趙志遠 趙睿 劉文豪 孫成建 徐銳

［摘要］ 目的 研究CMS121對氧糖剝奪再灌注（OGD/R）神經(jīng)元及缺血再灌注（I/R）模型小鼠腦神經(jīng)損傷的保護作用及其機制。方法 將皮質(zhì)神經(jīng)元分為對照組、OGD/R組和OGD/R+CMS121組，分別進行正常培養(yǎng)、OGD/R處理和OGD/R+CMS121治療處理。24 h后，檢測3組神經(jīng)元的細胞活力和乳酸脫氫酶（LDH）釋放水平。通過蛋白免疫印跡實驗分析3組神經(jīng)元再灌注6、24 h蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）的表達。將C57BL/6J小鼠隨機分為Sham組、I/R組和I/R+CMS121組，分別進行假手術(shù)、I/R模型構(gòu)建和I/R模型構(gòu)建+CMS121處理，再灌注24 h后，通過神經(jīng)嚴重度評分（NSS）評估小鼠神經(jīng)系統(tǒng)受損情況，通過TTC染色計算小鼠的腦梗死體積占全腦體積的比例。結(jié)果 3組神經(jīng)元的細胞活力和LDH釋放水平比較差異有顯著性（F=71.21、88.93，P＜0.01）；與OGD/R組相比，OGD/R+CMS121組的神經(jīng)元細胞活力升高，LDH釋放水平下降（t=5.56，11.63，P＜0.05）。時間、分組、時間與分組交互作用對神經(jīng)元p-Akt表達有明顯影響（F=13.48～32.67，P＜0.01），對Akt的表達均無影響（P＞0.05）。再灌注6 h，3組神經(jīng)元p-Akt表達比較差異均有顯著性（F=18.78，P＜0.01），與對照組比較，OGD/R組和OGD/R+CMS121組神經(jīng)元p-Akt表達均升高（P＜0.01），且后兩組間比較差異無顯著性（P＞0.05）；再灌注24 h，3組神經(jīng)元p-Akt表達差異有顯著性（F=38.50，P＜0.01），OGD/R+CMS121組神經(jīng)元p-Akt表達較對照組和OGD/R組相比均升高（P＜0.01），而OGD/R組和對照組間比較差異無顯著性（P＞0.05）。3組小鼠NSS和腦梗死體積占全腦體積比例比較差異有顯著性（F=20.24、118.60，P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+CMS121組小鼠NSS降低，腦梗死體積減?。≒＜0.05）。結(jié)論 CMS121對OGD/R處理的神經(jīng)元和I/R模型小鼠的腦神經(jīng)損傷有保護作用，這種保護作用可能是通過上調(diào)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Akt磷酸化水平實現(xiàn)的。

［關(guān)鍵詞］ 顱神經(jīng)損傷；細胞低氧；葡萄糖；再灌注損傷；神經(jīng)元；神經(jīng)保護；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號］ R745.1；R338? ? ［文獻標(biāo)志碼］ A

