肺炎克雷伯菌乳房炎的致病機理及其耐藥性分析

李海源

莘縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心，山東聊城 252400

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛在養(yǎng)殖過程中乳腺部位受到外部物理、化學(xué)或病原微生物的入侵而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的一種常見疾病?；疾∪榉績?nèi)部會發(fā)生病理變化，主要表現(xiàn)為乳汁中體細(xì)胞數(shù)量增多、pH值大于7.0，NaCl的含量增高，電導(dǎo)率上升，細(xì)菌學(xué)鑒定為陽性等[1]。

奶牛乳房炎是一種危害牛群范圍廣的疾病，國外發(fā)病率可達(dá)25%～60%，國內(nèi)的平均發(fā)病率可達(dá)33.4%[2]。我國每年由于乳房炎而淘汰的奶牛占總淘汰奶牛數(shù)的10%，經(jīng)濟損失高達(dá)6 億元人民幣[3]。

奶牛乳房炎致病微生物主要分為傳染性病原微生物和環(huán)境型病原微生物，其中環(huán)境型病原微生物占主要地位[4]，主要包括大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、沙雷氏菌、腸球菌和肺炎克雷伯菌等。它們廣泛存在于墊料等牛舍環(huán)境中，感染細(xì)菌后，可引起乳房部位發(fā)生急性紅腫，堅硬且有觸痛，乳汁呈絮狀或水樣，嚴(yán)重者產(chǎn)奶量顯著下降[5]。其中的肺炎克雷伯菌還能進(jìn)一步感染奶牛尿道、呼吸道、甚至血液等，引發(fā)尿道炎、肺炎、菌血病[6]。

目前對肺炎克雷伯菌通常采用β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗生素藥物治療，但由于這類藥物的濫用，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌合成超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷鈍化酶的基因表達(dá)上調(diào)，耐藥性進(jìn)一步增強[7]。因此，對肺炎克雷伯菌的生物學(xué)特性、毒力基因和耐藥性有更深刻的認(rèn)識是非常必要的。

1 生物學(xué)特性

肺炎克雷伯菌主要存在于機體口腔、皮膚和腸道以及自然界的水、土壤等外界環(huán)境中。該菌為革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬，通常分為5 個種和3 個亞種，分別為肺炎種、產(chǎn)酸種、土生種、植生種、變形種，肺炎亞種、臭鼻亞種和鼻硬結(jié)亞種[8]。

肺炎克雷伯菌為兼性厭氧菌，能通過氧化和發(fā)酵等方式進(jìn)行代謝，具有莢膜和菌毛等主要抗原成分，還能夠產(chǎn)生多種致病毒力因子。此菌對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中即可生長繁殖，菌落呈現(xiàn)白色粘液狀，體型偏大，用接菌環(huán)挑起后容易拉絲[9]。在37 ℃、pH值7.0～7.6條件下生長迅速，能產(chǎn)生大量莢膜多糖、脂多糖等細(xì)胞外毒性復(fù)合物，形成較厚莢膜[10]。

當(dāng)機體免疫力正常時，肺炎克雷伯菌只是潛伏在機體內(nèi)，而不會引發(fā)疾??；當(dāng)機體免疫力下降時，其可突破機體免疫屏障，迅速繁殖并產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致奶牛出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生腦膜炎、腹膜炎、乳房炎、肺炎、膽囊炎、尿路感染和敗血癥等，發(fā)病率和致死率較高[11]。尤其在乳房炎方面，肺炎克雷伯菌會破壞乳腺分泌乳汁的能力，且發(fā)病緩慢，在早期不易發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致奶牛的泌乳能力長時間下降[12]，且治療后最高只能達(dá)到50%治愈率，比其他同種大腸菌群感染的治愈率更低[13]。

肺炎克雷伯菌基因組有5 000～6 000 個基因，其中約有2 000 個核心基因，剩下的均為副基因。在肺炎克雷伯菌毒力因子的合成中，核心基因和副基因共同進(jìn)行編碼，如莢膜多糖、脂多糖、黏附因子和鐵載體等物質(zhì)[14]。

2 流行病學(xué)調(diào)查

肺炎克雷伯菌感染范圍廣。有研究者對津巴布韋多個患病奶牛的致病菌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌占細(xì)菌總數(shù)的15.5%[13]。曹菲菲[15]等在2017—2018年，對浙江、江蘇、廣東、安徽、河北和內(nèi)蒙古等地區(qū)11 個奶牛場的乳房炎奶牛的牛奶樣本進(jìn)行采樣，從856 份樣品中分離出119 株肺炎克雷伯菌。Gao[16]等于2014—2016年對我國黑龍江、遼寧、北京、山東、天津、河南等地大型奶牛場的乳房炎奶牛的牛奶樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯屬細(xì)菌的分離率達(dá)13.0%。

