長鏈非編碼RNA Linc00645在腦膠質瘤中的表達及其功能研究

王宇杰 李晨龍 鄭宏山 劉清 艾思奇 王英杰 肖旭 蘇天崎 付天嬌 梁鵬

【摘要】 目的 研究長鏈非編碼RNA Linc00645在腦膠質瘤組織中的表達水平及其對膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響，并探究其可能的作用機制。方法 分析癌癥基因組圖譜（TCGA-GBM）數據庫和中國腦膠質瘤基因組計劃（CGGA）數據庫中，Linc00645在正常腦組織和膠質瘤組織中的表達情況，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）在人正常星形膠質細胞株和5種膠質瘤細胞株中檢測Linc00645的表達水平。敲低Linc00645表達后，應用細胞增殖實驗（MTT）檢測膠質瘤細胞的增殖能力，應用劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。應用Western Blot實驗在蛋白水平上驗證敲低Linc00645的表達對膠質瘤細胞侵襲和遷移相關蛋白的影響。結果 Linc00645在腦膠質瘤中的表達水平明顯高于正常腦（P<0.05），并且Linc00645的表達水平隨著膠質瘤病理等級的升高而升高（P<0.05）。Linc00645高表達組的患者，總體生存期明顯縮短，預后較差（P<0.05）。抑制Linc00645的表達后膠質瘤細胞的增殖、侵襲以及遷移能力均明顯下降?；虮磉_相關性（Pearson）分析顯示上皮-間質樣轉化（EMT-like）相關標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin），波形蛋白（Vimentin）和鋅指E-盒結合同源異形盒因子（ZEB1）與Linc00645表達呈正相關性，而E-鈣黏蛋白（E-cadherin）與Linc00645表達呈負相關性（P<0.05）。敲低Linc00645的表達后細胞中的E-cadherin表達水平升高，而N-cadherin、Vimentin和ZEB1表達水平明顯降低。結論 長鏈非編碼RNA Linc00645在膠質瘤組織中高表達，并且其表達水平與腫瘤的惡性程度密切相關。Linc00645可能通過升高N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表達水平從而提高膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。Linc00645可能作為膠質瘤早期診斷和治療的新靶點。

【關鍵詞】 神經膠質瘤；長鏈非編碼RNA；侵襲；上皮-間質樣轉化

【中圖分類號】 R739.41 【文獻標志碼】 A 【文章編號】 1672-7770（2023）02-0146-07

Abstract： Objective To investigate the expression of long non-coding RNA Linc00645 in glioma tissues and its effect on the proliferation， invasion and migration of glioma cells， and to explore its possible mechanisms. Methods The expression of Linc00645 in normal brain tissues and glioma tissues in The Cancer Genome Atlas（TCGA-GBM） database and the Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA） database were analyzed， and quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction（qRT-PCR） was used to verify the expression in Normal Human Astrocyte and 5 glioma cell lines. After knocking down the expression of Linc00645， MTT assay was used to detect the proliferation capacity of the glioma cells， and the wound healing assay and the Transwell assay were conducted to evaluate the migration and invasion ability of the cells. Western Blot was performed to verify the effect of Linc00645 knockdown on the invasion and migration-related proteins of glioma cells at the protein level. Results The expression of Linc00645 in glioma tissues was significantly higher than that in normal brain tissues（P<0.05）， and the expression of Linc00645 increased along with the advance of the pathological grade of glioma（P<0.05）. In the Linc00645 high ?expression group， the overall survival period was significantly shorter and the prognosis was worse（P<0.05）. After inhibiting the expression of Linc00645， the proliferation， invasion and migration ability of glioma cells were significantly reduced. The Pearson correlation analysis showed that EMT-like related markers N-cadherin， Vimentin and zinc finger E-box binding homeobox 1（ZEB1） were positively correlated with Linc00645， while E-cadherin was negatively correlated with Linc00645（P<0.05）. The expression of E-cadherin increased， while the expression of N-cadherin， Vimentin and ZEB1 significantly decreased after knocking down the expression Linc00645. ConclusionsLong non-coding RNA Linc00645 is highly expressed in glioma tissues， and its expression is closely related to the malignancy of the tumor. Linc00645 could increase the expression of N-cadherin， Vimentin and ZEB1 to enhance the invasion and migration ability of glioma cells. Therefore， Linc00645 may serve as a new target for early diagnosis and treatment of glioma.

