程子芥,蘭嘉豪,劉曉敏,魏 婕,梅 瀚,曹金鳳,劉世巍,丁建海

(寧夏師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,寧夏 固原 756099)

真菌(Fungi)是一種具有真核的、產(chǎn)孢的和無(wú)葉綠體的微生物.它包含霉菌、酵母、蕈菌以及其他人類所熟知的菌菇類.真菌不但具有食用價(jià)值,其次生代謝產(chǎn)物還具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等生物活性[1-3].正因如此,真菌的代謝產(chǎn)物研究已成為現(xiàn)代科學(xué)家們關(guān)注的焦點(diǎn).菌物中子實(shí)體體積較大的一類真菌被稱為高等真菌或大型真菌,通常稱為蘑菇.高等真菌主要分為子囊菌和擔(dān)子菌.高等真菌屬于“創(chuàng)造系數(shù)”很高的生物資源,它們所含的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣且新穎,這種化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)于現(xiàn)代藥物和農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要.此外高等真菌菌種可以長(zhǎng)期保存,很多種類易發(fā)酵培養(yǎng),一旦發(fā)現(xiàn)有應(yīng)用價(jià)值的化合物,將有可能通過(guò)發(fā)酵方法解決資源來(lái)源問(wèn)題[4].

麻臉蘑菇(AgaricusvillaticusBrond)又名麻臉菇,隸屬于擔(dān)子菌門、蘑菇科和蘑菇屬的高等真菌,主要生長(zhǎng)于春天到秋天的草原上,單生到群生.麻臉蘑菇主要分布于寧夏、新疆、吉林、西藏、山西、內(nèi)蒙古和甘肅等地,有很高的食用價(jià)值[5-7].然而其中的化學(xué)成分尚不明確.本文研究的麻臉蘑菇采自寧夏師范學(xué)院古雁校區(qū)內(nèi),經(jīng)過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng),從其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離出7個(gè)化合物.分別鑒定為(22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇、2-苯乙醇、2,3-丁二醇、甘油三酯、鄰苯二甲酸二丁酯、正十五烷酸和甘油.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨和大豆瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司),乙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚和甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),香草醛、濃硫酸、氘代氯仿、氘代甲醇、80～100目和200～300目柱層層析硅膠(上海麥克林生化科技有限公司),HSGF254薄層色譜硅膠預(yù)制板(煙臺(tái)維啟化工產(chǎn)品有限公司),Sephadex LH-20凝膠(瑞典 Amersham Biosciences公司).

1.2 儀器

Bruker DRX-500 MHz型和 Bruker AV-400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司),AutoSpec Premier P776型三扇型雙聚焦磁質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司),ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司),FA2204B型電子天平(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司),DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),FA2204B型電子分析天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司),RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),WAC-60型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(大韓科學(xué)有限公司),HR-Ⅱ A2型接種工作臺(tái)(青島海爾特種電器有限公司),SKY-2112C型超特大容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司),1260 Infinity II Prime型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司).

1.3 菌種的培養(yǎng)與液體發(fā)酵

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)由馬鈴薯20 g(煮20 min后過(guò)濾)、葡萄糖2 g、瓊脂2 g和蒸餾水100 mL配制而成,在高壓滅菌鍋中于121℃滅菌30 min.

改良馬丁培養(yǎng)基由葡萄糖15 g、磷酸氫二鉀0.15 g、蔗糖30 g、硫酸鎂0.15 g、酵母粉1.5 g和蒸餾水300 mL配制而成,在高壓滅菌鍋中于121℃條件下滅菌30 min.

1.3.2 菌種的分離與純化

采用組織分離法來(lái)分離純化菌絲體.將麻臉蘑菇子實(shí)體菌柄剪短,用75%乙醇進(jìn)行表面消毒.在無(wú)菌環(huán)境下用火焰滅菌的手術(shù)刀縱向切開麻臉蘑菇子實(shí)體,取菌傘和菌柄連接部分約綠豆大小的子實(shí)體組織塊,迅速接種到PDA平面培養(yǎng)基上,將培養(yǎng)基置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中,觀察2周.

當(dāng)麻臉蘑菇子實(shí)體組織塊周圍長(zhǎng)出菌絲體后,在無(wú)菌環(huán)境下用高溫滅菌的接種鏟挑取外圍生長(zhǎng)最旺盛的菌絲體,用三點(diǎn)法接種于PDA平面培養(yǎng)基上.置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中,觀察菌絲和菌落的形態(tài),判斷是否為單一菌落.若無(wú)單一菌落則按上述步驟繼續(xù)純化,直至純化出單一菌落,將單一菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基保存.

