王朕 劉光輝 王洋

[關(guān)鍵詞]滌痰湯；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；冠心??；分子對(duì)接；作用機(jī)制

冠心病（coronaryheartdisease，CHD）是一種缺血性心肌病，CHD可引起管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死。CHD中醫(yī)又稱“胸痹心痛”，出自《靈樞·經(jīng)脈》，由多種原因引起瘀血、寒凝、痰濁、氣滯痹阻心脈。痰濁是氣機(jī)失調(diào)或血行不暢引發(fā)的病理產(chǎn)物，近現(xiàn)代醫(yī)家多從痰濁辨證治療胸痹心痛，楊關(guān)林教授團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果表明，痰濁貫穿于胸痹心痛的整個(gè)病程[1]。滌痰湯出自明代董宿《奇效良方》卷一，具有補(bǔ)虛豁痰，清熱利氣之功，善于治療動(dòng)脈粥樣硬化痰濁瘀阻證?，F(xiàn)代研究證實(shí)滌痰湯治療CHD穩(wěn)定型心絞痛具有顯著臨床效果[2]。滌痰湯關(guān)于CHD的治療研究已經(jīng)進(jìn)入分子水平[3]，但缺少基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析滌痰湯治療CHD作用機(jī)制的研究。本研究通過(guò)篩選交集靶點(diǎn)，進(jìn)行富集分析、分子對(duì)接技術(shù)，將前期預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，探討滌痰湯治療CHD的生物分子作用機(jī)制，為今后學(xué)者使用該方治療CHD及相關(guān)疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 滌痰湯藥物活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[4]檢索滌痰湯9種中藥的化學(xué)活性成分，根據(jù)類藥性（DL）≥0.18，口服利用度（OB）≥30%篩選獲得中藥活性化合物。在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將其轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 差異基因（DEGs）的篩選與處理

從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得編號(hào)GSE71226基因芯片的原始數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的GPL基因注釋文件，使用在線分析工具GEO2R篩選出CHD和正常人的差異基因。導(dǎo)入在線繪圖平臺(tái)，以表達(dá)差異檢驗(yàn)P<0.05、表達(dá)倍數(shù)（FC）絕對(duì)值>2為條件，導(dǎo)出差異基因并繪制熱圖及火山圖。

1.3 CAD相關(guān)靶點(diǎn)獲取及維恩圖的繪制

以“coronaryheartdisease”為關(guān)鍵詞，在Drugbank、OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選取并集，獲得本研究使用CHD疾病靶點(diǎn)繪制維恩圖。

1.4 滌痰湯成分-CHD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將1.3獲得疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集，得到CHD-滌痰湯有效成分交集靶點(diǎn)。使用Cytoscape3.8.2軟件得到“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（geneontology，GO）功能富集分析

使用metascape和David數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種信息為人，導(dǎo)出富集通路信息，進(jìn)行可視化富集分析。

1.6 基因組百科全書（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析

通過(guò)metascape和David數(shù)據(jù)庫(kù)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。繪制氣泡圖發(fā)掘CHD治療中滌痰湯作用機(jī)制。

1.7 滌痰湯處方組成-活性成分-CHD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將KEGG通路富集結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，獲得“活性成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)判斷核心靶點(diǎn)前10位及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

以1.7所作圖中度值較大的有效成分和兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖靶點(diǎn)度值排名前10位交集的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白為研究對(duì)象進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 滌痰湯活性成分的篩選

通過(guò)篩選共得到滌痰湯中有效活性化合物73個(gè)，其中人參10個(gè)、甘草20個(gè)、橘紅5個(gè)、茯苓3個(gè)、膽星5個(gè)、竹茹6個(gè)、枳實(shí)12個(gè)、菖蒲4個(gè)、半夏8個(gè)。

2.2 DEGs的篩選與處理

GSE71226共含基因45119個(gè)。log2FC>0為上調(diào)基因，反之為下調(diào)基因，繪制火山圖，見(jiàn)圖1。以FC絕對(duì)值>2、P<0.05為條件篩選到正常組和CHD組差異基因3473個(gè)，選擇幅度最大的前18位基因繪制聚類熱圖，見(jiàn)圖2。