Key words： glioma; long non-coding RNA； invasion； epithelial-mesenchymal transition-like

基金項目：黑龍江省自然科學基金資助項目（LH2021H080）

作者單位：150001 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院神經外科

通信作者：梁鵬

在過去的幾十年中，神經膠質瘤已成為中國乃至全球中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤相關死亡的主要原因［1］。盡管在診斷和治療方面取得了很多進展，但神經膠質瘤患者的預后仍然很差，中位總生存期為12～14個月。膠質瘤的發(fā)病率不斷上升且病死率很高，因此迫切需要闡明其發(fā)展的病理機制。眾所周知，膠質瘤發(fā)生的過程很復雜，涉及很多基因突變和生物過程的多個步驟［2-4］。上皮間質轉化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）是促進腫瘤侵襲和遷移過程的重要機制［5］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類 RNA 轉錄物，長度大于200個核苷酸，沒有編碼蛋白質的功能［6］。LncRNAs以前被認為是轉錄噪聲，然而現已發(fā)現它們在一系列生物學過程中起著關鍵作用，如表觀遺傳調控，組蛋白修飾，轉錄控制和RNA代謝等過程［7］。長鏈非編碼RNA 00645（Linc00645）位于人類14號染色體上，已在子宮內膜癌中被證實有表達異常并發(fā)揮重要作用［8］，然而Linc00645在膠質瘤中的作用尚不清楚。本研究檢測了Linc00645在腦膠質瘤組織中的表達水平，隨后檢測敲低Linc00645的表達對膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力及相關標志物的影響，明確Linc00645在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為神經膠質瘤的治療提供一種新的策略。

1 資料與方法

1.1 數據庫樣本數據收集 自癌癥基因組圖譜數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http：//cancergenome.nih.gov）下載164例樣本數據，其中包含159例Ⅳ級膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）組織樣本和5例正常腦組織樣本。自中國腦膠質瘤基因圖譜數據庫（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）（www.cgga.org）下載262例膠質瘤患者樣本，其中包含世界衛(wèi)生組織（WHO）Ⅰ-Ⅱ級96例，Ⅲ級52例，Ⅳ級114例。樣本數據用于正常腦組織和膠質瘤組織中Linc00645表達情況的分析。

1.2 生存分析方法 從TCGA和CGGA數據庫中下載GBM患者的生存期數據，對Linc00645和GBM患者生存期進行相關性分析，通過Graphpad軟件采用Kaplan-Meier 法繪制患者生存期曲線，并進行Log-rank檢驗，以P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.3 與Linc00645相關的功能分析 使用基因本體論（gene ontology，GO）分析對Linc00645的生物學功能進行預測。通過Starbase V2.0數據庫對Linc00645進行靶基因預測并根據相關性選取前50個基因作為靶基因，后通過功能注釋生物信息數據庫（The Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/）對Linc00645進行基因功能注釋，探索與Linc00645相關性最高的生物學功能注釋，收集差異倍數為Fold change>2且錯誤發(fā)現率False discovery rate<0.01為有意義注釋。

1.4 主要材料和試劑 所有細胞株均采用含10%胎牛血清、0.2%雙抗（50 U/mL青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞均培養(yǎng)在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司，青霉素-鏈霉素溶液（100×）購自上海碧云天生物技術有限公司。RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒均購自瑞士Roche公司。Transwell小室（預鋪基質膠）購自美國Corning公司。蘇木素-伊紅試劑盒和MTT細胞增殖檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。載Linc00645的siRNA所用商品化質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法 按照Trizol說明書提取膠質瘤細胞系中的總RNA，應用NanoDrop檢測RNA濃度。Linc00645的正向引物序列為5′- CAGAGGTGGTGCCTTGACA-3′，反向引物序列為5′- ATATCCTCTGTGGCCCATGC -3′，GAPDH作為內參基因，其正向引物序列為5′- CACCCACTCCTCCACCTTTG -3′，反向引物序列為5′- CCACCACCCTGTTGCTGTAG -3′。以總RNA為模板，逆轉錄得到cDNA，然后加入引物使用SYBR Green qPCR分析法進行qRT-PCR實驗，反應結束后使用ABI Prism7900HT PCR儀自帶分析軟件，導入原始數據，獲得相應的CT值、ΔCt值，并以2-ΔΔCt值（Ct：循環(huán)閾值）算法分析qRT-PCR結果，得到目的基因的相對表達量。