1.3.3 液體發(fā)酵

菌種活化需在無(wú)菌環(huán)境下,將保存于PDA斜面培養(yǎng)基的麻臉蘑菇菌絲體轉(zhuǎn)接到PDA平面培養(yǎng)基上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中,直至菌絲體長(zhǎng)滿平板再進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng).

液體發(fā)酵培養(yǎng)要在無(wú)菌環(huán)境下,打開已活化好的平板,用經(jīng)過(guò)火焰滅菌的接種鏟將長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基切成9 mm×9 mm的菌餅,分別接入提前滅菌完畢的改良馬丁培養(yǎng)基中并封口(每個(gè)液體培養(yǎng)基接入一個(gè)菌餅).總計(jì)接種發(fā)酵100瓶共30 L.將完成接種的培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中,在28℃,180 r/min條件下發(fā)酵25天.

1.4 發(fā)酵液的提取與分離

將發(fā)酵物用紗布過(guò)濾,分離菌絲體和菌液.其中菌絲體用甲醇-乙腈(v/v 1∶1)浸泡,并將其置于超聲清洗儀中超聲破壁1 h,再用紗布過(guò)濾,分離菌絲體和濾液,將濾液減壓濃縮得菌絲體提取物.重復(fù)提取菌絲體3次,合并提取物.菌液減壓濃縮后和菌絲體提取物合并,然后加入去離子水稀釋,再用乙酸乙酯萃取5次,將萃取液合并,濃縮得浸膏15.8 g.

乙酸乙酯層浸膏用柱層析法分離,洗脫劑以石油醚-乙酸乙酯體系進(jìn)行梯度洗脫,期間逐步增加乙酸乙酯組分的比例至純乙酸乙酯,用薄層色譜法檢測(cè)洗脫產(chǎn)物,再合并相同部分,最終得到5個(gè)組分P1～P5.

P1經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯 v/v 10∶1)洗脫,Sephadex LH-20凝膠柱(乙酸乙酯)純化,得化合物a鄰苯二甲酸二丁酯(5.8 mg),以石油醚/乙酸乙酯 v/v 4∶1洗脫,Sephadex LH-20凝膠柱(乙酸乙酯)純化,得到化合物b正十五烷酸(6.9 mg).

P2經(jīng)正相硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯v/v 3∶1)洗脫,Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)分離純化,得到化合物c (22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(15.3 mg).

P3經(jīng)正相硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇v/v 30∶1)洗脫,得到化合物d 2-苯乙醇(9.5 mg),用二氯甲烷/甲醇 v/v 20∶1洗脫,Sephadex LH-20凝膠柱(二氯甲烷/甲醇 v/v 1∶1)純化,得到化合物e 2,3-丁二醇(6.6 mg).

P4經(jīng)正相硅膠柱層析(二氯甲烷/甲醇v/v 20∶1)洗脫,Sephadex LH-20凝膠柱(甲醇)純化,得化合物f 甘油三酯(22.5 mg).

P5用高效液相制備色譜儀(Pursuit XRs 10 μm C18 250×10.0 mm,25℃,水/乙腈 v/v 1∶1,流速3 mL/min)按固定比例的洗脫劑洗脫,分離純化得化合物g 甘油(tR= 8.53 min,8.7 mg).

2 化合物波譜數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)解析

化合物a為鄰苯二甲酸二丁酯,其性狀是白色粉末.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z301.1400 [M+Na]+,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C6H22O4,不飽和度為6.如圖1與圖2所示,化合物a的1H NMR中δH3048 Hz(H-3,6)和3008 Hz (H-4,5)兩組信號(hào)峰的峰面積相同,表明該化合物是二取代苯環(huán)衍生物.13C NMR中δC16770 Hz (COO -)信號(hào)表明該化合物存在酯基,同時(shí)δC6550 Hz (C-1′,1″)說(shuō)明該C原子和酯基中的O原子相連.其余碳信號(hào)均在高場(chǎng)區(qū)分布,結(jié)合碳信號(hào)數(shù)量表明該化合物有丁基碳鏈,同時(shí)根據(jù)氫譜中氫信號(hào)的比例,可判斷該化合物有2條丁基碳鏈,呈對(duì)稱分布.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道一致,因此鑒定化合物a為鄰苯二甲酸二丁酯,其結(jié)構(gòu)式如圖3所示.

圖3 鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)式

化合物b為正十五烷酸,其性狀是無(wú)色油狀物.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z483.2173 [2M-H]-,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C15H30O2,不飽和度為1.如圖4與圖5所示,化合物b的13C NMR中δC18020 Hz (C-1)為羧酸信號(hào),δH500 Hz (H-4～14)之間大量的氫信號(hào)說(shuō)明該化合物是脂肪酸.結(jié)合碳譜與質(zhì)譜確定該化合物含有15個(gè)碳信號(hào).進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致,因此鑒定化合物b為正十五烷酸,其結(jié)構(gòu)式如圖6所示.

