李 婕，曹學(xué)思，楊愛君，陳 欣，陳蓓蕾

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510000

0 引言

黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticu）產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用的小分子代謝產(chǎn)物，它有B1、B2、G1、G2、M1和M2等6 種類型[1]。二呋喃環(huán)和香豆素是基本結(jié)構(gòu)，可溶在如氯仿、乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑中[2，3]。AFM1（黃曲霉毒素M1）較多殘留在動(dòng)物的乳治、腎臟、肝臟和尿液中，以乳中最常見[4]，毒性與AFB1（黃曲霉毒素B1）相似。WHO（世界衛(wèi)生組織）將它列為ⅡB類致癌物[5]。FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）規(guī)定，牛乳中AFM1殘留量有0.5 μg/kg的限量要求，我國也要求牛乳中AFM1含量限值要低于0.5 μg/kg[6]。

目前測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素M1殘留量的方法有：色譜法、免疫化學(xué)法、光電化學(xué)法、光電發(fā)光法及ELISA檢測(cè)法等。在眾多檢驗(yàn)方法中，AFM1殘留量的ELISA檢測(cè)法較便捷，迫切需要將此方法的不確定度具體量化，有助于檢測(cè)人員關(guān)注關(guān)鍵環(huán)節(jié)，使結(jié)果準(zhǔn)確性提高[7]。本文用ELISA檢測(cè)法對(duì)乳粉中AFM1殘留量進(jìn)行檢測(cè)，并量化試驗(yàn)中帶入的不確定度。

1 檢驗(yàn)原理

黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)法的檢測(cè)原理是：試劑盒應(yīng)用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附原理。試劑盒孔洞內(nèi)有AFM1特異抗體，在酶聯(lián)耦合物、樣品、標(biāo)準(zhǔn)品中的AFM1會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與此特異抗體相結(jié)合。在規(guī)定反應(yīng)時(shí)間后，洗液沖洗掉未結(jié)合部分。再加入顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后加入終止液終止該反應(yīng)過程。試驗(yàn)所得孔板通過酶標(biāo)儀測(cè)量吸光光度值。所得吸光光度值結(jié)果錄入計(jì)算機(jī)軟件，得到工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過該曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的AFM1濃度結(jié)果。

2 材料與方法

2.1 儀器和材料

METTLER電子天平；SIGMA離心機(jī)；Thermo酶標(biāo)儀；BRAND單、多道移液器；AHYG恒溫振蕩器；CRYSTAL旋渦振蕩器；Romer Labs AFM1 ELSA檢測(cè)試劑盒。

2.2 試驗(yàn)步驟

2.2.1 試驗(yàn)樣品預(yù)處理

（1）稱取待測(cè)樣乳粉；

（2）稀釋并均勻溶解待測(cè)樣乳粉；

（3）冷藏靜置并離心待測(cè)樣；

（4）取離心上清液與甲醇溶液按4∶1均勻混合，混合液待用。

2.2.2 樣品檢測(cè)

將ELISA檢測(cè)試劑提前復(fù)熱至室溫。

（1）在檢測(cè)用孔杯中加入酶聯(lián)偶合物試劑液；

（2）在上述孔杯內(nèi)依次均勻移入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，并靜置反應(yīng)60 min；

（3）60 min后，用洗劑重復(fù)洗各孔杯5 次，拍干孔杯內(nèi)洗液；

（4）再加入底物顯色液，避光反應(yīng)20 min；

（5）20 min后，加入酸類終止液終止反應(yīng)，制成檢測(cè)微孔板；

（6）用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔吸光光度值并記錄，代入計(jì)算機(jī)軟件得出待測(cè)樣的濃度結(jié)果；

（7）判定結(jié)論：0 ng/kg標(biāo)準(zhǔn)品OD值需＞0.5，否則說明試劑已失效。

使用軟件計(jì)算結(jié)果時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)品曲線的線性相關(guān)系數(shù)（R）需為-0.990～-1.000。

