肖長斌，張法榮

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250000； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是糖尿病患者最常見和最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是目前世界范圍內引起終末期腎臟病的主要原因，已成為全球范圍內最為關注的公共健康衛(wèi)生問題［1］。探尋DN有效的新診治方法具有重大的研究意義和經濟價值。中醫(yī)藥在防治DN方面具有獨到的優(yōu)勢，其副作用小，可通過多層次、多靶點、多途徑和多環(huán)節(jié)的作用可以達到未病先防、既病防變的目的［2］。近年來，基于外泌體研究DN潛在的病理介質、標志物和治療靶點已成為防治DN的熱點領域［3］。外泌體的出現為中醫(yī)藥防治DN提供了新興的切入點，也將會成為DN中醫(yī)藥研究的重要方向［4］。

外泌體是大小范圍在30～100 nm一種納米級細胞外囊泡，它在多泡體與質膜融合后通過胞吐作用從細胞分泌到細胞外空間［5］。近年來，科學家逐漸認識到了外泌體在細胞穩(wěn)態(tài)和細胞間通訊中發(fā)揮的重要作用。在血液、精液、腦脊液、滑液、母乳、唾液、膽汁、腹水、羊水、胸膜液和尿液等多種生物體液中都可以找到外泌體的存在。腎臟不同部分分泌的外泌體，其包含內容物也不相同，在腎臟的生理、病理過程中都扮演了重要角色。

1 DN中西醫(yī)診斷標志物中外泌體的研究

DN起病癥狀隱匿，持續(xù)高血糖水平下腎臟損害病變是不可逆的，與其他原因造成的腎損害相比較，進展快，極易發(fā)展為終末期腎?。?］。西醫(yī)對DN一般采取控制血糖、血壓、飲食及其他危險因素的綜合管理治療措施。目前以微量白蛋白尿作為DN的生物標志物，但其在DN早期缺乏敏感性和特異性［7］?！饵S帝內經》言：“圣人不治已病，治未病，不治已亂，治未亂?！币虼嗽缙陬A防及診斷DN非常重要，發(fā)現和篩選精準特異性高、無創(chuàng)、價廉便捷的可以早期診斷DN的標志物也更為關鍵。

不論是在生理或病理條件下，幾乎所有類型的腎臟細胞都能釋放對應的外泌體［8］。外泌體中包含重要的蛋白質和遺傳物質，能夠體現其來源細胞及系統(tǒng)的病理、生理狀態(tài)，與腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，借助外泌體通過無創(chuàng)方法可以提高快速準確診斷腎臟疾病的能力，因此近年來外泌體已經受到腎臟領域專家學者的重視。ROSSI等［9］對DN患者尿液外泌體中水通道蛋白5（AQP5）和水通道蛋白2（AQP2）的排泄情況進行分析，顯示AQP5和AQP2與DN的組織學分級呈正相關，提示外泌體可作為一種新手段進行無創(chuàng)診查腎臟損害程度。miRNA是外泌體研究中的重要內容物，外泌體釋放miRNA對受體細胞發(fā)揮功能活性作用，其可以通過影響轉錄后基因的表達調控靶細胞，外泌體的表面結構能夠保護核酸和其他生物大分子在體內不被降解，因此尿液外泌體中的miRNA作為DN早期診斷標志物具有足夠穩(wěn)定性［10］。利用miRNA的差異性表達可進行DN預測診斷的研究［11］。BARUTTA等［12］通過對伴和不伴早期DN的1型糖尿病患者及早期DN動物模型尿液外泌體中miRNA的表達進行評估，發(fā)現在DN早期尿液外泌體miRNA表達異常，其中miR－145顯著富集，研究團隊認為miR－145可作為DN候選生物標志物。有研究在對2型DN病人的尿液外泌體進行PCR陣列分析顯示，miR－15b、miR－34a與miR－636表達高度上調，這3種miRNA與血清肌酐和尿蛋白肌酐比之間存在正相關聯(lián)系，可作為2型DN診斷和病理研究的重要線索［13］。外泌體源miRNAs可以通過介導細胞－細胞間的信息交流參與DN的病理改變。TSAI等［14］發(fā)現高糖狀態(tài)引起miR－15b－5p表達上調，其與DN中的靶標B細胞淋巴瘤2（Bcl－2）結合后誘導腎小球系膜細胞（MMCs）凋亡；此外，TSAI還發(fā)現尿外泌體miR－15b－5p水平升高與腎功能下降相關；因此miR－15b－5p具有預測DN腎損傷的潛力。由此可見外泌體可能是導致早期DN程進展的重要因素。雖然目前腎穿刺活檢術是明確DN腎損傷情況的金標準，但有創(chuàng)性及術后可能帶來并發(fā)癥等問題使其在臨床廣泛應用受到制約。尿液中的外泌體方便易取，因而外泌體可以作為無創(chuàng)生物標志物的優(yōu)先候選物。

