韓 雪， 王 蕾， 孫 旭， 寧家輝， 衣紅杰， 趙 婧

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)， 山東 濟(jì)南 250014 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 山東 濟(jì)南 250001)

阿爾茨海默病(AD)早在臨床癥狀出現(xiàn)前就已發(fā)生神經(jīng)病理改變，最終發(fā)展為嚴(yán)重的癡呆。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植治療技術(shù)是近年來(lái)新興的細(xì)胞修復(fù)治療技術(shù)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)具有多向分化潛能，移植后可改善AD導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙?？煽康捏w外誘導(dǎo)方式可以促進(jìn)MSCs靶向神經(jīng)元分化，提高生物利用率。本文著重對(duì)UC-MSCs的特性和優(yōu)勢(shì)、治療AD可能的機(jī)制、體外誘導(dǎo)靶向分化的方式展開(kāi)綜述，旨在為UC-MSCs治療AD的實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供理論依據(jù)，為治療AD尋找新思路。

1 AD的治療現(xiàn)狀

當(dāng)下明確批準(zhǔn)治療AD的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，但僅可暫時(shí)改善癥狀，對(duì)疾病病程沒(méi)有影響。目前藥物開(kāi)發(fā)更多地瞄準(zhǔn)疾病修飾療法，能夠延緩AD臨床病程甚至逆轉(zhuǎn)認(rèn)知衰老。近年來(lái)靶向菌-腸-腦軸和抗淀粉樣單克隆抗體成為研究熱點(diǎn)，但長(zhǎng)期的療效和安全性存在巨大爭(zhēng)議[1]。研究[2]顯示中藥也可抑制β-淀粉樣蛋白(Aβ)異常沉積和Tau蛋白過(guò)度磷酸化，包括單味中藥和復(fù)方制劑，但具體機(jī)制和毒副作用未闡明。除藥物治療外，非藥物治療輕中度AD也獲得極大關(guān)注。研究[3]證明運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)腦功能具有直接的益處，有氧運(yùn)動(dòng)可以增加腦血流量，提高氧利用率，改善突觸可塑性和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，協(xié)同認(rèn)知訓(xùn)練效果更佳，可以涉及記憶、計(jì)算、語(yǔ)言等多個(gè)領(lǐng)域。感覺(jué)刺激包括音樂(lè)療法、芳香療法、光療法等，能緩解AD患者的焦慮抑郁情緒，調(diào)節(jié)睡眠節(jié)律，改善認(rèn)知和行為[4]。此外，針灸、經(jīng)顱磁刺激等也可改善認(rèn)知障礙，提高AD患者的日常生活能力。但這些方法治療效果仍需要大規(guī)模數(shù)據(jù)的支持?？傊?，目前尚無(wú)明確治療AD的有效方法。近年來(lái)大量關(guān)注點(diǎn)集中在MSCs移植治療AD上[5]。

2 UC-MSCs的特性和優(yōu)勢(shì)

MSCs作為可持續(xù)自我更新、增殖分化的干細(xì)胞，廣泛存在于多種組織，用于神經(jīng)再生技術(shù)的MSCs來(lái)源以骨髓、脂肪和臍帶研究較多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)收集需經(jīng)骨髓穿刺獲取，且一次獲得細(xì)胞數(shù)量有限，具有分化能力強(qiáng)、免疫原性低、倫理問(wèn)題少等特點(diǎn)。Nakano等[6]通過(guò)APP/PS1小鼠腦室內(nèi)注射BMSCs將外泌體miR-146a轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞中，可減輕神經(jīng)炎癥并促進(jìn)突觸發(fā)生，改善了學(xué)習(xí)記憶障礙，但對(duì)Aβ聚集和神經(jīng)元凋亡沒(méi)有影響。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)在局麻下吸脂獲得，比BMSCs來(lái)源更廣泛。UC-MSCs來(lái)自分娩后廢棄的臍帶，獲取途徑方便，對(duì)于供體幾乎沒(méi)有創(chuàng)傷，倫理問(wèn)題更少。黃平等[7]研究表明UC-MSCs較ADSCs對(duì)外周血單核細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，同時(shí)缺少抗原主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ和共刺激表面抗原CD40、CD80和CD86，所以在免疫排斥方面優(yōu)于ADSCs；在誘導(dǎo)分化方面，Drela等[8]研究表明與BMSCs相比，UC-MSCs維持在更早的胚胎期，旁分泌作用更強(qiáng)，誘導(dǎo)后表現(xiàn)出更高的神經(jīng)譜系分化傾向；以上兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)還表明相同培養(yǎng)條件下UC-MSCs體外增殖率高于BMSCs和ADSCs。相比之下UC-MSCs優(yōu)勢(shì)更明顯，可能是神經(jīng)修復(fù)治療更合適的MSCs來(lái)源。

