王 玨，許 凱，楊 洋，楊 銳，孫會敏，肖新月

（中國食品藥品檢定研究院·國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 100050）

聚山梨酯系列為常用非離子表面活性劑輔料，俗稱吐溫。2020年版《中國藥典（四部）》、美國藥典、歐洲藥典均收載聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60及聚山梨酯80，其中聚山梨酯20和聚山梨酯80應(yīng)用較廣，尤其用于高風(fēng)險制劑［1-2］。超臨界流體色譜（SFC）法是依靠超臨界流體為流動相實現(xiàn)復(fù)雜物質(zhì)分離的色譜技術(shù)［3］，分離效能高且綠色環(huán)保，常用超臨界狀態(tài)下的CO2作為流動相，輔以少量有機溶劑。近年來在中藥藥物分析領(lǐng)域和食品的油脂分析中應(yīng)用較多［4-8］，其兼具氣相色譜和液相色譜的特點，但尚不如氣相和液相色譜法應(yīng)用普遍。為此，本研究中建立了聚山梨酯80的超高效合相色譜（UPCC）指紋圖譜，并對不同來源的12批聚山梨酯80進行相似度評價，為優(yōu)化聚山梨酯產(chǎn)品批間一致性和穩(wěn)定性監(jiān)測方法提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：ACQUITY UPCC串聯(lián)Xevo G2-XS Q-TOFMS 系統(tǒng)，含MassLynx V4.1 質(zhì)譜工作站、Waters UNIFI 1.9.3分析軟件（美國Waters公司）；XS205DV 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）。

試藥：聚山梨酯20、聚山梨酯60均購自南京威爾藥業(yè)有限公司；聚山梨酯80 分別購自英國禾大化學(xué)品公司（批號分別為49087，50021）、南京威爾藥業(yè)有限公司（批號為20210602）、江蘇保易制藥有限公司（批號分別為C05181201，C05200902）、J.T.Baker 化學(xué)品公司（批號分別為0000275460，0000281769）、日油株式會社（批號分別為202859，107359D）、湖北葛店人福藥用輔料有限公司（批號分別為F104C210401，F(xiàn)119C220201）、江西益普生藥業(yè)有限公司（批號為20220301）；聚山梨酯20 美國藥典（USP）標準物質(zhì)（批號為R079C0）、聚山梨酯60USP標準物質(zhì)（批號為R09110）和聚山梨酯80 USP標準物質(zhì)（批號為R072G0）作為對照品；甲醇、乙腈、甲酸銨均為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 UPCC 條件

色譜柱：ACQUITY UPC2Torus Diol 柱（100 mm ×3.0 mm，1.7 μm）；流動相：CO2（A）- 甲醇/ 乙腈（B，30∶70，V/V），離子化溶劑為甲醇+5 mmol/L 甲酸銨（流速為0.2 mL/min），梯度洗脫（0～0.2 min 時8%B，0.2～12.0 min 時8%B →15%B，12.0～18.0 min 時15%B →20%B，18.0～31.0 min 時20%B →35%B，31.0～34.0 min 時35%B →50%B，34.0～34.2 min 時50%B→8%B，34.2～37.0 min時8%B）；流速：1.0 mL/min；柱溫：50 ℃；背壓：2 500 psi；進樣量：1μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；霧化氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：800 L/ h；源溫度：120 ℃；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：40 V；采集模式：MSE；掃描范圍：m/z50～3 000。

2.2 溶液制備

取樣品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的供試品溶液。取聚山梨酯標準物質(zhì)適量，同法制備對照品溶液。

2.3 精密度試驗

取聚山梨酯80 對照品溶液，按2.1 項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄色譜圖，結(jié)合保留時間選取連續(xù)穩(wěn)定出峰且相對峰面積大于5%的色譜峰作為主要色譜峰。結(jié)果保留時間的RSD均小于0.3%，相對峰面積的RSD大多小于10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4 UPCC 指紋圖譜建立與分析