2 DN的中醫(yī)證候中外泌體的研究

20世紀80年代沈自尹教授提出了微觀辨證的概念，即是臨床過程中在中醫(yī)宏觀辨證思想指導下，發(fā)揮現代科學在機體微觀認識層面的優(yōu)勢，對證的物質基礎進行更完整、更準確、更本質地闡明［15］。通過患者的尿液、血液、影像及腎穿刺活檢等檢查病理結果可以反映腎臟的病變情況，從而實現宏觀與微觀辨證相互補充。外泌體是由臟腑在正常生理或異常病理狀態(tài)下產生，分布在人體多種體液中，因此可歸屬于中醫(yī)學中的精血、津液一類。消渴病失治誤治，日久易耗傷陰氣，陰損及陽，最終腎臟虛損，DN狀態(tài)下外泌體被激活，借經絡循行或氣血運行，導致腎臟纖維化等相關病理改變，這符合外泌體調控病理改變的生物學特性。呂春燕［16］在“清濁相干”這一病機理論指導下經過實驗發(fā)現，在腎間質纖維化患者中尿外泌體源miR－29c、miR－21和E－cadherin、Vimentin的表達情況均出現了一定程度的變化，與精微糟粕物質升降失常導致腎間質纖維化的“清濁紊亂”病機理論相一致。腎間質纖維化患者上述尿外泌體中miR－29c呈恒定下降表達；且其表達變化與纖維化程度一致；并與腎功能損傷指標等相關，有潛力作為腎臟纖維化程度的穩(wěn)定監(jiān)測指標。把尿液外泌體中的蛋白、基因、抗原、抗體等信息作為診斷腎臟疾病的一種生物標志物，是中醫(yī)腎臟病微觀辨證的一大飛躍。外泌體等非侵入性的腎臟標志物有助于對DN患者的腎臟損傷情況進行連續(xù)監(jiān)測。DN中的外泌體研究雖為微觀分子學，其在不同狀態(tài)下的不同表達及可反應來源母細胞狀態(tài)等特點，與中醫(yī)辨證的整體觀、恒動觀不謀而合。

中醫(yī)各家在DN證候認識方面觀點雖不盡相同，但多數中醫(yī)學家以本虛標實、虛實夾雜為DN的主要病機特點，目前臨床有以虛實劃分的分型辨證及以疾病階段劃分的分期辨證等辨證方法，DN辨證分型呈現出多樣化的特點［17］。目前公認轉化生長因子－β1（TGF－β1）參與DN關鍵信號轉導和基因調控機制［18］。已有多項實驗資料證實外泌體調控TGF－β1信號通路參與到腎小球、腎小管和腎間質病變中［19］，導致腎臟纖維化，且該病變過程影響DN預后效果［20］。呂仁和教授認為“腎絡徵瘕”是造成DN腎臟損害的重要原因，腎絡癥瘕的形成與腎臟纖維化的發(fā)生相呼應［21］。DN病理狀態(tài)下，腎臟功能和機體氣血津液運行失常，痰、熱、濕、瘀等病理產物郁結為濁毒，濁毒羈留，則痰熱濕瘀更加膠結難化，日久形成腎絡癥瘕，導致腎纖維化，使得腎臟功能受損［22］。痰熱濕瘀濁毒等病理產物蓄積引起了腎臟功能結構的損害，這些病理產物的生成與外泌體生理病理狀態(tài)下的功能變化具有相通之處。因此，痰熱濕瘀濁毒等病理產物是外泌體攜帶的致病信息媒介，可以將痰、熱、濕、瘀等DN標實證中的外泌體作為研究對象，從整體上分析外泌體在不同證型中的表達情況，可為DN標實證的標準化診斷提供更精準的參考，從而探索DN中證候規(guī)律與發(fā)病機制。外泌體作為由臟腑分泌的物質基礎，可以作為靶向信使溝通相關臟腑間的信息。在研究中醫(yī)證候機制的過程中引入外泌體，以微觀辨證的思維作為橋梁，分析外泌體在DN證候發(fā)生過程中的變化，這將開啟系統(tǒng)性研究DN中醫(yī)證候微觀辨證的現代生物機制的新篇章［23］。

