劉韻鵬, 劉子豪, 康伯銘, 楊志廣

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院胸外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春 130021）

在世界范圍內(nèi)，肺癌已經(jīng)成為最常見(jiàn)的癌癥之一，目前已有針對(duì)肺癌高風(fēng)險(xiǎn)特定患者群體的重點(diǎn)治療策略，但多數(shù)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）病例被診斷為晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，總體預(yù)后仍然很差［1］。因此，識(shí)別新的預(yù)后生物標(biāo)志物已成為NSCLC 研究中最緊迫的挑戰(zhàn)之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄體家族，其失調(diào)在NSCLC、乳腺癌和胃癌等癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2-4］。NSCLC 的發(fā)生發(fā)展與lncRNAs 和微小RNA （microRNA，miRNA）的表達(dá)失調(diào)有關(guān)，異常表達(dá)的非編碼RNA 可以作為NSCLC 的治療靶點(diǎn)及診斷和預(yù)后標(biāo)志物［5］。lncRNA 參與調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和耐藥等多種生理病理過(guò)程［6］。lncRNA 小核仁RNA 宿 主 基 因17 （lncRNA small nucleolar RNA host gene 17，lncRNA SNHG17）是 長(zhǎng) 度 為1 186 個(gè)核苷酸的lncRNA，是SNHG 家族的成員，位于人類染色體20q11.23 上，在癌癥中發(fā)揮重要的 致 病 作 用［7］。MA 等［8］首 先 發(fā) 現(xiàn)SNHG17 在 結(jié)直腸癌中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。SNHG17 在NSCLC［9］、肝 癌［10］、骨 肉 瘤［11］和 其 他 腫 瘤 組 織中過(guò)度表達(dá)，其表達(dá)水平與預(yù)后不良有關(guān)。SNHG17 可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）吸附miRNAs，影響其他基因與該miRNAs 的結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。目前，有研究［9］顯示：SNHG17 在NSCLC 中過(guò)表達(dá)。然而，目前尚不清楚SNHG17在NSCLC 中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析miR-384 與SNHG17 和星形細(xì)胞上調(diào)基因1 （astrocyte elevated gene 1，AEG1）3′端非編碼區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）之間的結(jié)合位點(diǎn)，探討SNHG17、miR-384 和AEG1在NSCLC 中的功能和調(diào)控關(guān)系，闡明lncRNA SNHG17 通過(guò)miR-384/AEG1 軸調(diào)控NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制，為尋找NSCLC 有價(jià)值的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器NSCLC 細(xì)胞系（A549 和H1299 細(xì)胞）均購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，青鏈霉素混合液（×100）、Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增預(yù)混液和BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒均購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，TRIpure 總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，miRNA 快速提取試劑盒和miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，Transwell 小室和基質(zhì)凝膠購(gòu)自美國(guó)Corning 公司，SNHG17 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-SNHG17）、SNHG17 小干擾RNA（si-SNHG17）、miR-384 模 擬 物 （miR-384 mimics）、miR-384 抑 制 劑（miR-384 inhibitor）和相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）均購(gòu)自上海GenePharma 公司。微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購(gòu)自德國(guó)耶拿公司，奧林巴斯CKX31 倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549 和H1299 細(xì)胞在含有10%FBS、100 U·mL－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR 法檢測(cè)A549 和H1299 細(xì)胞中SNHG17、miR-384 和AEG1 mRNA 表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)RNA 濃度及純度，并將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根 據(jù)Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）試劑盒說(shuō)明書完成RT-qPCR 操作。分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法分別計(jì)算目的基因和目的miRNA 表達(dá)水平。引物序列：SNHG17 上 游 引 物，5′-TGAATCTCTTGGTGGTGTTTGTG-3′，SNHG17 下 游 引 物，5′-TGTCTGGACCCCGAATCTTG-3′；AEG1 上 游 引 物，5′-CCAGTTTCTCAGTCTACCACTT-3′，AEG1下 游 引 物 ，5′-CCCAGACCATTCATCATCGATA-3′；GAPDH 上 游 引 物，5′-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3′，GAPDH 下 游 引 物，5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′；miR-384上游引物，5′-CTGCCGCGATTCCTAGAAATTGTTCA-3′，miR-384 下游引物為試劑盒通用下游引 物；U6 上 游 引 物，5′-GGTCGGGCAGGAAAGAGGGC-3′，U6 下游引物為試劑盒通用下游引物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染A549 和H1299 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，按照Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書步驟操作，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的分組要求，分 別 將 pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-SNHG17、si-NC、si-SNHG17、mimics NC、miR-384 mimics、inhibitor NC、miR-384 inhibitor、pcDNA3.1-AEG1和si-AEG1 轉(zhuǎn) 染 至A549 或H1299 細(xì) 胞，采 用RT-qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染是否成功。