［ABSTRACT］ Objective? To investigate the neuroprotective effects and mechanism of CMS121 in a neuron model of oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） and a mouse model of ischemia/reperfusion （I/R）.? Methods Cortical neurons were divided into control group （normal culture）， OGD/R group （OGD/R model construction）， and OGD/R+CMS121 group （OGD/R model construction plus treatment with CMS121）. All neurons viability and lactate dehydrogenase （LDH） release were assessed after 24 h of reperfusion. Western blotting was performed to measure the expression of protein kinase B （Akt） and phosphorylated Akt （p-Akt） in the neurons after 6 and 24 h of reperfusion. C57BL/6J mice were randomly divided into sham group （sham operation）， I/R group （I/R model construction）， and I/R+CMS121 group （I/R model construction plus treatment with CMS121）. After 24 h of reperfusion， we assessed the neurological damage of the mice with the Neurological Severity Score （NSS）， and calculated the brain infarct volume （as a percent of total brain volume） after 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride staining. Results There were significant differences in cell viability and LDH release between the three neuron groups （F=71.21，88.93，P<0.01）. Compared with the OGD/R group， the OGD/R+CMS121 group showed significantly increased neuronal viability and significantly reduced LDH release （t=5.56，11.63，P<0.05）. Time， group， and time × group interaction significantly affected neuronal p-Akt expression （F=13.48-32.67，P<0.01）， and showed no significant effects on Akt expression （P>0.05）. After 6 h reperfusion， a significant difference was observed in neuronal p-Akt expression between the three neuron groups （F=18.78，P<0.01）. Neuronal p-Akt expression was significantly increased in the OGD/R and OGD/R+CMS121 groups than in the control group （P<0.01）， and showed no significant difference between the OGD/R and OGD/R+CMS121 groups （P>0.05）. After 24 h reperfusion， p-Akt expression differed significantly between the three neuron groups （F=38.50，P<0.01）. The expression of p-Akt was significantly increased in the OGD/R+CMS121 group than in the control and OGD/R groups （P<0.01）， and showed no significant difference between the OGD/R and control groups （P>0.05）. There were significant differences in the NSS score and infarct volume between the three mouse groups （F=20.24，118.60，P<0.01）. Compared with the I/R group， the I/R+CMS121 group had a significantly decreased NSS score and a significantly reduced infarct volume （P<0.05）. Conclusion CMS121 has neuroprotective effects in the neuronal OGD/R model and mouse I/R model， possibly through upregulating Akt phosphorylation in cortical neurons.

［KEY WORDS］ Cranial nerve injuries; Cell hypoxia; Glucose; Reperfusion injury; Neurons; Neuroprotection; Mice， inbred C57BL

缺血再灌注（I/R）腦損傷在中老年人群中具有發(fā)病率及致殘性高等特點[1-3] ，其發(fā)病機制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)會加重I/R腦損傷[4]。近年來，乙酰輔酶A羧化酶1（ACC1）被發(fā)現(xiàn)參與炎癥反應(yīng)過程，抑制ACC1能夠抑制I/R腦損傷的神經(jīng)炎癥，從而減輕I/R腦損傷[5]。CMS121是近年來發(fā)現(xiàn)的ACC1抑制劑[6-7]，在神經(jīng)退行性疾病，特別是在阿爾茨海默癥（Alzheimers disease，AD）細胞模型以及動物模型中，能夠通過維持線粒體的穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝水平、減少炎癥以及脂質(zhì)過氧化等發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8-9]。然而，CMS121是否能夠作用于神經(jīng)元并對I/R腦損傷產(chǎn)生影響，目前尚無文獻報道。本研究旨在探索CMS121是否對I/R腦損傷神經(jīng)元具有保護作用，并進一步探討其作用機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

雄性C57BL/6J小鼠共33只，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自于濟南朋悅實驗動物繁殖公司；CMS121購自美國MCE公司；Neurobasal培養(yǎng)基、B-27補充劑和L-谷氨酰胺購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8購自美國Targetmol公司；乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天公司；一抗抗蛋白激酶B（Akt）、抗磷酸化Akt（p-Akt）、Anti-β-actin和二抗羊抗兔購自武漢Abclonal公司；ECL發(fā)光液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、組織細胞固定液購自北京索萊寶公司。皮質(zhì)神經(jīng)元獲贈于青島大學(xué)神經(jīng)再生與康復(fù)研究院。