2.3 滌痰湯治療CHD的潛在作用靶點(diǎn)及文氏圖的繪制

去重得到4511個(gè)CHD疾病基因，見(jiàn)圖3。把交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“人”，得到疾病藥物共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。節(jié)點(diǎn)度值通過(guò)文字大小節(jié)點(diǎn)面積來(lái)表示，度值越高的節(jié)點(diǎn)的面積越大，其中AKT1、RELA和HSP90AA1可能是滌痰湯治療CHD重要靶點(diǎn)。

2.4 藥物-成分-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

滌痰湯治療CHD的“中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5。網(wǎng)絡(luò)中所有成分均對(duì)應(yīng)2個(gè)以上靶點(diǎn)，說(shuō)明滌痰湯發(fā)揮作用是“多成分、多靶點(diǎn)”共同的結(jié)果，符合我國(guó)中醫(yī)藥辨證、辨病、辨癥相結(jié)合治療疾病的特點(diǎn)。研究方劑滌痰湯的核心成分，按度值進(jìn)行排序，前3位為去山柰酚（度值=125）、β-谷甾醇（度值=95）、柚皮素（度值=93），見(jiàn)表1。

2.5 GO富集分析

得到GO-BP（生物過(guò)程）富集結(jié)果361條、GO-CC（細(xì)胞成分）富集結(jié)果44條、GO-MF（分子功能）富集結(jié)果66條。于BP、MF、CC中分別選出FDR值最小的10條通路，繪制富集條形圖，見(jiàn)圖6。

2.6 KEGG富集分析

得到KEGG富集結(jié)果163條。于BP、MF、CC中分別選出FDR值最小的15條通路。如圖可知，CHD疾病病機(jī)是多通路共同作用的結(jié)果，KEGG主要涉及脂質(zhì)與CHD、白介素17和TNF信號(hào)通路等，見(jiàn)圖7。

2.7 滌痰湯處方組成-活性成分-CHD靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

分析KEGG結(jié)果，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。找出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和有效成分，根據(jù)度值、介度及緊密度大于閾值篩選。獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)47個(gè)，見(jiàn)表2。可視性優(yōu)化（圖8）。找出藥效作用的主要成分及核心靶點(diǎn)。結(jié)果顯示主要成分為豆甾醇、β-谷甾醇、柚皮素、山柰酚、谷甾醇和槲皮素等。核心靶點(diǎn)前10個(gè)為：RELA（16）、AKT1（15）、JUN（15）、CASP3（14）、MAPK1（12）、MAPK3（12）、HSP90AA1（12）、pTGS2（12）、pRKCA（11）、MAPK14（10）。與PPI網(wǎng)絡(luò)的前10個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)比，有6個(gè)共同靶點(diǎn)。此網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了滌痰湯通過(guò)多靶點(diǎn)、多成分、多通路的方式干預(yù)CHD的特點(diǎn)。

2.8 分子對(duì)接驗(yàn)證

分子對(duì)接兩者之間有一定的結(jié)合活性，則結(jié)合能≤-4.25kcal/mol；若結(jié)合活性較好，則結(jié)合能≤-5.0kcal/mol；若兩者之間有強(qiáng)的結(jié)合活性，則結(jié)合能≤-7.0kcal/mol[5]。選取篩選得到的核心成分分別與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，計(jì)算其對(duì)接分?jǐn)?shù)（表3），由表可見(jiàn)，其中100%的活性成分與其蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性，大部分有強(qiáng)的結(jié)合活性，而β-谷甾醇與MAPK3的對(duì)接分?jǐn)?shù)最高，為-10.2。