1.5 預(yù)測(cè)miR-384 與SNHG17 和AEG1 之間的靶向性采用ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù) 測(cè)miR-384 與SNHG17和AEG1 之間的靶向性。

1.6 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力收集各組細(xì)胞，離心重懸后稀釋至1×104mL－1的密度，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種100 μL 細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（A）值。細(xì)胞活力＝（干預(yù)組A 值－空白組A值）/（對(duì)照組A 值－空白組A 值）×100%。

1.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)在Transwell 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，收集用0.25%胰蛋白酶處理的細(xì)胞，離心并用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，將200 μL 細(xì)胞（4×104mL－1）懸液加入無(wú)涂層或涂有基質(zhì)凝膠的小室上層，將700 μL含15% FBS 的培養(yǎng)基加入下室。將細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)24 h。Transwell 膜用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)水平用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞并在冰上孵育20 min，4 °C、13 000 r·min－1離 心15 min。收集上清液，使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度后，將蛋白質(zhì)與SDS蛋白上樣緩沖液混合，在沸水中加熱5 min 并變性，然后行Western blotting 電泳。用5%脫脂奶粉封閉膜。將膜與稀釋的一抗孵育：AEG1抗體（1∶1 000，ABclonal）和 GAPDH 抗 體 （1∶2 000，ABclonal）在4 ℃下過(guò)夜，然后與二抗（1∶2 000，ABclonal）在室溫下孵育1 h。最后，TBST 洗膜3 次后，條帶使用顯影劑進(jìn)行顯影。條帶灰度值使用Image J 軟件計(jì)算。以GAPDH 為內(nèi)參，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17、miR-384 和AEG1 mRNA 表達(dá)水平，各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及AEG1 蛋白表達(dá)水平均以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 A549 和H1299 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17 表達(dá)水平H1299 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17 表達(dá)水平（0.66±0.09）明顯低于A549 細(xì)胞（1.01±0.11）（P<0.01）。因此，本研究選擇沉默A549 細(xì)胞中的lncRNA SNHG17 和過(guò)表達(dá)H1299 細(xì)胞中的lncRNA SNHG17 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)在A549 細(xì)胞中，與si-NC 組比較，si-SNHG17 組細(xì)胞中SNHG17 表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）；在H1299 細(xì)胞中，與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1-SNHG17 組細(xì)胞中SNHG17 表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 后各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.1 Expression levels of lncRNA SNHG17, cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after silencing lncRNA SNHG17 or over-expression of lncRNA SNHG17 (n=3，±s)

表1 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 后各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG17 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.1 Expression levels of lncRNA SNHG17, cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after silencing lncRNA SNHG17 or over-expression of lncRNA SNHG17 (n=3，±s)

*P<0.01 compared with si-NC group；△P<0.01 compared with pcDNA3.1-NC group.

Group si-NC (A549 cells)si-SNHG17 (A549 cells)pcDNA3.1-NC (H1299 cells)pcDNA3.1-SNHG17 (H1299 cells)Number of invasion cells 191.00±5.03 111.00±3.06*147.00±6.11 271.00±7.21△lncRNA SNHG17 1.03±0.24 0.21±0.02*1.02±0.19 6.35±1.42△Cell viability(η/%)95.32±5.45 45.68±10.22*96.56±3.89 136.23±10.93△Number of migration cells 384.00±12.00 289.00±6.08*499.00±13.53 716.00±11.27△

2.3 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 后各組細(xì)胞中miR-384 和AEG1 mRNA 表達(dá)水平在A549 細(xì)胞中，與si-NC 組比較，si-SNHG17 組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），AEG1 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1-SNHG17 組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），AEG1 mRNA 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 后各組細(xì)胞中miR-384 和AEG1 mRNA 表 達(dá) 水 平Tab.2 Expression levels of miR-384 and AEG1 mRNA in cells in various groups after silencing lncRNA SNHG17 or over-expression of lncRNA SNHG17 (n=3，±s)

表2 沉默或過(guò)表達(dá)lncRNA SNHG17 后各組細(xì)胞中miR-384 和AEG1 mRNA 表 達(dá) 水 平Tab.2 Expression levels of miR-384 and AEG1 mRNA in cells in various groups after silencing lncRNA SNHG17 or over-expression of lncRNA SNHG17 (n=3，±s)

*P<0.01 compared with si-NC group；△P<0.01 compared with pcDNA3.1-NC group.

AEG1 mRNA 1.03±0.24 0.06±0.02*1.02±0.19 2.34±0.27△Group si-NC(A549 cells)si-SNHG17(A549 cells)pcDNA3.1-NC(H1299 cells)pcDNA3.1-SNHG17(H1299 cells)miR-384 1.01±0.10 1.46±0.20*1.01±0.13 0.64±0.14△

2.4 抑制或增強(qiáng)miR-384 后各組細(xì)胞中miR-384表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)在A549 細(xì)胞中，與inhibitor NC 組比較，miR-384 inhibitor 組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平明顯降低（P<0.01），細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）；在H1299細(xì)胞中，與mimics NC 組比較，miR-384 mimics 組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.3 Expression levels of miR-384, cell viabilities, numbers of migration and invasion cells in various groups (n=3，±s)

表3 各組細(xì)胞中miR-384 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.3 Expression levels of miR-384, cell viabilities, numbers of migration and invasion cells in various groups (n=3，±s)

*P<0.01 compared with inhibitor NC group；△P<0.01 compared with mimics NC group.

Group miR-384 Inhibitor NC(A549 cells)miR-384 inhibitor(A549 cells)Mimics NC(H1299 cells)miR-384 mimics(H1299 cells)Number of invasion cells 160.00±7.00 243.00±3.79*207.00±6.03 116.00±8.00△1.02±0.21 0.02±0.01*1.02±0.21 4.68±1.00△Cell viability(η/%)97.16±4.22 145.69±22.24*96.37±3.22 65.67±6.40△Number of migration cells 417.00±11.14 489.00±16.64*518.00±11.53 406.00±17.67△

2.5 抑制或增強(qiáng)lncRNA SNHG17 和miR-384 后各組AEG1 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)采用ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)SNHG17與miR-384 有2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。在A549 細(xì)胞中，與si-NC+inhibitor NC 組比較，si-SNHG17+inhibitor NC 組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞 數(shù) 明 顯 減 少（P<0.01）；與si-SNHG17+inhibitor NC 組 比 較，si-SNHG17+miR-384 inhibitor 組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明 顯 增 加（P<0.01）。在H1299 細(xì) 胞 中，與pcDNA3.1-NC+mimics NC 組比較，pcDNA3.1-SNHG17+mimics NC 組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和 侵 襲 細(xì) 胞 數(shù) 明 顯 增 加 （P<0.01）；與pcDNA3.1-SNHG17+mimics NC 組 比 較，pcDNA3.1-SNHG17+miR-384 mimics 組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。見(jiàn)表4 和圖2。

圖1 lncRNA SNHG17 與miR-384 的 結(jié) 合 位 點(diǎn)Fig.1 Binding sites of lncRNA SNHG17 and miR-384

圖2 抑 制 或 增 強(qiáng) lncRNA SNHG17 和 miR-384 后Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中AEG1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of AEG1 protein in cells in various groups detected by Western blotting method after inhibiting or enhancing lncRNA SNHG17 and miR-384

表4 抑制或增強(qiáng)lncRNA SNHG17 和miR-384 后各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.4 Cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing lncRNA SNHG17 and miR-384 (n=3，±s)

表4 抑制或增強(qiáng)lncRNA SNHG17 和miR-384 后各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.4 Cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing lncRNA SNHG17 and miR-384 (n=3，±s)

*P<0.01 compared with si-NC+inhibitor NC group；△P<0.01 compared with si-SNHG17+inhibitor NC group；#P<0.01 compared with pcDNA3.1-NC+mimics NC group；○P<0.01 compared with pcDNA3.1-SNHG17+mimics NC group.

Expression level of AEG1 protein 1.00±0.03 0.72±0.01*0.81±0.01△1.00±0.02 2.26±0.04#1.56±0.02○Group si-NC+inhibitor NC(A549 cells)si-SNHG17+inhibitor NC(A549 cells)si-SNHG17+miR-384 inhibitor(A549 cells)pcDNA3.1-NC+mimics NC(H1299 cells)pcDNA3.1-SNHG17+mimics NC(H1299 cells)pcDNA3.1-SNHG17+miR-384 mimics(H1299 cells)Cell viability(η/%)98.07±4.84 63.26±6.04*78.69±6.65△101.26±5.91 138.61±9.05#108.64±7.87○Number of migration cells 364.00±18.15 314.00±8.72*350.00±8.74△496.00±18.23 674.00±6.93#582.00±14.53○Number of invasion cells 195.00±9.85 108.00±6.11*199.00±11.15△148.00±4.58 271.00±9.07#221.00±3.79○

2.6 抑制或增強(qiáng)AEG1 后各組細(xì)胞中AEG1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)在A549 細(xì)胞中，與si-NC 組比較，si-AEG1組細(xì)胞中AEG1 mRNA 表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減 少 （P<0.01）；在 H1299 細(xì) 胞 中，與pcDNA3.1-NC 組 比 較，pcDNA3.1-AEG1 組 細(xì) 胞中AEG1 mRNA 表達(dá)水平和細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）。見(jiàn)表5。

表5 抑制或增強(qiáng)AEG1 后各組細(xì)胞中AEG1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.5 Expression levels of AEG1 mRNA in cells, cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing AEG1 (n=3，±s)

表5 抑制或增強(qiáng)AEG1 后各組細(xì)胞中AEG1 mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.5 Expression levels of AEG1 mRNA in cells, cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing AEG1 (n=3，±s)

*P<0.01 compared with si-NC group；△P<0.01 compared with pcDNA3.1-NC group.

Group si-NC(A549 cells)si-AEG1(A549 cells)pcDNA3.1-NC(H1299 cells)pcDNA3.1-AEG1(H1299 cells)Number of invasion cells 167.00±6.03 115.00±10.02*137.00±7.09 282.00±3.79△AEG1 mRNA 1.02±0.22 0.56±0.08*1.01±0.11 3.15±0.90△Cell viability (η/%)98.67±4.76 71.32±8.98*99.21±7.66 132.32±9.33△Number of migration cells 381.00±13.08 308.00±10.26*499.00±11.53 609.00±11.14△