3 UC-MSCs治療AD可能的機(jī)制

3.1提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建:腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是最常見(jiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和突觸形成。BDNF對(duì)AD導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)細(xì)胞異常激活具有潛在保護(hù)作用，增加表達(dá)可以減緩AD的病情進(jìn)展和認(rèn)知功能下降。劉莎等[9]通過(guò)立體定位法將UC-MSCs移植到AD大鼠海馬CA1區(qū)，BDNF和NGF表達(dá)均增加，改善局部微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子還可以誘導(dǎo)UC-MSCs分化為神經(jīng)元并促進(jìn)其成熟。李云逸等[10]研究表明體外過(guò)表達(dá)NGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的UC-MSCs組較單純培養(yǎng)基組產(chǎn)生了更多的神經(jīng)樣細(xì)胞團(tuán)塊，人重肽神經(jīng)絲蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)增加，誘導(dǎo)UC-MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。UC-MSCs移植可提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，增加神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)，營(yíng)造適合神經(jīng)元遷移和神經(jīng)再生的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元增殖分化。

3.2誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，增強(qiáng)突觸可塑性:研究[11]發(fā)現(xiàn)Aβ沉積和Tau過(guò)度磷酸化引起細(xì)胞膜孔隙形成，大量Ca2+內(nèi)流，破壞細(xì)胞鈣平衡，氧自由基增加，導(dǎo)致突觸丟失、細(xì)胞骨架破壞，神經(jīng)元死亡，參與AD發(fā)生。而UC-MSCs可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，促進(jìn)突觸的重構(gòu)和神經(jīng)再生。突觸素是突觸功能成熟和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要蛋白，高度參與突觸功能和神經(jīng)可塑性。Doshmanziari等[12]移植UC-MSCs后明顯上調(diào)突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43的表達(dá)，大鼠海馬區(qū)基于新生的軸突神經(jīng)纖維，可建立更加完善的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路。因此，UC-MSCs能通過(guò)表達(dá)更高水平的神經(jīng)元相關(guān)基因，分化為特定神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)鞘和細(xì)胞骨架，恢復(fù)突觸之間的聯(lián)系，激活內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，重建大腦損傷的神經(jīng)功能回路。

3.3減輕神經(jīng)炎癥，誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞清除功能:神經(jīng)炎癥是AD的發(fā)病機(jī)制之一。小膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)經(jīng)典激活“促炎”(M1)表型和交替激活“抗炎”(M2)表型。Aβ異常沉積可以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞上的模式識(shí)別受體，M1表型表達(dá)增加，M2表型的免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)作用受到抑制，釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致AD進(jìn)展。Xu等[13]研究顯示UC-MSCs通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和增強(qiáng)Aβ降解酶表達(dá)，保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元免受Aβ的神經(jīng)毒性侵害，促進(jìn)Aβ被吞噬，防止細(xì)胞凋亡。綜上，UC-MSCs移植通過(guò)交替激活小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌，抑制神經(jīng)炎癥，分泌Aβ蛋白水解酶，進(jìn)一步恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)，改善AD患者的大腦微環(huán)境。

4 體外誘導(dǎo)MSCs分化方式

MSCs的神經(jīng)元分化潛能是治療AD最有希望的修復(fù)機(jī)制。但MSCs移植后多分布在肺臟、肝臟等，細(xì)胞存活率低，且受自身多種分化潛能的影響，能特異性分化為神經(jīng)細(xì)胞的MSCs也非常有限。因此如何提高M(jìn)SCs的生物利用率，促進(jìn)向神經(jīng)元靶向分化、提高新生神經(jīng)細(xì)胞的成熟率及存活率成為研究熱點(diǎn)。

4.1化學(xué)誘導(dǎo)劑:最早的誘導(dǎo)方案就是使用化學(xué)混合物，如β-巰基乙醇、二甲基亞砜等。劉雨思等[14]取P3代UC-MSCs加入β-巰基乙醇和胎牛血清進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，加入二甲基亞砜和丁羥基茴香醚正式誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、NSE及微管相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，表明UC-MSCs可以分化為膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。使用化學(xué)劑誘導(dǎo)速度快，分化明顯，但是會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，同時(shí)有些學(xué)者認(rèn)為該方法導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)改變可能是應(yīng)激反應(yīng)，不是真正向神經(jīng)元分化，可能不適合體內(nèi)移植[15]。

