蚜蟲莫氏黑粉菌脂肪酶的酶學性質(zhì)研究

紀晨雪,牛永武,楊巖曉,喬 杉,趙仁勇

河南工業(yè)大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

脂肪酶(triacylglycerol acylhydrolases, ES 3.1.1.3)能夠催化甘油三酯水解,生成甘油二酯、單甘酯和脂肪酸[1],酶水解具有反應(yīng)高效、無須輔酶參與、副反應(yīng)少等優(yōu)點。隨著研究的持續(xù)深入,脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬。目前,脂肪酶已在食品生產(chǎn)[2]、生物柴油[3]、日化洗滌[4]、醫(yī)療制藥[5]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。我國開展脂肪酶相關(guān)研究時間相對較晚[6],雖然當前研究的脂肪酶種類較多,但工業(yè)化生產(chǎn)種類有限。因此,表征具有工業(yè)化生產(chǎn)價值的脂肪酶相關(guān)酶學性質(zhì)對發(fā)掘脂肪酶的應(yīng)用潛力具有重要意義。

不同微生物來源脂肪酶的酶學性質(zhì)具有顯著差異性,直接決定其應(yīng)用范圍。Gu等[7]發(fā)現(xiàn)Microbulbifersp. YNDZ01合成脂肪酶在70 ℃和pH 10條件下表現(xiàn)出最高的催化活性,對多種有機溶劑和洗滌劑具有一定的耐受性,對中、短鏈三?；视秃蛯ο趸椒吁ゾ哂兴饽芰?表明該脂肪酶作為一種非水相生物催化劑具有一定的應(yīng)用前景。Gurkok等[8]對Aeromonascaviae合成的胞外脂肪酶進行性質(zhì)研究,發(fā)現(xiàn)脂肪酶在25～70 ℃、pH 6～11范圍內(nèi)均有較好的催化活性,Ba2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mg2+對脂肪酶活性具有激活作用,而Mn2+、Mo2+、Ni2+、Zn2+具有抑制酶活力的效果,將該脂肪酶與洗衣粉配合使用,可以增強洗滌性能,提高去污能力。Kumar等[9]發(fā)現(xiàn)ChryseobacteriumpolytrichastriERMR1∶04合成的脂肪酶在5～65 ℃范圍內(nèi)具有一定的催化活性,Na2+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+能夠提高脂肪酶活性,Cu2+、Fe2+則降低脂肪酶活性,并且它對甲醇和異丙醇具有很好的耐受性。該脂肪酶與普通商業(yè)洗滌劑具有良好的生物兼容性,是一種潛在的洗滌劑配方。總的來看,研究人員已經(jīng)針對多種微生物脂肪酶的最適反應(yīng)溫度、pH值、金屬離子耐受性和有機溶劑耐受性等酶學性質(zhì)進行了研究,不同脂肪酶的性質(zhì)各有不同[4]。因此,對新發(fā)掘脂肪酶的酶學性質(zhì)進行研究具有必要性。