3 結(jié)果計(jì)算數(shù)學(xué)模型

式中：W—待測(cè)乳粉中AFM1含量，單位μg/kg；

C—待測(cè)乳粉樣液中AFM1濃度，單位μg/L；

m—待測(cè)乳粉的稱量重量，單位kg；

f—待測(cè)乳粉樣液的稀釋倍數(shù)，f=10.8。

3.1 試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)用同一萬分之一的電子天平，平行稱取同一質(zhì)控樣乳粉（質(zhì)控樣特性值：0.608 μg/kg，特性值區(qū)間0.385～0.830 μg/kg）6 份。根據(jù)上述試驗(yàn)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，根據(jù)樣品檢測(cè)步驟進(jìn)行樣品檢測(cè)。所得檢驗(yàn)微孔板，經(jīng)同一酶標(biāo)儀平行測(cè)定。在計(jì)算機(jī)運(yùn)算軟件中代入各吸光度值，得到如下試驗(yàn)結(jié)果（表1）。測(cè)定結(jié)果平均值為：0.480 μg/kg。

表1 試驗(yàn)結(jié)果匯總表（n=6）

3.2 試驗(yàn)中不確定度的來源分析

本次試驗(yàn)中，造成結(jié)果不確定度的因素主要有：

（1）重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度，此為A類不確定度。

（2）試驗(yàn)中使用各規(guī)格移液器，因溫度和移液器自身誤差這2 個(gè)因素代入的不確定度，此為B類不確定度。

（3）ELISA試劑盒的試劑穩(wěn)定性及其質(zhì)量造成試劑空白帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（4）酶標(biāo)儀工作性能，如靈敏性、穩(wěn)定性等帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（5）天平稱量試驗(yàn)乳粉時(shí)帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的不確定度，此為B類不確定度。

圖1 試驗(yàn)中不確定度的來源分析

3.3 各項(xiàng)不確定度的量化分析計(jì)算

3.3.1 試驗(yàn)重復(fù)性測(cè)定帶入的不確定度

由表1可知，本次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

3.3.2 移液器容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1） 200 μL移液器的容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，則本次試驗(yàn)中使用200 μL移液器移取100 μL待測(cè)乳粉，由于溫度效應(yīng)，引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1.119 ×10-3/℃是甲醇在20 ℃的膨脹系數(shù)，本試驗(yàn)工作環(huán)境是室溫為20±5 ℃，取矩形分布，則本次試驗(yàn)中使用200 μL移液器移取100 μL甲醇溶液，溫度效應(yīng)引起溶液體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

查詢編號(hào)LE 202200065的移液器計(jì)量證書：可調(diào)移液器20～200 μL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.5%，k=2。本次試驗(yàn)因使用200 μL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（取矩形分布）

使用200 μL移液器移取水溶液樣品時(shí)由（u溫）和（u容）兩項(xiàng)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

使用200 μL移液器移取甲醇溶液時(shí)由（u溫2）和（u容）帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

本試驗(yàn)有3步涉及應(yīng)用200 μL移液器進(jìn)行溶液移取。其中水溶液的移取為2 步：100 μL乳樣的u（溫2）、u（容）在該過程互為獨(dú)立。加樣過程中本次試驗(yàn)因200 μL移液器由這幾個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

200 μL移液器在本次試驗(yàn)帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）1 mL移液器的容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，本次試驗(yàn)中使用1 mL移液器移取400 μL待測(cè)乳樣，溫度效應(yīng)引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

查詢編號(hào)LE 202200066的移液器計(jì)量證書中：可調(diào)移液器0.1～1 mL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.3%，k=2，本次試驗(yàn)因使用1 mL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（取矩形分布）

本試驗(yàn)總共1 步涉及應(yīng)用1 mL單道移液器進(jìn)行溶液移取，u（溫）、u（容）在該過程互為獨(dú)立，加樣過程中本次試驗(yàn)因1 mL移液器由這兩個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定。那么，1 mL移液器在本次試驗(yàn)過程中的使用，由其帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3） 10 mL移液器容量誤差帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本次試驗(yàn)的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，本次試驗(yàn)中使用10 mL移液器移取二級(jí)水，溫度效應(yīng)引起溶劑體積變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

查詢編號(hào)LE 202216773的移液器計(jì)量證書：可調(diào)移液器1～10 mL容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.2%，k=2，本次試驗(yàn)因使用10 mL移液器產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（取矩形分布）

本試驗(yàn)總共1 步涉及應(yīng)用10 mL單道移液器進(jìn)行二級(jí)水移取，u（溫）、u（容）在該過程互為獨(dú)立，加樣過程本次試驗(yàn)因10 mL移液器由這兩個(gè)因素帶進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