4.2神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子:目前最常用的誘導(dǎo)方案是采用具有神經(jīng)功能的細(xì)胞因子與MSCs結(jié)合。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一種小分子蛋白，對(duì)細(xì)胞損傷小，安全性相對(duì)較高，經(jīng)常被添加到培養(yǎng)液中以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，如bFGF、BDNF、NGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等。bFGF和EGF是使用頻率最高的神經(jīng)誘導(dǎo)因子。bFGF是廣譜的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和促有絲分裂因子，除了促進(jìn)干細(xì)胞增殖外，還可決定其分化方向，與EGF協(xié)同可以促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化。MSCs表達(dá)TrkA和TrkB受體，BDNF與細(xì)胞膜上受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)MSCs向成熟神經(jīng)元分化。但神經(jīng)因子分子量小，半衰期短，易代謝，直接注入體內(nèi)難以滿足治療需求。因此，需建立一種有效、持續(xù)釋放細(xì)胞因子的方法提高分化效率。目前基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以幫助解決這一問(wèn)題，體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)因子質(zhì)粒進(jìn)入MSCs，不斷分泌細(xì)胞因子以實(shí)現(xiàn)自我誘導(dǎo)。IGF-1是一種促生長(zhǎng)肽，參與中樞和外周組織的分化和增殖，在生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老中發(fā)揮作用。綜上，將干細(xì)胞與相關(guān)神經(jīng)因子相結(jié)合的方法似乎更有前途。

4.3中藥分子:目前可以誘導(dǎo)MSCs神經(jīng)分化的中藥分子有銀杏葉提取物、黃連素、黃芪甲苷等。閆冬冬等[16]在UC-MSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度黃連素誘導(dǎo)液，80%以上細(xì)胞特異性表達(dá)巢蛋白、NSE、GFAP，證實(shí)了黃連素的神經(jīng)誘導(dǎo)作用，且發(fā)現(xiàn)100μg/mL濃度組誘導(dǎo)效果最明顯，UC-MSCs存活時(shí)間最長(zhǎng)。詹吉恒等[17]研究顯示虎杖苷聯(lián)合生長(zhǎng)因子(bFGF+EGF+BDNF)組較單純生長(zhǎng)因子組誘導(dǎo)MSCs神經(jīng)分化作用更強(qiáng)，提示中藥聯(lián)合生長(zhǎng)因子共同誘導(dǎo)效果會(huì)更顯著。

4.4生物活性納米材料:目前常用的生物活性納米材料有石墨烯、金納米、硒等。納米顆粒是一種可以穿越血腦屏障的微觀顆粒，副作用少，近年來(lái)納米技術(shù)已成為一種提高治療效率的生物醫(yī)學(xué)方法。殼聚糖是一種天然聚合物，具有促進(jìn)神經(jīng)再生的潛力。在體外用納米顆粒將細(xì)胞外基質(zhì)制造成3D支架結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞附著和存活、神經(jīng)元分化和軸突生長(zhǎng)，能夠更好地模擬體內(nèi)的微環(huán)境，保持細(xì)胞活力，優(yōu)點(diǎn)是低細(xì)胞毒性、良好的生物相容性等特點(diǎn)。

5 小 結(jié)

綜上所述，UC-MSCs的特性和優(yōu)勢(shì)使其具有治療潛力，在促神經(jīng)再生、提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和減輕神經(jīng)炎癥等方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，體外誘導(dǎo)神經(jīng)分化可以提高細(xì)胞生物利用率，在治療AD方面取得了一些進(jìn)展。

迄今為止，盡管UC-MSCs的基礎(chǔ)研究取得了可喜成果，但臨床應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，UC-MSCs發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。由于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室模型無(wú)法準(zhǔn)確模擬人類(lèi)體內(nèi)微環(huán)境，所以UC-MSCs移植存在一定的局限性和不確定性，在提高生物安全性避免移植后排斥反應(yīng)、實(shí)現(xiàn)UC-MSCs靶向神經(jīng)元分化并遷移到損傷部位、提高細(xì)胞在體內(nèi)存活和再生等方面還需進(jìn)一步研究，在移植途徑、移植數(shù)量、移植頻率、治療周期等方面缺乏高效安全的移植流程，不能確定體外誘導(dǎo)神經(jīng)分化的可靠方式。在未來(lái)的研究中，基因修飾和生物工程方法可能為解決這些問(wèn)題提供機(jī)會(huì)，使UC-MSCs成為臨床治療AD的有效選擇之一。