李 晶, 楊舒越, 趙佳欣, 孔繁利, 郭思瑤, 馮憲敏

（1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

在自然界中存在著多種自由生活阿米巴原蟲，其中一部分具有潛在致病作用，可引起諸如人體急慢性炎癥等。棘阿米巴屬（Acanthamoeba）是阿米巴原蟲的一種，其廣泛分布在自然界的水、泥土和腐爛的植物中，可經(jīng)受損的皮膚、眼角膜、呼吸道或生殖道等侵入人體，并能寄生在眼部或腦部，從而引起致盲性阿米巴性角膜炎（AcanthamoebaKeratitis，AK）、肉芽腫性阿米巴性腦炎和阿米巴性皮膚損害［1-4］?？ㄊ霞⒚装停ˋcanthamoeba castellanii，Ac）是最具代表性的致病蟲株，為AK的主要病原體［5］。Ac 的生活史包括滋養(yǎng)體和包囊2 個(gè)階段，黏附是蟲體入侵人體的首要環(huán)節(jié)。入侵角膜基質(zhì)的滋養(yǎng)體很快形成包囊，包囊對(duì)藥物具有很強(qiáng)的抵抗作用，不易被清除，常常造成感染的慢性化。對(duì)于嚴(yán)重的AK 患者，主要以手術(shù)治療為主，包括眼角膜病灶清創(chuàng)術(shù)、眼角膜移植術(shù)和病灶冷凍治療等，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［6-7］。因此阻斷棘阿米巴的入侵是預(yù)防感染的關(guān)鍵。本課題組在前期工作中構(gòu)建了棘阿米巴cDNA文庫，經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選出包含肌動(dòng)蛋白1（Actin 1）的多種抗原分子［8-9］。Actin 1 是真核細(xì)胞骨架的核心組成部分，參與蟲體的運(yùn)動(dòng)、形狀維持、囊泡運(yùn)輸、基因調(diào)控和細(xì)胞分裂等［10］。研究［11-14］表明：Actin 1 在多種寄生原蟲的入侵和致病過程中發(fā)揮作用。在前期工作基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討Ac-Actin 1 的免疫學(xué)特性，初步闡明Ac-Actin 1 介導(dǎo)蟲體黏附宿主細(xì)胞，參與蟲體入侵的作用，為進(jìn)一步研究Ac-Actin 1 的功能和以Ac-Actin 1 為分子靶點(diǎn)的預(yù)防策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棘阿米巴原蟲、細(xì)胞系、細(xì)菌菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物棘阿米巴原蟲（ATCC?50514TM）購于美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。Vero 細(xì)胞系由普諾賽生命科技有限公司提供。大腸桿菌（ATCC?29552TM）由實(shí)驗(yàn)室甘油菌種保存于－80 ℃冰箱中。3 只新西蘭白兔購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)方案獲得了吉林醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：190001）。

1.2 主要試劑和儀器蛋白胨和酵母浸膏瓊脂購自英國OXOID 公司，麥芽浸出液瓊脂、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自美國Sigma 公司，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（14 400～97 400）購自北京天恩澤科技有限公司，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）購自中國Proteintech 公司，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔IgG 抗體分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀購自上海美谷公司，CX33 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司，Clear first-2000 蛋白純化儀購自上海閃譜公司，全自動(dòng)凝膠/化學(xué)發(fā)光成像分析儀購自上海天能公司，超凈工作臺(tái)購自蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

1.3 Ac 的培養(yǎng)從液氮中取出棘阿米巴蟲株凍存管，迅速放置于提早預(yù)熱至35 ℃水浴鍋中，使其迅速解凍融化；向凍存管中加入100 μL 慶大霉素硫酸鹽，吹打混勻，用一次性無菌吸管吸出蟲體懸液300 μL，涂布于997 固體培養(yǎng)基（麥芽膏 0.1 g、酵母膏 0.1 g 和瓊脂10 g，加1 L 蒸餾水溶解，121 ℃高壓蒸汽滅菌，倒入一次性90 mm 培養(yǎng)皿中，待凝固后，4 ℃保存）；待凝固后封口，倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3～5 d 后通過倒置顯微鏡（×100）觀察蟲體形態(tài)。

1.4 重組Ac-Actin1（recombinantAc-Actin1，rAc-Actin 1）蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析在超凈工作臺(tái)中，將含有pET22b（+）-Actin 1（His 標(biāo)簽）重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)株，以1∶200 比例接種于5 mL 含有氨芐青霉素（ampicillin）抗性（終濃度50 mg·L－1）的LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min－1條件下?lián)u床中振搖過夜培養(yǎng)；次日將過夜菌液以1∶100比例接種于5 mL 含有Amp 抗體（終濃度50 mg·L－1）的新鮮LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，以37 ℃、180 r·min－1條件下振搖培養(yǎng)至吸光度［A（600）］值為0.6～0.8；留取1 mL 菌液至1.5 mL Ep 管中，作為誘導(dǎo)前菌液陰性對(duì)照；剩余菌液中加入終濃度為1 mmol·L－1的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG），37 ℃、180 r·min－1條件下振搖誘導(dǎo)4 h；留取40 μL 全菌，剩余菌液于4 ℃、12 000 r·min－1離心10 min，棄上清，收集誘導(dǎo)前后菌體沉淀重懸于40 μL PBS 緩 沖 液（pH 7.2），加 入10 μL 5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，100 ℃金屬浴煮沸10 min，取10 μL 進(jìn)行SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)情況。收集誘導(dǎo)后4 h菌液50 mL，于4 ℃、12 000 r·min－1離心10 min，棄上清；加入20 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0）裂解液充分混勻菌體沉淀進(jìn)行超聲破碎，將超聲后的菌體12 000 r·min－1離心10 min，取等體積上清和沉淀經(jīng)處理后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的可溶性。

1.5 rAc-Actin 1 蛋白的純化及鑒定將表達(dá)體系擴(kuò)增至3 L，于 4 ℃、12 000 r·min－1離心25 min，收 集 菌 體 沉 淀，加 入50 mL 的20 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0）溶液重懸沉淀，進(jìn)行超聲破碎，留取超聲破菌后的沉淀即為包涵體蛋白；對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌、變性和復(fù)性；復(fù)性液通過His Trap FF 預(yù)裝純化柱，采用親和層析方法，使用Clear First-2000 型蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，分別用含100 和200 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0）溶液洗柱，收集蛋白峰；通過SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的純化情況。

1.6 rAc-Actin 1 蛋白的多克隆抗體制備3 只體質(zhì)量約為2.0 kg 的新西蘭白兔，免疫前于耳緣靜脈取陰性血清；首次免疫以800 μ g 純化后的rAc-Actin 1 蛋白，加入等體積弗氏完全佐劑，混勻至完全乳化，行背部皮下多點(diǎn)注射；首次免疫后，每間隔2 周進(jìn)行1 次共3 次的加強(qiáng)免疫，用800 μg免疫原和等體積弗氏不完全佐劑混勻，行背部皮下多點(diǎn)注射；于第4 次免疫后1 周，收集血液，37 ℃靜置凝固后，4 500 r·min－1離心10 min，分離血清。

1.7 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測新西蘭白兔多克隆抗體效價(jià)和抗體亞型純化后的rAc-Actin 1蛋白（5 mg·L－1），包被96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，4 ℃過夜；次日棄液，甩干，PBS 緩沖液洗滌3 次；各孔加200 μL 5%脫脂牛奶37 ℃靜置封閉1 h；PBS 緩沖液洗滌后，孵育一抗（兔多克隆抗體用PBS 緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，稀釋梯度分別為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200 和1∶102 400）；陰性對(duì)照孔為100 μL（1∶200）兔陰性血清，空白對(duì)照孔為100 μL PBS 緩沖液，37 ℃靜置孵育1 h；PBS 緩沖液洗滌后，加入二抗（1∶2 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG），每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；PBS 緩沖液洗滌后，顯色并在450 nm 波長下測量各孔A 值，計(jì)算兔多克隆抗體效價(jià)（最大A 值的二分之一所對(duì)應(yīng)的稀釋梯度）。采用ELISA 試劑盒按照說明書操作，檢測抗Ac-Actin 1 IgG 抗體亞型。

1.8 Western blotting 法檢測rAc-Actin1 蛋白與兔多克隆抗體的免疫反應(yīng)性將0.25、0.50和1.00 μg的純化蛋白分別進(jìn)行12%的SDS-PAGE 電泳后，按照100 V、1 h 條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將目的蛋白充分轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的PBST 封閉1 h，按照1∶1 000 比例加入兔多抗陽性血清（一抗）過夜孵育，加入適量PBST 洗膜3 次，每次10 min，按照1∶3 000 比例加入帶辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔（二抗）室溫作用1 h，充分洗膜后加入ECL 顯色液，經(jīng)成像系統(tǒng)分析重組蛋白與兔多克隆抗體的免疫反應(yīng)性。

1.9 免疫熒光法檢測Ac-Actin1 的定位取對(duì)數(shù)期蟲體接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，25 ℃過夜孵育，次日顯微鏡下觀察棘阿米巴滋養(yǎng)體比例達(dá)到95%以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；棄去培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液洗滌3 次，去 除 雜 質(zhì) 及 死 蟲 體；4% 多 聚 甲 醛（polyformaldehyde macromolecule，PFA）溶 液 室溫固定30 min；PBS 緩沖液洗滌后，加入1 mL Triton X-100，室溫孵育30 min；去除孔內(nèi)液體，充分沖洗，加入800 μL 5% BSA 室溫封閉 1 h；分別進(jìn)行一抗（兔多克隆抗體血清，1∶50）和二抗（Alexa Fluor 488 熒光標(biāo)記的羊抗兔 IgG，1∶500）孵育；洗滌后，加入800 μL DAPI 染色液；洗滌后，激光共聚焦顯微鏡（×1 200）觀察成像并拍照。

1.10 棘阿米巴滋養(yǎng)體細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測蟲體對(duì)細(xì)胞的黏附性設(shè)置對(duì)照組（細(xì)胞+蟲體）和實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞+蟲體+抗體）。取對(duì)數(shù)期蟲體接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，25 ℃孵育過夜，次日，吹打蟲體懸液轉(zhuǎn) 移 至15 mL 離 心 管 中，2 000 r·min－1離心10 min，棄上清，PYG 重懸沉淀。取對(duì)數(shù)期Vero 細(xì)胞，接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔為2.2×104個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。對(duì)照組中細(xì)胞加入等數(shù)量的滋養(yǎng)體，實(shí)驗(yàn)組中加入預(yù)先兔多克隆抗體血清孵育（1∶40，37 ℃培養(yǎng)2.5 h）的等數(shù)量滋養(yǎng)體，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于2、4 和6 h 吸去游離蟲體，倒置顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算黏附率，黏附率=蟲體黏附Vero 細(xì)胞上的數(shù)量/細(xì)胞的數(shù)量×100%。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)照組不同時(shí)期棘阿米巴滋養(yǎng)體和Vero 細(xì)胞共孵育黏附率，實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)期棘阿米巴滋養(yǎng)體、多抗和Vero 共孵育黏附率經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rAc-Actin 1 蛋白的表達(dá)和可溶性分析將重組質(zhì)粒pET22b（+）-Actin 1（His 標(biāo)簽）轉(zhuǎn)化入大 腸 桿 菌BL21 （DE3）菌 株，經(jīng) 1 mmol·L－1IPTG、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明：在相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000 處有一明顯的蛋白條帶（圖1）。收集誘導(dǎo)后4 h 菌體沉淀，經(jīng) 超 聲 破 碎 后，12 000 r·min－1離 心10 min，取等體積上清和沉淀經(jīng)處理后，行SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白可溶性，結(jié)果顯示：rAc-Actin 1 主要以包涵體形式表達(dá)（圖2）。

圖1 rAc-Actin 1 蛋白的原核表達(dá)Fig.1 Prokaryotic expression of rAc-Actin 1 protein

圖2 rAc-Actin 1 蛋白的可溶性分析Fig.2 Soluble analysis on rAc-Actin 1 protein

2.2 rAc-Actin 1 的純化經(jīng)鎳柱純化后的蛋白，分別取不同濃度的咪唑洗脫峰留樣進(jìn)行SDSPAGE 電泳鑒定重組蛋白的純化效果，結(jié)果表明：100 mmol·L－1咪唑濃度時(shí)，蛋白純度較高（圖3）。

圖3 rAc-Actin 1 蛋白的純化Fig.3 Purification of rAc-Actin 1 protein

2.3 rAc-Actin 1 蛋白免疫兔多克隆抗體效價(jià)隨著稀釋度的增加，A （450）值逐漸下降，最大A 值1/2 處所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)為抗體的效價(jià)，為1∶6 400 （圖4）。

圖4 間接ELISA 法檢測重組蛋白免疫兔多克隆抗體效價(jià)Fig.4 Titers of recombinant protein immunized rabbit polyclonal antibodies detected by indirect ELISA method

2.4 兔多克隆抗體亞型IgG1 和IgG2a采用ELISA 抗體分型試劑盒測定兔血清中的抗Ac-Actin1 IgG1 和IgG2a 濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IgG1 和IgG2a 平均濃度，分別為116.76（圖5）和1 136.15 mg·L－1（圖6）。

圖5 兔血清IgG1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of serum IgG1 of rabbits

圖6 兔血清IgG2a 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of serum IgG2a of rabbits

2.5 rAc-Actin 1 蛋白與兔多克隆抗體的免疫反應(yīng)性經(jīng)Western blotting 法檢測后，成像系統(tǒng)顯示目標(biāo)條帶清晰可見，且背景干凈無雜帶出現(xiàn)，表明rAc-Actin 1 與兔多克隆抗體具有較好的免疫反應(yīng)性（圖7）。

2.6 rAc-Actin 1 蛋白的免疫熒光定位采用間接免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡放大1 200 倍，可以觀察到Ac-Actin 1 主要定位于滋養(yǎng)體的細(xì)胞膜上，內(nèi)外膜均有分布（圖8）。

圖8 rAc-Actin 1 在滋養(yǎng)體中的免疫熒光定位(Bar=10 μm)Fig.8 Immunofluorescence localization of rAc-Actin 1 in trophozoites(Bar=10 μm)

2.7 Ac-Actin 1、棘阿米巴原蟲和Vero 細(xì)胞共孵育的黏附作用采用1∶40 的兔抗rAc-Actin 1 多克隆抗體孵育滋養(yǎng)體后，進(jìn)行細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：對(duì)照組黏附率為（66.11%±0.11%），抗體與蟲體孵育時(shí)間2 h時(shí)，黏附率為（42.88%±0.04%）；4 h 時(shí)，黏附率為（29.34%±0.01%）；6 h 時(shí)，黏附率為（26.63%±0.02%）。蟲體和細(xì)胞孵育對(duì)照組2 h 時(shí)，黏附率為78.79%±0.01%；4 h 時(shí)，黏附 率 為60.53%±0.03%；6 h 時(shí)，黏 附 率 為66.11%±0.02%。隨著抗體與蟲體孵育時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組棘阿米巴原蟲對(duì)Vero 細(xì)胞的黏附率明顯降低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明抗rAc-Actin 1多克隆抗體可有效阻斷蟲體的黏附作用。

3 討 論

AK 的感染和致病涉及一系列過程，包括棘阿米巴滋養(yǎng)體與角膜上皮細(xì)胞黏附、分泌蛋白質(zhì)水解酶促進(jìn)滋養(yǎng)體通過基底膜和基質(zhì)對(duì)角膜的入侵和滲透、破壞角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等［15-19］。研究［19-20］表明：甘露糖結(jié)合蛋白可介導(dǎo)滋養(yǎng)體黏附到角膜上皮細(xì)胞，同時(shí)通過誘導(dǎo)MIP-133 對(duì)角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變作用。若以MIP-133 免疫中國倉鼠，其淚液中可產(chǎn)生出抗MIP-133 的SIgA 型抗體，該抗體在一定程度上可以抵御滋養(yǎng)體的感染［21］。但當(dāng)滋養(yǎng)體大量黏附后，其抗感染的作用也被大大削弱［22］。因此，切斷蟲體的黏附是抵御蟲體致病的關(guān)鍵。

為進(jìn)一步探討Ac-Actin 1 在棘阿米巴滋養(yǎng)體黏附入侵過程中的作用，本研究以純化的rAc-Actin 1免疫新西蘭白兔，制備兔多克隆抗體，檢測抗體效價(jià)（1∶6 400），證明rAc-Actin 1 具有良好的免疫原性，同時(shí)rAc-Actin 1 與兔抗rAc-Actin 1 多克隆抗體具有良好的免疫反應(yīng)性；為了確定rAc-Actin 1所觸發(fā)的免疫類型，檢測多克隆抗體亞型（IgG1 和IgG2a）濃 度，分 別 為 116.76 g·L－1和1 136.15 mg·L－1，且IgG1 濃 度 明 顯 大 于IgG2a，表明rAc-Actin 1 同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但以Th2 免疫反應(yīng)為主；Ac-Actin 1 主要定位于棘阿米巴原蟲的細(xì)胞膜上；共孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Ac-Actin 1 對(duì)Vero 細(xì)胞具有黏附作用。當(dāng)蟲體與兔抗rAc-Actin 1 多克隆抗體共孵育后，蟲體對(duì)細(xì)胞的黏附率明顯下降，表明Ac-Actin 1 可能參與蟲體入侵的黏附過程，兔抗rAc-Actin 1多克隆抗體可有效阻斷蟲體的黏附，具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，環(huán)境中普遍存在的棘阿米巴成囊是導(dǎo)致棘阿米巴耐藥及感染難以治愈的主要原因［23-24］。由于棘阿米巴角膜炎診斷技術(shù)的滯后［25］，感染的預(yù)防對(duì)于棘阿米巴感染的防治至關(guān)重要。然而目前尚無抗棘阿米巴疫苗。本研究以Ac-Actin 1為候選分子，探討Ac-Actin 1 免疫學(xué)特性及其在棘阿米巴入侵過程中對(duì)宿主細(xì)胞的黏附作用，為棘阿米巴感染分子機(jī)制和免疫預(yù)防策略的研究提供新思路。