圖6 正十五烷酸的結(jié)構(gòu)式

化合物c為(22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇,其性狀是白色針狀晶體.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z429.3208 [M+H]+,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C28H44O3,不飽和度為7.如圖7與圖8所示,化合物c的1H NMR中δH3250 Hz (H-6)與3120 Hz (H-7)為一對(duì)雙鍵上的H,并且雙鍵α位和O原子相連.13C NMR中δC10287.5 Hz (C-5)和9937.5 Hz (C-8)也證明了這一點(diǎn).該信號(hào)為過(guò)氧麥角甾醇的特征峰.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致,因此鑒定化合物c為(22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇,其結(jié)構(gòu)式如圖9所示.

圖9 (22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇的結(jié)構(gòu)式

化合物d為2-苯乙醇.其性狀是淡黃色油狀物.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z267.2329 [2M+Na]+,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C8H10O,不飽和度為4.如圖10與圖11所示,化合物d的1H NMR中δH3660 Hz(H-3′,4′,5′)和3620 Hz (H-2′,6′)信號(hào)表明該化合物是單取代苯環(huán)衍生物.1H NMR中δH1935 Hz (H-1)和1440 Hz (H-2)為2個(gè)亞甲基信號(hào)而且均為3重峰,表明2個(gè)亞甲基相連,而且其中一個(gè)亞甲基δH1935 Hz (H-1)和羥基相連,另一個(gè)亞甲基與苯環(huán)相連.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致,因此鑒定化合物d為2-苯乙醇,其結(jié)構(gòu)式如圖12所示.

圖12 2-苯乙醇結(jié)構(gòu)式

化合物e為2,3-丁二醇.其性狀是淡黃色油狀物.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z203.0791 [2M+Na]+,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C4H10O2,不飽和度為0.如圖13與圖14所示,化合物e的1H NMR中δH1360 Hz (H-2,3)和312 Hz (H-1,4)的峰面積比例為1∶3,而且δH1360 Hz (H-2,3)為多重峰,δH312 Hz (H-1,4)為雙峰,結(jié)合DEPT圖譜可知δC7040 Hz (C-2,3)為連O次甲基,1640 Hz (C-1,4)為甲基.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致,因此鑒定化合物e為2,3-丁二醇,其結(jié)構(gòu)式如圖15所示.

圖15 2,3-丁二醇結(jié)構(gòu)式

化合物f為甘油三酯.其性狀是黃色油狀物.如圖16與圖17所示,化合物f的1H NMR中δH516 Hz處有大量信號(hào),表明該化合物含有脂肪鏈結(jié)構(gòu).13C NMR中δC6880 Hz (C-2)與6210 Hz (C-1,3)為甘油的特征峰.而δC17320 Hz (C-4,4′′)和17280 Hz (C-4′)處的信號(hào)顯示該化合物存在3個(gè)酯基.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致,因此鑒定化合物f為甘油三酯,其結(jié)構(gòu)式如圖18所示.

圖18 甘油三酯結(jié)構(gòu)式

化合物g為甘油.其性狀是淡黃色油狀物.質(zhì)譜顯示其分子量為m/z185.0124 [2M+H]+,進(jìn)而推測(cè)該化合物的分子式C3H8O3,不飽和度為0.如圖19與圖20所示,化合物g的1H NMR中兩組氫信號(hào)峰面積為1∶4.結(jié)合13C NMR中δC7380 Hz (C-2)和6430 Hz (C-1,3)表明該化合物有2個(gè)亞甲基和1個(gè)次甲基,而且均與O原子相連.進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)得知,上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致,因此鑒定化合物g為甘油,其結(jié)構(gòu)式如圖21所示.

圖21 甘油結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

本文采用柱層析法,高效液相色譜法對(duì)麻臉蘑菇發(fā)酵液提取物進(jìn)行分離,從中得到7個(gè)化合物.通過(guò)核磁共振波譜儀及高分辨質(zhì)譜儀確定了化合物的結(jié)構(gòu).經(jīng)鑒定分別為鄰苯二甲酸二丁酯、正十五烷酸、(22E,24R)-5,8-過(guò)氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇、2-苯乙醇、2,3-丁二醇、甘油三酯和甘油.所有化合物均為首次從麻臉蘑菇中分離得到.麻臉蘑菇作為一種食用菌,含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),本文初步研究了其中發(fā)酵液的化學(xué)成分,為麻臉蘑菇的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù).