孫逸飛, 李迪諾, 王玉彬

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外胃腸科，遼寧 錦州 121000）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株、主要試劑和儀器32 只SPF 級雄性BALB/c 小鼠（5～6 周齡），購自遼寧長生生物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2012-0001。胃癌細(xì)胞株MGC-803 購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。姜黃素購于美國Sigma 公司，溶解于1% 羧甲基纖維素鈉分別配成含10、20 和40 μmol·L－1的混懸液備用。一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、增強(qiáng)型CCK-8 試劑盒、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）和 磷 酸 化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）一抗及酶標(biāo)二抗均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA 法）購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司，ECL-Plus 熒光檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司。石蠟包埋機(jī)（型號：TKY-BMB）購自上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，切片機(jī)（型號：DK-2268-Ⅵ）和熒光顯微鏡（型號：PLJ-131）購自北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（型號：EXL808）購自美國Bio-RAD 公司，CO2培養(yǎng)箱（型號：371 型）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組胃癌MGC-803 細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素和鏈霉素）中，置于恒溫37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為對照組、低劑量（10 μmol·L－1）姜黃素組、中 劑 量（20 μmol·L－1）姜 黃 素 組 和 高 劑 量（40 μmol·L－1）姜黃素組。

1.3 小鼠皮下移植瘤的制備及給藥處理將32 只小鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量姜黃素組（0.5 mg·kg－1姜黃素）、中劑量姜黃素組（1 mg·kg－1姜黃素）和高劑量姜黃素組（2 mg·kg－1姜黃素），每組8 只。各組小鼠皮下注射5×105個(gè)胃癌MGC-803 細(xì)胞，待腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí)視為造模成功，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。不同劑量姜黃素組小鼠灌胃對應(yīng)濃度的姜黃素，對照組小鼠灌胃等量生理鹽水。每天觀察并記錄小鼠存活情況，每3 d 測量1 次腫瘤體積，于第30 天摘取腫瘤組織保存?zhèn)溆?。腫瘤體積（mm3）=長×寬2/2。

1.4 CCK-8 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞增殖能力

將MGC-803 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1×106個(gè)，分別經(jīng)0、10、20 和40 μmol·L－1的姜黃素處理24、48 和72 h 后，向各孔中加入20 μL 增強(qiáng)型CCK-8 溶液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。提前預(yù)熱酶標(biāo)儀，在450 nm 測定吸光度（A）值，測量數(shù)據(jù)用以評估各組細(xì)胞的增殖能力，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，以A 值表示相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力，A 比值=A48h值/A0h值。

1.5 Transwell 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞侵襲能力將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，加入0、10、20 和40 μmol·L－1的姜黃素處理24 h 后，將細(xì)胞消化并轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠包被的Transwell 小室上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，PBS 緩沖液沖洗3 遍，棉簽擦凈未穿膜細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下低倍鏡觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，高倍鏡（×200）下分別計(jì)數(shù)5 個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組MGC-803 細(xì)胞凋亡率按照每孔2×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)過夜后，加入10、20 和40 mol·L－1姜黃素處理24 h，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞，胰酶消化，1 000 g 離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS 緩沖液重懸并計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 g 離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，加入10 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測方法，用標(biāo)記FITC 的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)／ （凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.7 TUNEL 法檢測小鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡率無菌取出腫瘤組織，固定于4%的多聚甲醛中，制成4 μm 厚度的石蠟切片。依次放入二甲苯中浸泡10 min、無水乙醇浸泡5 min、90%乙醇浸泡2 min、70%乙醇浸泡2 min，蒸餾水浸泡2 min。滴 加20 mg·L－1不 含DNase 的 蛋 白 酶K，放 置 于37 ℃中作用15～30 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次10 min。向切片上滴加配置好的TUNEL 檢測液使其均勻覆蓋切片，37 ℃避光孵育60 min。PBS 緩沖液洗滌3 次，每次10 min。用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡（激發(fā)光存在下）計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，然后在相同視野下，調(diào)節(jié)激發(fā)光至關(guān)閉，并開啟正常透射光，即可計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野，計(jì)算每個(gè)視野細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 各組小鼠移植瘤組織中PI3K、Akt 和mTOR蛋白表達(dá)水平小鼠胃部移植瘤組織提?。簾o菌分離小鼠移植瘤組織并提取各組小鼠腫瘤組織總蛋白。應(yīng)用BCA 蛋白定量試劑盒檢測以上各樣本蛋白濃度，取20 μg 樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 緩沖液清洗3 次，每次5 min；加入稀釋好的一抗，4 ℃過夜孵育。次日用TBST 緩沖液洗膜3 次，每次5 min；再加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min；避光滴加ECL 液曝光顯影，采用Image J 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值，磷酸化目的蛋白表達(dá)水平=磷酸化蛋白條帶灰度值/總蛋白條帶灰度值。