1.2 體外實驗

1.2.1 皮質(zhì)神經(jīng)元分組及處理 使用神經(jīng)元的專用培養(yǎng)基（Neurobasal培養(yǎng)基、含體積分數(shù)0.02的B-27補充劑和0.5 μmol/L的L-谷氨酰胺）重新懸浮皮質(zhì)神經(jīng)元，將神經(jīng)元分為對照組、氧糖剝奪再灌注（OGD/R）組和OGD/R+CMS121組，每組均按照2×108個/L和1×109個/L的密度分別接種于涂有多聚賴氨酸的96孔板和6孔板內(nèi)，另設(shè)1組樣品最大酶活性對照組，將細胞以2×108個/L密度接種于涂有多聚賴氨酸的96孔板內(nèi)，將孔板置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每3 d更換一次神經(jīng)元專用培養(yǎng)基[10]。培養(yǎng)7 d后，對照組和最大酶活性對照組神經(jīng)元不作其他處理，OGD/R組神經(jīng)元進行常規(guī)OGD/R處理。OGD/R方法如下：一定質(zhì)量的不同鹽溶于去離子水當(dāng)中，制備為脫氧無葡萄糖的細胞外溶液（具體的配方：NaCl 116 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，MgSO4 0.8 mmol/L，NaH2PO4 1.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，NaHCO3 26 mmol/L），經(jīng)0.22 μm的過濾器進行無菌處理。使用脫氧無葡萄糖的細胞外溶液替換孔板中的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基，并將孔板放置于含體積分數(shù)0.95 N2和含體積分數(shù)0.05 CO2的專用室在37 ℃的條件下培養(yǎng)90 min；90 min后將脫氧無葡萄糖的細胞外溶液更換為神經(jīng)元專用培養(yǎng)基[11]。OGD/R+CMS121組神經(jīng)元同樣進行OGD處理，并于再灌注時向孔板之中加入20 nmol/L的CMS121[6]。將孔板輕輕搖勻后，靜置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞活力檢測 對1.2.1中繼續(xù)培養(yǎng)24 h的96孔板中的3組神經(jīng)元進行細胞活力檢測，具體方法如下：CCK8和神經(jīng)元專用培養(yǎng)基按照1∶9的體積比配置為CCK8工作液。將96孔板中的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基更換為100 μL的CCK8工作液，另在未種植神經(jīng)元的96孔中加入等量的CCK8工作液設(shè)為空白組，置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育4～6 h。使用酶標(biāo)儀測量各組溶液在波長450 nm處吸光度（A）值，細胞活力（%）=（處理組A-空白組A）/（對照組A-空白組A）×100%，以此計算細胞活力。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.3 細胞LDH釋放檢測 對1.2.1中繼續(xù)培養(yǎng)24 h的96孔板中的3組神經(jīng)元進行細胞LDH釋放檢測。按照LDH細胞毒性檢測試劑盒說明書的要求，向1.2.1中樣品最大酶活性對照組神經(jīng)元孔板中加入10 μL的LDH釋放試劑孵育1 h，隨后向4組神經(jīng)元各孔中加入LDH檢測工作液60 μL。使用酶標(biāo)儀測量各組溶液在波長490 nm處吸光度（A）值，并計算LDH釋放量。LDH釋放量（%）=（處理組A-對照組A）/（細胞最大酶活性A-對照組A）×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗檢測3組神經(jīng)元再灌注不同時間Akt、p-Akt的表達水平1.2.1中3組6孔板中神經(jīng)元再繼續(xù)培養(yǎng)6、24 h時，分別使用RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心后吸取上清液，并置于100 ℃ 干式恒溫器中再孵育15 min，制備為蛋白樣品。通過SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離，在300 mA、60 min的條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用質(zhì)量分數(shù)0.05的牛奶封閉液封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。使用ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)下進行顯影。使用Image J軟件分析蛋白的灰度值，并測定3組再灌注6、24 h后的Akt和p-Akt的表達水平。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.3 動物模型實驗

1.3.1 分組及處理 將小鼠隨機分為Sham組、I/R組和I/R+CMS121組。I/R組和I/R+CMS121組小鼠均使用線栓進行局灶腦I/R模型的構(gòu)建[11]。本實驗共使用33只小鼠，實驗過程中1只小鼠死亡。采用Zea Longa評分評估小鼠神經(jīng)功能缺損情況以確定模型制備情況，1～4分為造模成功，因為4分小鼠損傷過于嚴重，故取1～3分小鼠入組[12]，最終入組27只小鼠，每組9只小鼠。I/R+CMS121組在構(gòu)建模型前后給予CMS121的體內(nèi)治療，即CMS121按照每次25 mg/kg的劑量，分別在I/R模型構(gòu)建前12 h和再灌注后0、3、6 h經(jīng)腹腔注射至模型小鼠體內(nèi)。Sham組進行假手術(shù)，小鼠同樣進行大腦中動脈的切口及縫合，但不插入線栓。