3 中醫(yī)藥治療DN中外泌體的研究

中醫(yī)藥在治療DN方面具有獨特的作用和優(yōu)勢。腎臟為先天之本，內藏先天之精，與現代醫(yī)學相關理論進行分析聯(lián)系得出臟腑之精與細胞外基質、組織液和細胞間信號分子等構成的細胞微環(huán)境有關［24］。安笑葉等［25］通過CiteSpace對外泌體應用于中醫(yī)藥研究相關文獻分析發(fā)現，自2018年起DN已成為外泌體應用于中醫(yī)藥領域的研究熱點。EBRAHIM［26］在誘導的糖尿病大鼠模型中發(fā)現，來源于間充質干細胞（MSC）的外泌體可以提高小鼠自噬能力來抑制mTOR通路，從而起到抗纖維化、保護腎功能的作用。這為使用外泌體作為DN新的生物治療方法提供了支持。研究證實，中藥單體及復方可以通過調控外泌體調節(jié)多種信號通路來改善DN癥狀、延緩DN的進展、保護腎功能。

3.1 中藥單體調控外泌體研究

已有研究表明黃連可通過調節(jié)相關細胞因子和信號轉導途徑延緩DN的進展，而小檗堿是黃連的主要活性成分。WANG等［27］首次證實了高糖誘導的腎小球系膜細胞可通過釋放外泌體轉化TGF－β1來損害足細胞的功能，且100 μmol/L小檗堿可下調外泌體TGF－β1的表達和足細胞的凋亡，增加足細胞的黏附能力和足細胞特異性標志蛋白的表達，抑制TGF－β1從腎小球系膜細胞向足細胞的轉移，從而起到保護足細胞的作用。穿山龍總皂苷處理后的腎小球系膜細胞外泌體中TGF－β1表達明顯降低，且經干預的外泌體刺激下的系膜細胞增殖及細胞外基質沉積減少，因此可以證明外泌體TGF－β1是穿山龍總皂苷發(fā)揮治療作用的靶點［28］。最新的研究也發(fā)現淫羊藿苷可通過介導外泌體miR－192－5P及GLP－1R途徑恢復DN腎小管上皮細胞自噬功能，從而減輕腎小管間質纖維化程度，為DN腎臟纖維化治療提供一種新選擇［29］。

3.2 中藥復方調控外泌體研究

通心絡膠囊是由人參、水蛭、全蝎、蟬蛻、蜈蚣等12種中草藥組成的中藥復方，近年來被應用于DN的治療，對糖尿病大鼠模型灌胃200 μg/mL的通心絡膠囊，提取模型大鼠的腎小球內皮細胞，發(fā)現經通心絡膠囊處理的腎小球內皮細胞產生的外泌體不能在體內外觸發(fā)系膜細胞的激活、增殖和細胞外基質的過量產生，這就提示通心絡膠囊可以阻止TGF－β1通過外泌體向腎小球系膜細胞轉移，從而起到治療DN的作用［30］。崔方強等［31］研究發(fā)現，保腎通絡方（黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭和丹參）可使細胞外基質中的基膜膠原、大分子糖蛋白及外泌體miR－192 mRNA的表達水平下降，同時抑制DN腎小球系膜細胞的增殖活性，細胞外基質增生減少?？梢姡ＤI通絡可通過下調外泌體miR－192的表達，進而降低腎小球系膜細胞活化及減少足細胞損傷，從而延緩DN病情進展。