1.6 細胞培養(yǎng)方法 所有細胞株均采用含10%胎牛血清、0.2%雙抗（50 U/mL 青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞均培養(yǎng)在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。在光學顯微鏡下觀察并記錄細胞貼壁情況，2～3 d更換完全培養(yǎng)基一次，換液時棄掉培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加入預染的PBS液（pH=7.4）3 mL漂洗1次，隨后加入5 mL預熱完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 實驗分組 結果1分組：（1）正常組和GBM組（圖1A）；（2）Ⅰ-Ⅱ級組，Ⅲ級組和Ⅳ級組（圖1B）；（3）人正常星形膠質細胞株（NHA）組和膠質瘤細胞株（U251、LN229、T98G、A172、SHG44）組（圖1C）。結果2分組：（1）TCGA中Linc00645低表達組（n=78）和高表達組（n=81）（圖2A）；（2）CGGA中Linc00645低表達組（n=121）和高表達組（n=141）（圖2B）。結果3分組：（1）U251細胞株和T98G細胞株中si-NC組和si-Linc 1#組、si-Linc 2#組、si-Linc 3#組（圖3A）；（2）U251細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖3B）；（3）T98G細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖3C）。結果4分組：（1）U251細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖4A，4C-4E）；（2）T98G細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖4B-4E）。結果5分組：（1）U251細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖5E，5F）；（2）T98G細胞株中si-NC組和si-Linc00645組（圖5E，5G）。

1.8 細胞轉染 轉染前一天，將5×105貼壁細胞鋪到6孔板中。當細胞融合度達到60%～70%時用于進行后續(xù)實驗。準備無RNase EP管，將EP管A：Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL+目的基因質粒4 μL（100 pmol）和B：Opti-MEM培養(yǎng)基250 μL+Lipofectamine 2000 5 μL混合后靜置20 min，加入6 孔板中培養(yǎng)4 h。更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后收集細胞。

1.9 細胞增殖實驗 利用北京碧云天公司生產的MTT細胞增殖檢測試劑盒進行細胞增殖實驗。根據說明書，在15 mL離心管中使用5 mL的MTT溶劑混勻溶解25 mg MTT粉，分裝后置于-20 ℃避光保存。將2×103/孔貼壁細胞鋪到加入了100 μL培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)過夜。每孔加入10 μL MTT溶液后繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，輕輕混勻后繼續(xù)孵育10 min，在光學顯微鏡下觀察結晶紫的溶解程度。取出培養(yǎng)板后，使用酶標儀檢測570 nm處的吸光度，導出數據，根據存活率計算公式得到相應數值，繪制增殖曲線。

1.10 細胞劃痕實驗 細胞劃痕實驗是用來檢測細胞遷移運動和修復能力的方法。實驗前所有工具進行高壓滅菌，直尺和信號筆置于超凈臺中紫外照射30 min。使用信號筆在無菌6孔板背后每隔0.5 cm畫一條橫穿過孔直線。實驗前一天加入5×105細胞鋪板，培養(yǎng)過夜。實驗時用槍頭沿著直尺劃過細胞方向與孔板背面畫線相垂直，槍頭垂直劃過貼壁細胞。使用PBS液洗掉脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0 h、24 h取樣拍照。使用Image J軟件分析細胞修復面積，進行統(tǒng)計學分析。

1.11 Transwell侵襲實驗 利用美國Corning公司生產的商品化的預包被基質膠Transwell小室進行Transwell侵襲實驗。使用時提前取出小室，在上室加入300 μL無血清培養(yǎng)基，在室溫下靜置30 min水化基質膠，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，小室內部為上室，培養(yǎng)板底部為下室。使用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液。上層小室加入300 μL細胞懸液，下層小室加入500 μL含20%的FBS培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，對小室內側使用蒸餾水輕輕沖洗，使用棉簽擦去內層基質膠和上室內細胞。將小室置入含有4%多聚甲醛的孔板內，固定細胞10 min。使用HE染色液染色標記細胞，晾干后翻轉小室在顯微鏡下計數并拍照。