先分別對聚山梨酯20、聚山梨酯60 和聚山梨酯80樣品及各自對照品進行紅外光譜測試，各樣品均獲得與對照品基本一致的紅外光譜圖。取2.2 項下溶液各適量，并按2.1 項下試驗條件進樣測定，計算基峰色譜圖（圖1）各峰積分，將所獲得的基峰色譜圖及積分數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版），以各對照品圖譜作為校正參照，使用中位數(shù)進行峰自動匹配并進行多點校正，得到聚山梨酯80的UPCC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，詳見圖2、圖3。

圖1 聚山梨酯（20，60，80）基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatograms of polysorbates（20，60，80）

圖2 12批聚山梨酯80樣品的超高效合相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 UPCC superimposed fingerprints of 12 batches of polysorbate 80

圖3 聚山梨酯80樣品超高效合相色譜對照指紋圖譜Fig.3 UPCC reference fingerprint of polysorbate 80

取12 批聚山梨酯80 樣品及其USP 標準物質(zhì)，用建立的超高效合相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPCC - MS）法進樣分析，確定了22 個共有峰（同圖2）。采用夾角余弦法對不同來源的12批樣品進行指紋圖譜相似度評價，結(jié)果見表1，相似度為0.884～0.966，產(chǎn)品間組成分布上的相似程度基本可區(qū)分。同時，聚山梨酯20、聚山梨酯60與聚山梨酯80 的相似度分別為0.408 和0.450，說明該方法建立的UPCC - MS 指紋圖譜可對不同品種的聚山梨酯進行區(qū)分。

表1 12批聚山梨酯80樣品相似度分析Tab.1 Similarity analysis of 12 batches of polysorbate 80

2.5 聚山梨酯80 的22 個共有峰結(jié)構(gòu)確認

采用UPCC-MS的MSE模式分析，由于使用極性柱的超臨界流體色譜分離機理類似于正相色譜，因此理論上酯化程度越高的成分越先流出。結(jié)合各色譜峰的保留時間識別聚山梨酯80的22個共有峰，詳見表2［其中n表示分子中聚氧乙烯（-OC2H4）的重復(fù)單元數(shù)］。

表2 聚山梨酯80的22個共有峰結(jié)構(gòu)解析Tab.2 Structural analysis of 22 common peaks of polysorbate 80

3 討論

3.1 研究背景

聚山梨酯輔料組成極復(fù)雜，這種復(fù)雜性源于原料和合成過程中的多樣性和多種不確定性，包括可同時存在2種母核類型（即山梨醇酐和異山梨醇酐），側(cè)鏈的多分散性（即不同數(shù)目的聚氧乙烯重復(fù)單元），脂肪酸的類型（來源于原料不同的脂肪酸構(gòu)成），酯化程度的不確定性（即未酯化、單酯、二酯、三酯）［9-10］。通過聚山梨酯的理論結(jié)構(gòu)式、實際化合物分類及其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式，推斷其種類可得聚氧乙烯山梨坦及其脂肪酸酯類、聚氧乙烯異山梨坦及其脂肪酸酯類、聚乙二醇及其脂肪酸酯類三大類物質(zhì)，共包含理論化合物約1.7萬個［11］。

指紋圖譜在復(fù)雜藥用輔料中鑒定分析的應(yīng)用少有報道［12-14］。事實上，藥用輔料中有很多組成復(fù)雜的混合物體系如吐溫、司盤類表面活性劑、三酰甘油及天然來源的油脂等均面臨質(zhì)量控制難題。采用傳統(tǒng)的分析檢測手段常難以發(fā)現(xiàn)其化合物組成上的差異或操作步驟煩瑣，檢驗檢測效能低。因此，近年來基于液相/高分辨質(zhì)譜聯(lián)用手段對此類輔料定性或定量方面的研究很多［15-18］。一般來說，建立定制數(shù)據(jù)庫是對此類藥用輔料進行組成分析和鑒定的常用策略［19-20］。但此方法事倍