區(qū)內(nèi)巖漿活動(dòng)強(qiáng)烈，巖體極為發(fā)育，有大小巖體十幾個(gè)，呈巖基、巖株產(chǎn)出，參照《中國礦產(chǎn)地質(zhì)志(江西卷)》(2015)，區(qū)內(nèi)主要出露巖體為早志留世的萬洋山序列及晚侏羅世的葛仙山序列。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組MGC-803 細(xì)胞增殖能力、侵襲能力、細(xì)胞凋亡率和小鼠移植瘤體積、移植瘤組織中細(xì)胞凋亡率及PI3K、Akt 和mTOR 蛋白表達(dá)水平，均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞增殖能力與對照組比較，不同劑量姜黃素組中MGC-803細(xì)胞增殖能力明顯降低（P<0.05）。低劑量姜黃素組中的細(xì)胞增殖能力明顯高于高劑量姜黃素組（P<0.05），而中劑量姜黃素組細(xì)胞增殖能力則介于低劑量和高劑量姜黃素組之間。見表1。

表1 CCK-8 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞增殖能力Tab.1 Proliferation abilities of MGC-803 cells in various groups detected by CCK-8 method (n=3,±s)

表1 CCK-8 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞增殖能力Tab.1 Proliferation abilities of MGC-803 cells in various groups detected by CCK-8 method (n=3,±s)

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with low dose of curcumin group；#P<0.05 compared with middle dose of curcumin group.

Group Proliferation ability 24 48 72 Control Low dose of curcumin Middle dose of curcumin High dose of curcumin(t/h) 0 0.272±0.003 0.272±0.003 0.272±0.003 0.272±0.003 0.793±0.012 0.612±0.011 0.493±0.005 0.425±0.036*△#1.125±0.041 0.864±0.022*0.651±0.007*△0.623±0.014*△#1.887±0.024 1.458±0.006*1.265±0.033*0.987±0.016*△#

2.2 各組MGC-803 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)與對照組比較，不同劑量姜黃素組MGC-803 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P<0.05）；低劑量姜黃素組細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于高劑量姜黃素組（P<0.05）；而中劑量姜黃素組MGC-803 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)介于低劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組之間（P<0.05）。見圖1 和2。

圖1 各組MGC-803 細(xì)胞侵襲形態(tài)表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×200）Fig.1 Invasive morphology of gastric cancer MGC-803 cells in various groups(Crystal violet,×200)

圖2 Transwell 法檢測各組MGC-803 細(xì)胞侵襲數(shù)Fig.2 Number of invasion MGC-803 cells in various groups detected by Transwell method

2.3 各組MGC-803 細(xì)胞凋亡率與對照組比較，不同劑量姜黃素組MGC-803 細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。低劑量姜黃素組MGC-803 細(xì)胞凋亡率明顯低于高劑量姜黃素組（P<0.05），而中劑量姜黃素組MGC-803 細(xì)胞凋亡率則介于低劑量姜黃素組和高劑量姜黃素組之間（P<0.05）。見圖3 和4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組MGC-803 細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of MGC-803 cells in various groups detected by flow cytometry

圖4 各組MGC-803 細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of MGC-803 cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各組小鼠移植瘤體積連續(xù)監(jiān)測各組小鼠移植瘤體積，對照組小鼠移植瘤體積為（425.4±17.6）mm3，低劑量姜黃素組小鼠移植瘤體積為（187.6±15.9）mm3、中劑量姜黃素組小鼠移植瘤體積為（47.5±8.4）mm3，高劑量姜黃素組小鼠移植瘤體積為（19.7±5.2）mm3，與對照組比較，不同劑量姜黃素組小鼠移植瘤體積明顯縮?。≒<0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠移植瘤大體形態(tài)表現(xiàn)Fig.5 General morphologly of transplanted tumors of mice in various groups

2.5 各組小鼠移植瘤組織的細(xì)胞凋亡率TUNEL 染色觀察各組小鼠移植瘤組織的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：對照組小鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡率較低，與對照組比較，不同劑量姜黃素組小鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；中劑量姜黃素組小鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡率明顯高于低劑量姜黃素組（P<0.05），高劑量姜黃素組小鼠移植瘤的細(xì)胞凋亡率明顯高于中劑量姜黃素組（P<0.05）。見圖6 和7。

圖6 TUNEL 法檢測各組小鼠移植瘤組織的細(xì)胞凋亡情況 (×200)Fig.6 Apoptosis of cells of transplanted tumor tissue of mice in various groups detected by TUNEL method(×200)

圖7 各組小鼠移植瘤組織的細(xì)胞凋亡率 (×200)Fig.7 Apoptotic rates of cells of transplanted tumor tissue of mice in various groups(×200)

