shù)量更多的平板，整體所占體積較大。許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)的場(chǎng)地相對(duì)有限，無(wú)法購(gòu)買更多數(shù)量的培養(yǎng)箱用于制備培養(yǎng)基，另一方面，由于其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，主要應(yīng)用于一些高精度檢測(cè)要求的食品檢測(cè)。

與平板計(jì)數(shù)法相比，紙片法操作過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了人力成本的支出。在檢測(cè)中使用的主要載體為相同厚度的薄紙片，根據(jù)需要分析的梯度配置相應(yīng)數(shù)量的薄紙片，所占空間較小，適用于目前許多檢測(cè)場(chǎng)地較小、送檢樣品較多的機(jī)構(gòu)。但是其準(zhǔn)確性方面不如平板計(jì)數(shù)法，適合用于一些快速檢測(cè)活動(dòng)。

5 結(jié)論

平板計(jì)數(shù)法與紙片法均能夠?qū)淇倲?shù)進(jìn)行測(cè)定。平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)準(zhǔn)確性更高，該方法的應(yīng)用前提條件是需要做好樣品的稀釋工作，同時(shí)做好無(wú)菌化處理，以滿足相應(yīng)的管理需求。紙片法的檢測(cè)速度快，適用于許多檢測(cè)場(chǎng)地較小、送檢樣品較多的機(jī)構(gòu)。具體選擇哪一類檢測(cè)方法，需根據(jù)精度要求等實(shí)際情況進(jìn)行選擇，以提高實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。