功半，對于某些質(zhì)控場景（如對產(chǎn)品批間穩(wěn)定性監(jiān)測等）來說并非最佳選擇。此外，高效液相色譜（HPLC）法雖能將多組分進行有效分離，但難免會由于液相色譜本身的局限性而不得不增加洗脫時間，消耗大量有機溶劑，并不符合“綠色檢驗”高質(zhì)量發(fā)展的檢驗檢測趨勢。

3.2 超臨界流體合相色譜法分析聚山梨酯系列輔料

本研究中采用UPCC 法建立的分析方法對聚山梨酯20、聚山梨酯60 和聚山梨酯80 進行組分分離，可在37 min 內(nèi)成功檢測到各自50～70 個色譜峰，單針進樣使用的有機溶劑不足10 mL。與傳統(tǒng)的HPLC 法相比分析效能大幅提升。然而，聚山梨酯各組分在色譜系統(tǒng)中的保留時間特征性不強，各色譜峰交叉重疊現(xiàn)象顯著，僅從質(zhì)譜得到的相對分子量信息指認單個色譜峰的物質(zhì)結(jié)構(gòu)存在多種可能的化合物。如聚山梨酯20的UPCC色譜圖中，保留時間在11.1～14.7 min 之間的峰可同時與聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯異山梨醇、聚氧乙烯單月桂酸酯、聚乙二醇相匹配，增加了判斷難度。

3.3 聚山梨酯UPCC 指紋圖譜分析

UPCC 法與MS 法聯(lián)用后建立的聚山梨酯80 UPCC指紋圖譜，實現(xiàn)了不同來源聚山梨酯80 產(chǎn)品總體成分分布的相似度評價，能與聚山梨酯20 和聚山梨酯60 有效區(qū)分。聚山梨酯輔料各品種間的主要區(qū)別在于原料脂肪酸的不同，聚山梨酯20的原料以月桂酸為主，含部分肉豆蔻酸和棕櫚酸；聚山梨酯60 的原料以硬脂酸和棕櫚酸為主；聚山梨酯80的原料則以油酸為主，肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸等其他多種脂肪酸為輔［21］。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，相對簡單的原料脂肪酸組成則與對照品一致性較好，而聚山梨酯80原料中過多的脂肪酸類型加劇了產(chǎn)品組成復(fù)雜化，更易造成產(chǎn)品質(zhì)量的差異。

3.4 聚山梨酯組成分析的質(zhì)控挑戰(zhàn)

聚山梨酯系列輔料屬油脂衍生物，組成的復(fù)雜性是造成其質(zhì)控難題的重要因素，對組分的定性鑒別和定量技術(shù)方面仍存在挑戰(zhàn)。在確認聚山梨酯組分結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)現(xiàn)，雖然其中大量組分化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，但離子化效應(yīng)差異較大，有些成分雖有可能含量占比較大，但在質(zhì)譜檢測中的信號響應(yīng)強度不足。此外，由于存在大量的同分異構(gòu)體，對聚山梨酯中全部組分進行結(jié)構(gòu)確認的難度較大，后續(xù)研究將采用多維色譜并結(jié)合定制數(shù)據(jù)庫進一步深入研究，以完成對其組分全面精準的了解。同時，將收集更多樣本量的聚山梨酯20 和聚山梨酯60，完成UPCC指紋圖譜的建立，將2種對聚山梨酯組成分析的質(zhì)控策略相結(jié)合，以應(yīng)對不同的應(yīng)用場景。

綜上所述，本研究中建立的聚山梨酯80 UPCC 指紋圖譜分析方法，精密度良好，樣品制備簡單，分析速度快，可作為產(chǎn)品穩(wěn)定性監(jiān)測或質(zhì)量一致性評價的方法，可為深入研究聚山梨酯輔料質(zhì)量標準和譜效關(guān)系提供理論依據(jù)，同時也可為“綠色檢驗”標準體系的推廣提供可借鑒的技術(shù)方法和數(shù)據(jù)參考。