2.7 抑制或增強(qiáng)miR-384 和AEG1 mRNA 后各組細(xì)胞活力、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示：TargetScan 預(yù)測(cè)miR-384 與AEG1 有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。在A549 細(xì)胞中，與inhibitor NC+si-NC 組 比 較，miR-384 inhibitor+si-NC 組 細(xì)胞中細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）；與miR-384 inhibitor+si-NC 組 比 較，miR-384 inhibitor+si-AEG1 組細(xì)胞中細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。在H1299 細(xì) 胞 中，與mimics NC+pcDNA3.1-NC 組比較，miR-384 mimics+pcDNA3.1-NC 組細(xì)胞中細(xì)胞活力明顯降低（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）；與miR-384 mimics+pcDNA3.1-NC 組 比 較，miR-384 mimics+pcDNA3.1-AEG1 組細(xì)胞中細(xì)胞活力明顯升高（P<0.01），遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）。見(jiàn)表6。

表6 抑制或增強(qiáng)miR-384 和AEG1 mRNA 后各組細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.6 Cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing miR-384 and AEG1 mRNA (n=3，±s)

表6 抑制或增強(qiáng)miR-384 和AEG1 mRNA 后各組細(xì)胞活力、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)Tab.6 Cell viabilities and numbers of migration and invasion cells in various groups after inhibiting or enhancing miR-384 and AEG1 mRNA (n=3，±s)

*P<0.01 compared with inhibitor NC+si-NC group；△P<0.01 compared with miR-384 inhibitor+si-NC group；#P<0.01 compared with mimics NC+pcDNA3.1-NC group；○P<0.01 compared with miR-384 mimics+pcDNA3.1-NC group.

Number of invasion cells 161.00±6.11 256.00±9.17*172.00±9.07△162.00±6.03 117.00±2.08#142.00±8.71○Group Inhibitor NC+si-NC(A549 cells)miR-384 inhibitor+si-NC(A549 cells)miR-384 inhibitor+si-AEG1(A549 cells)Mimics NC+pcDNA3.1-NC(H1299 cells)miR-384 mimics+pcDNA3.1-NC(H1299 cells)miR-384 mimics+pcDNA3.1-AEG1(H1299 cells)Cell viability(η/%)101.36±7.40 145.37±19.97*112.36±7.47△98.63±8.83 63.17±9.12#81.06±5.75○Number of migration cells 408.00±12.58 481.00±8.66*425.00±9.07△520.00±8.14 401.00±10.44#589.00±6.24○

圖3 miR-384 與AEG1 的 結(jié) 合 位 點(diǎn)Fig.3 Binding sites of miR-384 and AEG1

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其中約85%為NSCLC［12］。分子靶向療法和免疫療法明顯改善了NSCLC 患者的預(yù)后［13］。近年來(lái)，大量研究報(bào)道lncRNA 在癌癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，受到廣泛關(guān)注。lncRNA 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義，如長(zhǎng)非編碼RNA 巨人皂甙（lnc-GAN1）在NSCLC 中的表達(dá)與患者良好的存活率相關(guān)，并通過(guò)吸附miR-26a-5p激活磷酸酶和張力蛋白同源物（phoshatase and tensin homolog，PTEN）信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展［14］。本研究結(jié)果顯示：在A549 細(xì)胞中SNHG17表達(dá)量高于H1299 細(xì)胞，過(guò)表達(dá)SNHG17 可以促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而沉默SNHG17 抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明SNHG17 在NSCLC 中發(fā)揮重要作用，為其作為NSCLC 治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