10 mL移液器在此次試驗(yàn)帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.3 試劑空白引入的不確定度

黃曲霉毒素M1ELISA檢測(cè)試劑是正規(guī)廠家按照國標(biāo)要求生產(chǎn)的檢驗(yàn)用試劑，因而由試劑空白造成的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（空）在本文中忽略不計(jì)。

3.3.4 由酶標(biāo)儀性能帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本次試驗(yàn)使用同一酶標(biāo)儀對(duì)試驗(yàn)微孔板進(jìn)行樣品測(cè)試，因此，不計(jì)因靈敏度造成的不確定度。查詢書編號(hào)NG 202301468的酶標(biāo)儀計(jì)量證書：酶標(biāo)儀的吸光度示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.012，k=2，本次試驗(yàn)因使用該酶標(biāo)儀所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（根據(jù)矩形分布）

3.3.5 樣品稱量帶進(jìn)的不確定度

試驗(yàn)使用同一臺(tái)萬分之一電子天平，分別稱取6 個(gè)平行的1 g待測(cè)乳粉樣品，因而不計(jì)靈敏度造成的不確定度。查詢證書編號(hào)LJ 202310184的電子天平計(jì)量證書：天平最大秤量示值誤差的測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.08 mg（70 g），k=2。本次試驗(yàn)因使用該電子天平稱量待測(cè)樣乳粉帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（根據(jù)矩形分布）

本次樣品稱量帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的不確定度

根據(jù)上述ELISA黃曲霉毒素M1試劑盒試驗(yàn)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)操作，將檢驗(yàn)操作所得同一孔杯板用同一酶標(biāo)儀進(jìn)行兩次上機(jī)測(cè)量，讀取兩組試劑盒已知濃度標(biāo)樣的對(duì)應(yīng)吸光度A值。并用該組吸光光度值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 工作曲線測(cè)定結(jié)果表

錄入電腦的數(shù)據(jù)處理工作文檔進(jìn)行計(jì)算，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值Log（Conc.）為X軸，Logit（A/A0）值為Y軸。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=2.468 1-1.185 9X，R=-0.998 3。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，待測(cè)樣品奶粉還原稀釋液濃度對(duì)數(shù)平均值：LogX樣=1.663 9，X樣=46.12 ng/L 。得工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

式中：Yi—表2中Logit（A/A0）各數(shù)值；

Xi—表2中Log（Conc.）各值；

a—表2中截距值2.468 1；

b—表2中斜率值-1.185 9；

n=12

計(jì)算本次試驗(yàn)因標(biāo)準(zhǔn)曲線帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：S（曲）：工作曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；

b：表2中斜率，b=-1.185 9；

k：樣品的測(cè)量次數(shù)——2，；

n：標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量總次數(shù)——12；

g0：LogX樣值——1.663 9；

g：表2中Log（Conc.）的平均值；

gi：表2中Log（Conc.）各值。

可得：

可得：本次試驗(yàn)中工作（表3）曲線帶進(jìn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表3 各項(xiàng)不確定度匯總

4 各項(xiàng)不確定度結(jié)果對(duì)比分析

各項(xiàng)不確定度見表3。對(duì)本次乳粉中黃曲霉毒素M1殘留量ELISA法測(cè)定結(jié)果的不確定度影響較大的是由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述各項(xiàng)不確定度量化計(jì)算結(jié)果合并，本次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其中0.480 μg/kg是上述本次試驗(yàn)實(shí)測(cè)樣品AFM1含量平均值。

4.2 擴(kuò)展不確定度

測(cè)定結(jié)果符合正態(tài)分布，按照置信水平95%，包含因子k=2，本次試驗(yàn)乳粉樣品中黃曲霉毒素M1測(cè)定的擴(kuò)展不確定度：

5 結(jié)論

本文試驗(yàn)采用ELISA法測(cè)定乳粉樣品中黃曲霉M1含量結(jié)果應(yīng)表示為0.480±0.023 μg/kg，k=2。其中對(duì)不確定度影響較大的因素是由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。將來檢驗(yàn)工作中，可酌情增加加標(biāo)樣或質(zhì)控樣測(cè)試次數(shù)，以減少其不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來影響。