肺炎克雷伯菌能長時間穩(wěn)定存在，是影響奶牛乳房炎發(fā)病率的重要因素。Song[17]等于2018—2019年對山東、河北和黑龍江3 家規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的乳房炎奶牛進(jìn)行了長達(dá)2 年的持續(xù)跟蹤研究，采集6 301 份奶樣，分離出183 株肺炎克雷伯菌，2 年間對該菌的分離率較穩(wěn)定，沒有顯著性差異。

3 肺炎克雷伯菌的毒力因子

3.1 莢膜多糖

莢膜多糖是由多個重復(fù)的寡聚糖衍生物組合形成，松散包裹細(xì)胞壁，幫助病菌對抗機體中補體介導(dǎo)的吞噬作用，還可抵抗宿主的非特異性免疫防御機制，也是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子之一。莢膜通常附著在病菌表面，入侵至機體后，莢膜可與菌毛協(xié)助作用，促進(jìn)病菌定植、增殖和遷移[18]。不同個體肺炎克雷伯菌的莢膜不同，這是因為編碼莢膜多糖的基因中有一段可變區(qū)（CD1-VR2-CD2），通常根據(jù)此序列的變化來分型[19]。目前大部分肺炎克雷伯菌株的血清型屬于K1和K2，也有研究者對不同血清型的毒力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)K1、K2和K5這三種血清型的毒性較強，和某些人畜共患傳染病相關(guān)[20]。不僅如此，毒力高低還和莢膜多糖產(chǎn)生量相關(guān)，有部分菌株毒力增強就是因為莢膜多糖過量產(chǎn)生[21]。病菌感染初期，莢膜多糖可幫助病菌抵抗免疫細(xì)胞吞噬，抵御抗菌肽作用，還可抑制早期免疫應(yīng)答和樹突狀細(xì)胞的成熟[22]。

3.2 脂多糖

脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的重要組成部分，由糖、蛋白質(zhì)和磷脂復(fù)合物組成，也被公認(rèn)為是細(xì)菌引起敗血性休克的主要原因。其中由于O抗原結(jié)構(gòu)不同分為不同血清型，最主要的為O1、O2和O3三種血清型[23]。脂多糖的變化也會影響細(xì)菌對抗菌肽的抵抗作用，且能誘導(dǎo)機體發(fā)生炎癥反應(yīng)。

3.3 黏附因子

病菌侵染宿主細(xì)胞時，黏附是細(xì)菌定植的關(guān)鍵，病菌靠自身的黏附素與宿主表面受體特異性結(jié)合，為后續(xù)侵襲和繁殖做好基礎(chǔ)[24]。肺炎克雷伯菌則通過菌毛完成，主要包括Ⅰ型菌毛、Ⅲ型菌毛和非纖毛型的黏附蛋白。

I型菌毛是由一組Fim（A、B、C、D、E、F、G、H、I）基因群表達(dá)，其中Fim H可編碼I型菌毛尖端的黏附蛋白的表達(dá)[25]。I型菌毛可穿透莢膜向外延伸，調(diào)節(jié)機體對宿主細(xì)胞D-甘露糖的敏感性黏附，且實驗證明I型菌毛是引起尿路感染的重要因素。

Ⅲ型菌毛具有甘露糖抗血凝特性，可凝集經(jīng)鞣酸處理過的紅細(xì)胞。由Mrk（A、B、C、E、F）基因群編碼，其黏附蛋白位于菌毛尖端，由Mrk基因進(jìn)行編碼[26]。Ⅲ型菌毛有利于細(xì)菌黏附在機體的呼吸道、消化道和泌尿生殖道等黏膜上皮細(xì)胞，且促使宿主表面生成生物被膜。MrkD基因?qū)Β笮途种匾笔?MrkD 后會導(dǎo)致細(xì)菌無法結(jié)合基質(zhì)外的成分，生物被膜形成也受到限制[27]。

3.4 鐵載體

鐵載體是細(xì)菌分泌的一種小分子、高親和力的鐵螯合分子，細(xì)菌可通過該物質(zhì)來攝取生長發(fā)育所需的鐵元素。目前發(fā)現(xiàn)在肺炎克雷伯菌中具有4 種鐵載體，分別是產(chǎn)氣菌素、沙門菌螯鐵蛋白、腸桿菌素和耶爾森桿菌素，這些鐵載體能使肺炎克雷伯菌生長在低鐵濃度環(huán)境中。鐵載體的不同與宿主的感染部位及嚴(yán)重程度有關(guān)，但研究發(fā)現(xiàn)，臨床上大部分的分離株都具有腸桿菌素，且編碼腸桿菌生產(chǎn)的基因與生物被膜的形成息息相關(guān)，所以腸桿菌素被認(rèn)為是病菌主要的鐵吸收系統(tǒng)[28]。