綜上所述，中醫(yī)藥可通過作用于外泌體靶向影響效應細胞，發(fā)揮對DN的治療作用，可為中醫(yī)藥提供治療DN新的思路。但目前關于外泌體在中醫(yī)藥治療DN中具體作用機制的研究尚不夠完善，還需要進一步實驗明確挖掘。

4 中藥載體治療DN中外泌體的研究

雖然中醫(yī)學擁有完整的理論體系支撐，其良好的臨床療效也得到了驗證，但目前中藥以湯、丸、散、顆粒等為主要制劑為主，存在著有效成分難以完全溶解、生物利用度相對較低、起效時間較長等不足［32］。探尋更加有效、精準、科學、現代化的給藥方式是提高中醫(yī)藥治療DN臨床療效的重要途徑。外泌體攜帶的多種內容物質可以對某些病變起到治療作用；與其他載體相比，由于外泌體來源于細胞自身，免疫系統(tǒng)將其識別為“自我”，因此外泌體的免疫原性低；外泌體的表面結構使得網狀內皮系統(tǒng)不易將其捕獲，可以提高其在血液中的穩(wěn)定性；外泌體負載藥物由于外泌體結構的有效保護而表現出高有效率；外泌體在攜帶藥物時發(fā)揮其靶向性的生物特性，易與受體細胞融合，達到被動靶向作用；外泌體獨特的雙重親水性和疏水性膜結構使其易于通過生物膜屏障，可以設計特定的給藥方式和修飾發(fā)揮載體的作用；外泌體是與受體細胞結構相似的來源于生物細胞的納米顆粒，這種特性使其易于被多種細胞吸收［33］。綜上所述，外泌體作為藥物傳遞的良好載體因具有免疫原性低、穩(wěn)定性好、半衰期長、傳遞率高和能穿越血腦屏障等優(yōu)點從而具有獨特優(yōu)勢［34］。目前對姜黃素、紫杉醇、花青素、雷公藤紅素等中藥有效成分以牛奶來源外泌體為藥物載體的實驗結果表明，牛奶來源外泌體可以提高中藥濃度、穩(wěn)定性、療效及減輕不良反應［35］。在數字化今天， 研究利用外泌體等更加高效精準安全的藥物載體，可以更好實現中藥對于DN的治療作用。目前外泌體作為新興領域，不同中藥、不同疾病如何選擇合適的外泌體、如何將藥物更加高效地加載于外泌體上等問題，是今后開發(fā)外泌體需要著力解決的問題。

5 小結

外泌體在介導健康和疾病的細胞間通訊中起著至關重要的作用，越來越多的研究表明，外泌體參與了與DN相關的病理、生理過程，尿液外泌體中攜帶的內容物，如miRNA和蛋白質，可以用作糖尿病的早期標志物，并有可能預測疾病進展［36］。深入探討在DN證候中各類外泌體的表達情況，能夠為證候診斷及標準化提供新的發(fā)展思路，也可為各證候機制研究提供新的研究方法。中醫(yī)藥對于DN作用于多靶點、多途徑，外泌體可通過影響外泌體分泌量或內含成分延緩DN的進展、保護腎功能，外泌體作為藥物載體的應用可使治療更加高效精準。目前外泌體在中醫(yī)藥研究領域尚未完全成熟，外泌體對于DN的調節(jié)機制比較復雜，將其投入到臨床實際應用還需不斷探索其具體機制內涵。確定哪些外泌體可作為早期DN診斷標志物、外泌體何種成分發(fā)揮了中藥的治療作用、如何更好地利用外泌體運載中藥成分等問題，也是下一步科研人員攻堅克難的方向。