1.12 Western Blot方法 收集細胞，使用RIPA裂解液方法提取總蛋白。使用NanoDrop分光光度計法測定提取蛋白濃度，通過檢測純凈的蛋白在280 nm處的吸光值，直接定量蛋白濃度和純度，上樣量為200 μg/孔。使用Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)進行蛋白電泳，然后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），使用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，再使用TBST稀釋目的一抗，將PVDF膜浸于一抗中，4 ℃孵育過夜。隨后用TBST漂洗移除一抗，再將PVDF膜浸于相應二抗中，室溫下在搖床上孵育1 h，TBST漂洗。采用ECL化學發(fā)光顯色法，顯影前以配置1∶1比例配置發(fā)光液A液和B液，充分混勻，將PVDF浸潤于顯色液中，將PVDF膜放置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)平臺中，使用Biorad Image Lab軟件分析目的蛋白的相對灰度值。

1.13 統(tǒng)計學分析 所有數據均采用SPSS v.19.0或者GraphPad Prism v.5.0進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用c2檢驗及Fisher確切概率法，生存期采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗，基因表達的相關性分析采用Pearson法，以P<0.05認為有顯著的統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Linc00645在腦膠質瘤中的表達與生物學功能分析結果 對癌癥基因組圖譜（TCGA-GBM）數據庫中所采集樣本的表達數據分析顯示，Linc00645在膠質瘤中的表達水平明顯高于正常腦組織（P<0.05）（圖1A）。對CGGA 數據庫中所采集樣本的mRNA表達數據分析顯示，Linc00645的表達水平隨著膠質瘤病理等級的升高而升高（P<0.05）（圖1B）。提示Linc00645在正常腦組織和膠質瘤組織中存在差異表達性，且表達量與膠質瘤的惡性程度呈正相關（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。對人正常星形膠質細胞株NHA和膠質瘤細胞株U251、LN229、T98G、A172、SHG44采用qRT-PCR檢測Linc00645的相對表達水平，結果顯示Linc00645在膠質瘤細胞株中的表達水平顯著高于正常星形膠質細胞株NHA（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義（圖1C）。以上結果提示，Linc00645在膠質瘤中的表達明顯上調。對Linc00645進行GO富集分析，首先利用Starbase V2.0數據庫對Linc00645進行靶基因預測，根據相關性選取前50個基因作為靶基因，使用DAVID數據庫進行了GO功能注釋，結果顯示Linc00645主要功能匯聚在金屬鈦酶活性，間質化遷移，金屬離子結合位點，細胞基質黏附等相關分子功能（圖1D）。

2.2 Linc00645表達量與腦膠質瘤患者生存期的關系 在TCGA和CGGA數據庫中下載GBM患者的臨床數據，以Linc00645表達中位數將患者分為高表達組（High expression）和低表達組（Low expression）并對其進行Kaplan-Meier生存分析，結果顯示Linc00645高表達組的患者，總體生存期明顯縮短，預后較差（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義，提示膠質瘤中Linc00645高表達與患者預后呈負相關（圖2）。

2.3 敲低Linc00645的表達對膠質瘤細胞增殖活性的影響 3組siRNA序列中，si-Linc00645 1#組（si-Linc 1#）敲減效率最明顯，故選擇用來進行后續(xù)實驗（圖3A）。細胞增殖實驗結果顯示，U251和T98G細胞株在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后si-Linc00645組的增殖能力低于si-NC組（圖3B，圖3C），這表明Linc00645的表達下調可抑制膠質瘤細胞的增殖能力。

2.4 敲低Linc00645的表達對膠質瘤細胞侵襲和遷移能力的影響 劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結果顯示，U251和T98G細胞株在培養(yǎng)24 h后si-Linc00645組膠質瘤細胞的愈合能力和穿過小室的細胞數量均顯著低于si-NC組（圖4），這表明Linc00645在體外對膠質瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用，Linc00645的表達下調可抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。