3.5 外排泵

外排泵能將病菌細(xì)胞中的藥物排出，導(dǎo)致藥物作用下降，外排泵也通常與肺炎克雷伯菌的抗生素耐藥性相關(guān)。肺炎克雷伯菌的外排泵較多，主要有RND家族外排泵AcrAB-TolC、OqxAB，MFS家族外排泵KmrA、KdeA、KpnGH，SMR家族外排泵KpnEF，MATE型外排泵KetM[29]。

4 耐藥性分析

過去幾十年中，肺炎克雷伯菌耐藥性急劇增加，除了和藥物濫用有關(guān)外，也和肺炎克雷伯菌本身特性相關(guān)。獸醫(yī)臨床上，在大量抗生素刺激下，肺炎克雷伯菌能產(chǎn)生抗生素水解酶，導(dǎo)致耐藥菌株數(shù)量不斷增加，使該菌防治變得困難。肺炎克雷伯菌對不同抗生素的敏感性具有較大差異，如對氨芐西林具有較好的先天耐藥性，這是因為其染色體中存在SHV-1青霉素酶，對其他藥物的耐藥性則是和染色體位點的突變有關(guān)[30]。其中，含有廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌對第3代頭孢具有較強耐藥性，但對頭孢吡肟這類第4代頭孢耐藥性較差，含有此類酶的病菌對幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素均具有良好耐藥性[31]。對碳青霉烯類抗生素的耐藥性和肺炎克雷伯菌的ST11、ST14、ST101、ST147和ST258等序列密切相關(guān)，這些編碼碳青霉烯酶的基因一部分存在染色體上（IMI-1、NMC-A、SME、SHV-38和SFC-1等），一部分存在質(zhì)粒上（KPC、GES和IMI-2等）[32]。

國外的研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌的耐藥性在逐漸增強。Jong[33]等對歐洲國家奶牛乳房炎樣品中的肺炎克雷伯菌耐藥性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素的耐藥性為19.5%，對頭孢噻呋不具耐藥性。曹菲菲[15]等對從乳房炎中分離出的119 株肺炎克雷伯菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，其對胺比西林的耐藥性達(dá)94.96%。Sanchez[34]等對搜集12 年間的3 132 354 株肺炎克雷伯菌的耐藥性進(jìn)行探索研究，發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯類藥物具有耐藥性的肺炎克雷伯菌對四環(huán)素和丁胺卡那霉素的交叉耐藥性較低，但對其他抗菌藥物的耐藥性都增加。Otter[35]等對倫敦40 例由肺炎克雷伯菌引起的傳染病分析發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌在10 個月時間內(nèi)發(fā)生3 次變異，變異后對秋水仙素的耐藥率達(dá)66%。Sikarwar[36]從印度多個地區(qū)收集20 株肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)其中54%的菌株具有多種耐藥性，60%以上的菌株對氯霉素和四環(huán)素具有較好耐藥性，28%～76%的菌株對頭孢噻肟具有較好耐藥性。

有研究者對我國肺炎克雷伯菌的耐藥性分析歸納，發(fā)現(xiàn)從2005—2017年，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥性由3.0%、2.9%上升到20.9%、24.9%，增長迅速[37]。高興[38]等對212 株肺炎克雷伯菌的耐藥性進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其對頭孢吡肟的耐藥性為5.7%，對環(huán)丙沙星的耐藥性為4.7%，對頭孢他啶的耐藥性為4.2%，對美羅培南的耐藥性為2.8%，對厄他培南的耐藥性為0.5%，對亞胺培南和替加環(huán)素沒有耐藥性。賈麗[39]等對32 株肺炎克雷伯菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，對恩諾沙星的敏感率最高，可達(dá)96.875%，部分病菌具有多重耐藥性，特別是對氨芐西林、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、頭孢唑啉的耐藥性較高。

5 總結(jié)

用抗生素治療肺炎克雷伯菌引起的乳房炎是奶牛場最常用的選擇，但由于抗生素濫用，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌耐藥性越來越嚴(yán)重，成為治療和預(yù)防乳房炎的重大難題。肺炎克雷伯菌多種毒力因子和能產(chǎn)生耐藥性的特殊機理對防治該菌構(gòu)建較大困難。因此，要降低肺炎克雷伯菌的危害，應(yīng)做好其毒力作用機制和耐藥性特性的研究，更深入探索肺炎克雷伯菌的耐藥機制，更準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床用藥，從而更好防防治肺炎克雷伯菌引起的乳房炎，降低其危害。