1.3.2 小鼠神經(jīng)嚴重度評分（NSS） 在經(jīng)上述處理24 h后對3組小鼠進行NSS[11]，以NSS表示小鼠神經(jīng)功能受損情況。

1.3.3 TTC染色和小鼠腦梗死體積測量 完成NSS后，將小鼠麻醉處死，各組隨機選擇3只小鼠分離腦組織。將腦組織短暫冰凍后，制備冠狀切片。將切片浸泡于質(zhì)量濃度為20 g/L的TTC溶液中，37 ℃下避光孵育30 min。之后即使用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛組織細胞固定液在4 ℃下固定過夜。由于TTC是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，可進入細胞，被活細胞內(nèi)的脫氫酶還原為紅色甲臢化合物。梗死區(qū)域組織壞死，脫氫酶活力喪失而呈現(xiàn)灰白色，非梗死區(qū)域則呈現(xiàn)紅色。收集圖像后，使用Image J軟件分析小鼠腦梗死體積。

1.4 統(tǒng)計分析

使用 GraphPad Prism 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，Western Blot實驗結(jié)果采用析因設(shè)計的方差分析進行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)? 果

2.1 3組神經(jīng)元的細胞活力和LDH釋放量比較

細胞活力檢測結(jié)果顯示，對照組、OGD/R組以及OGD/R+CMS121組神經(jīng)元的細胞活力分別為（100.00±4.98）%、（58.79±3.11）%、（72.62±4.59）%，各組神經(jīng)元細胞活力比較差異具有顯著性（F=71.21，P＜0.01）；與對照組相比，OGD/R組神經(jīng)元的細胞活力顯著降低，差異具有顯著意義（t=16.58，P＜0.01）；與OGD/R組相比較，OGD/R+CMS121組神經(jīng)元的細胞活力得到顯著改善，差異有顯著性（t=5.56，P＜0.05）。

細胞LDH釋放檢測結(jié)果顯示，對照組、OGD/R組和OGD/R+CMS121組神經(jīng)元LDH釋放量分別為（16.64±0.84）%、（79.09±2.63）%、（40.19±9.64）%，各組神經(jīng)元LDH釋放量比較差異有顯著性（F=88.93，P＜0.01）；與對照組相比，OGD/R組神經(jīng)元LDH釋放量增加，差異具有統(tǒng)計意義（t=18.67，P＜0.01）；與OGD/R組相比較，OGD/R+CMS121組LDH釋放量下降，差異有統(tǒng)計意義（t=11.63，P＜0.01）。

2.2 3組神經(jīng)元OGD/R不同時間點Akt、p-Akt相對表達量和p-Akt/Akt比較

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，時間對神經(jīng)元p-Akt/Akt、p-Akt相對表達量有明顯影響（F時間=21.98、27.55，P＜0.01）；分組對神經(jīng)元p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量具有明顯影響（F組間=53.71、32.67，P＜0.01）；時間和分組的交互作用對神經(jīng)元p-Akt/Akt、p-Akt相對表達量有明顯影響（F交互=13.46、13.48，P＜0.01）。時間、分組、時間和分組交互作用對神經(jīng)元Akt的相對表達量均無明顯影響（P＞0.05）。再灌注6 h，3組神經(jīng)元p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量比較差異有顯著性（F=53.52、18.78，P＜0.01）；與對照組相比較，OGD/R組和OGD/R+CMS121組神經(jīng)元p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量均升高（P＜0.01）；OGD/R組和OGD/R+CMS121組神經(jīng)元p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量比較差異無顯著性（P＞0.05）。再灌注24 h，3組神經(jīng)元p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量比較差異有顯著性（F=36.19、38.50，P＜0.01）；OGD/R+CMS121組p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量較對照組和OGD/R組相比均升高（P＜0.01），OGD/R組和對照組相比，p-Akt/Akt和p-Akt相對表達量比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表1，圖1。