2.5 敲低Linc00645的表達對膠質瘤細胞EMT過程的影響 共表達基因相關性分析顯示EMT相關標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin），波形蛋白（Vimentin）和鋅指E-盒結合同源異形盒因子（zincfinger E-box binding homeobox 1，ZEB1）與Linc00645表達呈正相關性，E-鈣黏蛋白（E-cadherin）與Linc00645表達呈負相關性（P<0.05）（圖5A-D），差異具有統(tǒng)計學意義。Western Blot實驗結果表明，U251和T98G細胞株在培養(yǎng)48 h后，si-Linc00645組中E-cadherin表達水平高于si-NC組，而si-Linc00645組中N-cadherin、Vimentin和ZEB1表達水平低于si-NC組，抑制了膠質瘤細胞的EMT過程（圖5E-G）。以上結果提示，Linc00645的表達與膠質瘤中EMT過程存在密切相關性。

3 討 論

LncRNA的功能主要根據其在細胞內特定的分布區(qū)域，在細胞質或細胞核中通過各自的序列特殊性結合mRNA、miRNA及相關功能蛋白發(fā)揮功能，包括DNA甲基化，對mRNA穩(wěn)定性的維持，通過“分子海綿”吸附miRNA，以及通過結合轉錄蛋白發(fā)揮轉錄調控的功能。越來越多的研究顯示，LncRNA在腫瘤的惡性生物學行為，神經系統(tǒng)發(fā)育和放化療 ?抵抗過程中發(fā)揮著重要作用。多種LncRNA被認為是腫瘤進展的關鍵調節(jié)因子［9-12］。

EMT指的是上皮細胞在一些因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移的能力，變成具備間質細胞形態(tài)和特性的細胞的改變。由于膠質瘤細胞來源于膠質細胞，從神經上皮細胞發(fā)育而來，因此很多特征不同于經典上皮細胞，但是膠質瘤同樣具有高度可塑性，稱為EMT樣（EMT-like）過程［13-14］，調節(jié)GBM的侵襲遷移過程。近年來，許多研究報道了EMT或EMT-like機制參與其他非上皮性腫瘤的惡性進程［15-16］。最近定義的GBM的間充質亞型提示在惡性腦腫瘤中，類EMT過程也具有臨床重要性。

既往研究顯示，LncRNA H19，CCAT2和HOTTIP與膠質瘤的EMT和患者預后不良有關［17-19］。 研究者最先發(fā)現Linc00645在子宮內膜癌中存在差異表達，可以作為腫瘤的生物學標志物。據研究報道在對TCGA數據進行WGCNA分析時發(fā)現Linc00645在膠質瘤中可能呈高表達狀態(tài)，并與惡性生存期存在相關性［20］。鑒于Linc00645對膠質瘤細胞的生物學功能可能存在調控作用，本研究進一步探討潛在的調控機制。首先通過生物信息學的方法，在CGGA膠質瘤樣本數據中發(fā)現，這些EMT相關標志物的表達水平均與Linc00645呈密切相關。隨后通過Western Blot實驗，發(fā)現Linc00645的表達被抑制后，膠質瘤細胞內 N-cadherin，Vimentin和ZEB1蛋白的表達水平也顯著下降。

綜上所述，本研究發(fā)現，Linc00645的表達水平在膠質瘤組織中上調，并與腫瘤的惡性程度密切相關，上調的Linc00645預示膠質瘤患者的總體生存期較差。Linc00645可能通過調控EMT-like相關標志物N-cadherin，Vimentin和ZEB1蛋白的表達促進膠質瘤細胞的EMT進程，從而促進膠質瘤的增殖、侵襲和遷移能力。至于Linc00645的表達為何在膠質瘤中上調，仍需對其上游調控因子進行進一步的研究來探索。而Linc00645通過何種機制影響這些蛋白的表達，本研究猜測Linc00645可能作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）靶向結合miRNA，進而調控下游靶基因，從而調控膠質瘤細胞EMT樣轉化過程。這些結果將增進我們對癌癥發(fā)展?jié)撛跈C制的理解，并可能為人類膠質瘤的治療提供潛在的新策略。

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（收稿2022-04-14 修回2022-08-03）