3 討論

3.1 CHD成因與滌痰湯治療CHD理論依據(jù)

心血管疾病發(fā)病率逐年上升，截至2017年，我國(guó)心血管疾病患者數(shù)量高達(dá)2.9億人[6]。濁、毒、痰、瘀等邪氣通過(guò)血液的流通對(duì)脈道產(chǎn)生影響，脈道變厚，血流速度變緩，血管異常收縮，形成血栓或粥樣斑塊[7]。有學(xué)者治療胸痹心痛時(shí)多從調(diào)理水谷之海入手，運(yùn)用祛瘀、行氣、化痰、健脾等治法[8]。滌痰湯由二陳湯化裁而成，具有祛痰化瘀的功效，相關(guān)研究認(rèn)為，滌痰湯能緩解CHD（痰濁瘀阻證）患者臨床表現(xiàn)，減少血液粥樣斑塊，使血液流變學(xué)指標(biāo)改善[9]。對(duì)治療不穩(wěn)定型心絞痛痰濁瘀阻型CHD，滌痰湯可在一定程度上提高臨床預(yù)后，緩解胸痛、胸悶、心悸等癥狀[10]。

3.2 滌痰湯以“β-谷甾醇”等為主要活性成分治療CHD

臨床中，滌痰湯常用于急性心梗和不穩(wěn)定型心絞痛痰濁瘀阻證等疾病，方中橘紅理氣寬中，半夏燥濕化痰。相關(guān)活性成分β-谷甾醇能發(fā)揮保護(hù)缺血再灌注損傷心肌的作用[11]。竹茹化痰止嘔，枳實(shí)破氣行痰，膽南星清熱化痰，主要成分柚皮苷通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路減少脂質(zhì)條紋增殖以及血管平滑肌細(xì)胞遷移[12]。炙甘草調(diào)和諸藥，槲皮素是人參、甘草、竹茹等中藥的主要成分之一，具有保護(hù)內(nèi)皮、擴(kuò)張血管、降脂等內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的作用[13]。因此滌痰湯可能通過(guò)以上藥物活性成分，發(fā)揮調(diào)節(jié)膽固醇、保護(hù)心肌、降糖、調(diào)脂、抑制心肌細(xì)胞凋亡等作用。

3.3 滌痰湯以“MAPK1”等核心靶基因治療CHD

MAPK系列在CHD的發(fā)展、心肌細(xì)胞凋亡和增殖及血管內(nèi)皮細(xì)胞新生中具有重要的組織學(xué)作用。MAPK1和MAPK3是重要多通路功能蛋白，與心肌纖維化發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)系。RELA是NF-κB家族中最常見(jiàn)的成員，有研究表明，RELA（p65）可以通過(guò)調(diào)控人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制減緩CHD的病理進(jìn)展[14]。AKT信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)中控制著多種細(xì)胞功能。通過(guò)Ap-1、c-JUN與Fank1、Jab1共同作用，上調(diào)下游基因Bcl-2的表達(dá)，起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[15]。以上靶點(diǎn)與緩解動(dòng)脈粥樣硬化和心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)動(dòng)脈重構(gòu)密不可分，提示滌痰湯可能通過(guò)增強(qiáng)或抑制相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)來(lái)治療CHD。

3.4 滌痰湯治療CHD各分類疾病涉及的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路

WHO將CHD分為5大類，其中心力衰竭是由于心臟收縮或舒張功能障礙，心臟射血不能滿足機(jī)體的需要，TNF通路通過(guò)激活CASP3對(duì)凋亡因子起到抑制作用和抗凋亡因子的激活作用[16]。心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。PI3K-AKT通路通過(guò)調(diào)節(jié)NOS3的表達(dá)，調(diào)控JNK和p38，上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax的表達(dá)，從而達(dá)到抗凋亡的目的。綜上，對(duì)于CHD多種分型，以上靶點(diǎn)與通路分別通過(guò)調(diào)節(jié)抗炎和抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化因子等機(jī)制，發(fā)揮緩解和治療的作用。

4 小結(jié)

本研究證實(shí)了滌痰湯多靶點(diǎn)、多成分、多通路的中藥藥物作用機(jī)制。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)的局限性，后期可圍繞藥效學(xué)評(píng)價(jià)-物質(zhì)基礎(chǔ)代謝組學(xué)-通路驗(yàn)證等開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，為滌痰湯治療CHD以及藥物開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。