2.3 3組小鼠NSS比較

再灌注24 h以后，Sham組、I/R組以及I/R+CMS121組小鼠的NSS分別為0.01±0.01、3.89±1.76、2.33±1.41，各組NSS比較差異均具有顯著意義（F=20.24，P＜0.001）；與I/R組相比，I/R+CMS121組小鼠NSS明顯降低（P＜0.05）。

2.4 3組小鼠腦梗死體積占全腦體積的比例比較

TTC染色結(jié)果顯示，Sham組、I/R組、I/R+CMS121組小鼠的腦梗死體積占全腦體積的比例分別為（1.65±0.54）%、（36.71±2.40）%、（20.05±1.38）%，各組比較差異有顯著性（F=118.60，P＜0.01）；I/R組小鼠腦小鼠腦梗死體積占全腦體積的比例明顯高于Sham組（P＜0.01）；與I/R組相比，I/R+CMS121組小鼠腦梗死體積占全腦體積的比例明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

3 討? 論

I/R腦損傷的機制復(fù)雜，目前國內(nèi)外學(xué)者普遍認為I/R損傷主要與細胞內(nèi)線粒體和NADPH氧化酶中的自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等機制有關(guān)[13-14]。近年來能量代謝與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系被廣泛關(guān)注[15-17]。盡管葡萄糖是腦組織能量來源的主要底物，但利用其他循環(huán)底物如酮體脂肪酸等，能夠使腦組織適應(yīng)能量缺乏的狀態(tài)。其中ACC1是脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶[18-19]。

目前研究表明，通過影響ACC1的表達或活性來調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，能對肥胖、糖尿病、腫瘤等多種疾病起到治療作用[20-22]。近幾年來研究結(jié)果顯示，ACC1能夠通過參與免疫炎癥反應(yīng)加重I/R腦損傷[5，23]。CMS121是ACC1的抑制劑，近期研究顯示CMS121在神經(jīng)退行性病變?nèi)鏏D中，顯示出強大的神經(jīng)保護作用[6-9]。然而，對于CMS121在I/R腦損傷中的作用，目前未見報道。本研究通過體內(nèi)實驗證明，CMS121能夠改善OGD/R處理的神經(jīng)元的細胞活力，并且能夠抑制神經(jīng)元的LDH釋放，這意味著CMS121能夠減弱OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，減少神經(jīng)元凋亡。體外實驗研究結(jié)果顯示，CMS121治療能夠明顯降低I/R腦損傷模型小鼠的NSS，減少I/R腦損傷模型小鼠的腦梗死體積，進一步證實了CMS121對于I/R腦損傷具有神經(jīng)保護作用。

Akt的激活對于I/R腦損傷的神經(jīng)元存活具有重要的影響[24]。Akt通路能夠調(diào)控Bcl-2、Bax以及caspase-3等線粒體相關(guān)凋亡蛋白的表達，參與Nrf2激活，促進神經(jīng)元的存活，減輕I/R損傷[25-31]。根據(jù)以前的報道，在I/R的早期（3～6 h），缺血區(qū)域腦組織Akt會被激活，p-Akt水平升高；而在I/R的晚期（12～24 h），該區(qū)域腦組織p-Akt水平降低[32]。本研究結(jié)果顯示，再灌注6 h時，OGD/R處理使神經(jīng)元的p-Akt水平升高，CMS121對該階段的p-Akt水平影響不大。再灌注24 h時，OGD/R處理的神經(jīng)元p-Akt水平已經(jīng)降低，而經(jīng)過CMS121的治療，24 h時神經(jīng)元p-Akt的水平仍舊升高。這可能表明，CMS121可能是通過持續(xù)升高p-Akt的水平，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CMS121對于I/R腦損傷具有神經(jīng)保護作用。CMS121能夠持續(xù)升高大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的p-Akt水平，可能是通過激活A(yù)kt通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的。但CMS121如何通過Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用還需要進一步研究確定。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)科學(xué)倫理委員會的審核批準（文件號20211210C57332-0220-59220018）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的規(guī)定進行。

作者聲明：徐銳、孫成建、趙志遠參與了研究設(shè)計；趙志遠、趙睿、劉文豪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強）