與其他lncRNA 相似，lncRNA SNHG17 也可以作為ceRNA 與幾種miRNA 相互作用，從而對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生影響。因此，研究lncRNAs 和miRNAs 在NSCLC 進(jìn)展中的作用，深入探討其分子機(jī)制，為NSCLC 的治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。lncRNA SNHG17 可以通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-375/配對(duì)盒6（paired box 6，PAX6）軸促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn) 展［15］；lncRNA SNHG17 還 可 以 通 過(guò) 靶 向miRNA-338-3p/SRY-box 轉(zhuǎn) 錄 因 子4 （SRY-box transcription factor 4，SOX4）軸調(diào)控食管鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和侵襲［16］。本研究結(jié)果顯示：lncRNA SNHG17 還可以通過(guò)靶向miR-384/AEG1軸調(diào)控NSCLC 的細(xì)胞增殖、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)。SNHG17 在NSCLC 組織和細(xì)胞系中上調(diào)并與晚期TNM 分期和較短的總生存期相關(guān)［17-18］。在本研究中，過(guò)表達(dá)或沉默lncRNA SNHG17 后，AEG1 mRNA 表達(dá)水平會(huì)隨lncRNA SNHG17 的過(guò)表達(dá)或沉默而升高或降低，而miR-384 的表達(dá)水平會(huì)隨lncRNA SNHG17 的過(guò)表達(dá)或沉默而降低或升高，與FAN 等［19］的相關(guān)研究結(jié)果一致。ENCORI數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)開(kāi)源平臺(tái)，用于從CLIP-seq、degradome-seq 和RNA-RNA 相互作用數(shù)據(jù)中研究miRNA-ncRNA、miRNA-mRNA、ncRNA-RNA、RNA-RNA、RBP-ncRNA 和RBP-mRNA 相 互 作用。采用ENCORI 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)SNHG17 與miR-384的結(jié)合位點(diǎn)以及miR-384 與AEG1 的結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明SNHG17 與miR-384 以 及miR-384 與AEG1 之 間靶向性良好。miR-384 可以影響胃癌和膠質(zhì)瘤等細(xì)胞的生物學(xué)功能［20-21］。研究［22-23］顯示：miR-384 還可以影響NSCLC 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥性、凋亡和自噬。在本研究中通過(guò)對(duì)miR-384 進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制，結(jié)果顯示：其表達(dá)水平升高與NSCLC 的細(xì)胞活力降低及遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少有關(guān)。AEG1 在各種癌癥類型中具有多方面的功能，其差異表達(dá)具有重要的臨床病理學(xué)意義，有作為治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)分子抑制劑的潛力。AEG1 參與調(diào)控NSCLC 的增殖、遷移、侵襲、化療耐藥和放射耐藥［24］。本研究通過(guò)對(duì)AEG1 進(jìn)行過(guò)表達(dá)或抑制，結(jié)果顯示：AEG1 表達(dá)水平降低與NSCLC的細(xì)胞活力降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)減少有關(guān)。雖然lncRNA SNHG17、miR-384 和AEG1 分別在NSCLC 中均有相關(guān)研究，但相關(guān)數(shù)據(jù)資料仍舊較少，而且三者之間的調(diào)控機(jī)制在NSCLC 中尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，因此本研究對(duì)lncRNA SNHG17/miR-384/AEG1 軸對(duì)NSCLC 細(xì)胞生物學(xué)功能影響進(jìn)行了深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：miR-384 inhibitor 部分逆轉(zhuǎn)了si-SNHG17 抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，miR-384 mimics 部分逆轉(zhuǎn)了pcDNA3.1-SNHG17 促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作 用，說(shuō) 明SNHG17 可 以 通 過(guò)miR-384 調(diào) 控NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。si-AEG1 部分逆轉(zhuǎn)了miR-384 inhibitor 促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，pcDNA3.1-AEG1 部分逆轉(zhuǎn)了miR-384 mimics 抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，說(shuō)明miR-384 可以通過(guò)AEG1 調(diào)控NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。lncRNA SNHG17 可以通過(guò)miR-384靶向AEG1 調(diào)控NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［25］，表 明lncRNA SNHG17/miR-384/AEG1 軸在NSCLC 基因靶向治療中具有巨大潛力。

綜上所述，本研究證明了lncRNA SNHG17 通過(guò)miR-384/AEG1 軸調(diào)節(jié)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC 的進(jìn)展。本研究通過(guò)對(duì)NSCLC 進(jìn)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，為NSCLC 患者的治療提供了一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，為疾病的治療開(kāi)發(fā)了潛在的生物標(biāo)志物。