2.6 各組小鼠移植瘤組織中PI3K、p-AKT 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平與對照組比較，不同劑量姜黃素組 小 鼠 移 植 瘤 組 織 中PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平隨劑量升高而明顯降低（P<0.05）。低劑量姜黃素組小鼠移植瘤組織中PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯高于中劑量姜黃素組（P<0.05），而高劑量姜黃素組小鼠移植瘤組織中PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平明顯低于中劑量姜黃素組（P<0.05）。見圖8。

圖8 Western blotting 法檢測各組小鼠移植瘤組織中PI3K/AKT/mTOR 信號通路蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway proteins in transplanted tumor tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

胃癌是世界上最常見的癌癥之一，近年來胃癌在亞洲地區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢［7-8］。常見的胃癌治療方法包括化療、放療、胃切除和靶向治療［9-11］，其中化療是胃癌的主要治療方法，但其具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)和化療耐藥性［12］。姜黃素是從姜黃中提取的一種多酚化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用［13］，可能通過調(diào)節(jié)致癌途徑來抑制癌癥的發(fā)生［14］，對胃癌的作用包括直接抑制增殖和侵襲、誘導(dǎo)凋亡、化學(xué)治療增敏及逆轉(zhuǎn)耐藥、抗化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)胃癌和抗幽門螺旋桿菌等作用，其機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因及多種信號通路從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。本研究以人胃癌MGC-803 細(xì)胞為研究對象，研究姜黃素對MGC-803 細(xì)胞體內(nèi)外增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其可能機(jī)制。

胃癌的進(jìn)展與一系列分子水平變化有關(guān)，包括相關(guān)基因的突變以及異常表達(dá)、信號通路的激活等，分子靶向治療在抗腫瘤治療中已顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。研究［16］顯示：細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。腫瘤細(xì)胞可以通過EMT 獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力［17］，此過程通常是在多種生長因子的誘導(dǎo)下，活化有關(guān)信號通路，通過一系列表觀遺傳調(diào)控反應(yīng)，促進(jìn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Snail 和Slug 的表達(dá)，下調(diào)上皮標(biāo)記物的表達(dá)，引起腫瘤起始細(xì)胞的抗凋亡和浸潤侵襲等能力增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［18］。因此，降低腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)其凋亡是抑制腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。既往研究［19］表明：姜黃素可以抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化能力，降低腫瘤干細(xì)胞在癌細(xì)胞中的數(shù)量。姜黃素還可以下調(diào)P21 蛋白激活激酶1 （P21 protein activated kinase 1，PAK1）活性及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）的表達(dá)，阻斷胃癌細(xì)胞周期從G1期到S 期的轉(zhuǎn)換，抑制胃癌細(xì)胞的增殖［20-22］。本研究結(jié)果顯示：不同劑量的姜黃素治療均能有效抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：口服姜黃素能夠明顯抑制腫瘤的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，有效延緩小鼠死亡。

PI3K/Akt 信號通路是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號通路［23］，該通路在功能上與細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、新陳代謝和靜止有關(guān)［24］。PI3K/Akt 信號通路還可以通過參與EMT 促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展［25］。Akt是PI3K 下游的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)，其是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在促進(jìn)細(xì)胞存活及調(diào)節(jié)多種功能中起重要作用。Akt 活性異常能夠?qū)е抡＜?xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其磷酸化后能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［26］。mTOR 為Akt 下游基因，能夠被p-Akt 直接或間接誘導(dǎo)磷酸化而激活，p-mTOR 是自噬過程主要調(diào)節(jié)蛋白，p-mTOR 能夠調(diào)控細(xì)胞周期而促進(jìn)細(xì)胞增殖［27］。研 究［28］表 明：藥 物UFM1 可 以 通 過 抑 制PI3K/Akt 分子信號通路降低胃癌細(xì)胞的遷移。應(yīng)用藥物治療也可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬依賴性凋亡［29］。本研究結(jié)果顯示：不同劑量的姜黃素組小鼠移植瘤組織中p-PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組，驗(yàn)證了姜黃素可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR 表達(dá)在胃癌中發(fā)揮保護(hù)作用。PI3K-AktmTOR 通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生長、存活、增殖、凋亡、血管生成和自噬等過程中發(fā)揮極其重要的生物學(xué)功能［30］，關(guān)于該通路在胃癌細(xì)胞的增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用已有很多報(bào)道，近年來，姜黃素的抗癌作用一直都是研究熱點(diǎn)，因此本研究基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路探討中藥姜黃素的作用機(jī)制，同時(shí)觀察不同劑量的姜黃素對小鼠移植瘤細(xì)胞的影響，為開展癌癥的靶向藥物開展臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

綜上所述，姜黃素通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，在體外有效地抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡，而在體內(nèi)可以抑制腫瘤的生長。本研究為胃癌的治療提供了新的理論依據(jù)，但其應(yīng)用于臨床治療效果還有待進(jìn)一步研究。