蚜蟲莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis,M.aphidis)是一種能夠在僅以植物油為碳源的培養(yǎng)基中生長繁殖,高效合成甘露糖赤蘚糖醇脂(MELs)的菌株[10]。關(guān)于M.aphidis的相關(guān)研究主要圍繞MELs的合成、代謝調(diào)控及產(chǎn)物應(yīng)用展開[11-12]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)M.aphidis可以合成脂肪酶,優(yōu)化后的脂肪酶活性較高,具有一定的工業(yè)化應(yīng)用潛力。Dimitrijevic等[13]對M.aphidis合成粗脂肪酶活力和5種有機溶劑耐受性也有研究報道,發(fā)現(xiàn)在丙酮和乙腈中粗脂肪酶對對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)表現(xiàn)出較好的水解活性,但未對最適溫度、pH值等酶學性質(zhì)進行全面研究。基于此,作者對M.aphidis生物合成的脂肪酶進行相關(guān)酶學性質(zhì)研究,明確其最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性,以及金屬離子、表面活性劑和有機溶劑對脂肪酶活性的影響,并測定作用底物位置特異性和酶促反應(yīng)動力學,為推動該脂肪酶的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蚜蟲莫氏黑粉菌(Moesziomycesaphidis,M.aphidis),本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：酵母浸粉3.0 g,麥芽浸粉3.0 g,葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,去離子水1.0 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO33.1 g,MgSO4·7H2O 0.4 g,KH2PO40.3 g,酵母浸粉2.24 g,葡萄糖50.0 g,吐溫-80 3.0 mL,去離子水1.0 L,初始pH未調(diào)節(jié)。配制后,分裝入250 mL錐形瓶中,每瓶裝液量為30.0 mL,加入花生油2.0%(體積分數(shù),下同),121 ℃滅菌15 min,備用。

1.1.3 試劑

葡萄糖、(NH4)2SO4、CaSO4、MgSO4、無水乙醇、甲苯、正己烷、乙二胺四乙酸(EDTA)：天津市科密歐化學試劑有限公司;蛋白胨：生化級,北京奧博星生物試劑有限公司;ZnSO4、Fe2(SO4)3、KH2PO4：天津市恒興化學試劑制造有限公司;阿拉伯膠：邁瑞爾生物試劑有限公司;吐溫-20、曲拉通-100：化學純,天津市光復精細化工有限公司;酵母浸粉：化學純,安琪酵母股份有限公司;CuSO4：西隴化工股份有限公司;吐溫-80：化學純,天津市凱通化學試劑有限公司;磷酸：洛陽昊華化學試劑有限公司;異丙醇：天津市東力化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)：北京索萊寶科技有限公司;對硝基苯酚(PNP)、p-NPP：阿拉丁生化科技股份有限公司;考馬斯亮藍G250：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;咪唑啉：上海麥克林生化科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘油、二甲基亞砜(DMSO)：國藥集團化學試劑有限公司;氯仿、正己烷：天津賽孚瑞科技有限公司。上述試劑無特別說明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL1502-S分析天平：瑞士Mettler Toledo公司;ZHJH-C1109C超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司;YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司;Vortex-2 Genie渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司;SevenEasy S20 pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;5424高速離心機：德國Eppendorf公司;UV-2550紫外分光光度計：日本島津公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海華燕醫(yī)療器械有限公司;ZQZY-C8振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司;SPARK酶標儀：澳大利亞Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶的制備

從-80 ℃冰箱中取出25.0%甘油保存的菌株,35～37 ℃孵育1～2 min解凍,按照2.0%(V/V)接種活化培養(yǎng)基中(50.0 mL/250 mL錐形瓶),28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h得活化液。將活化液按照2.0%(V/V)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,25.8 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d,獲得發(fā)酵液。發(fā)酵液在12 000 r/min條件下離心5 min,收集上清液,即為粗脂肪酶液,用于后續(xù)的酶學性質(zhì)研究。

1.3.2 蛋白含量的測定

以牛血清蛋白為標準,采用Bradford法測定上清液中的蛋白含量[14]。

1.3.3 脂肪酶酶活的測定

以對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)為底物,根據(jù)曹茜[15]使用的方法,結(jié)合實驗室前期關(guān)于酶活測定方法的研究結(jié)果,確定脂肪酶酶活的測定方法：在2.0 mL離心管中加入600.0 μLp-NPP溶液,同時加入適當稀釋的粗酶液25.0 μL,空白對照加入等量0.05 mmol/L Tris-HCl pH 8緩沖液,70 ℃水浴反應(yīng)10 min,500.0 μL無水乙醇終止反應(yīng)。12 000 r/min條件下離心5 min,在410.0 nm處測定吸光度。

1 min催化水解底物p-NPP生成1 μmol對硝基苯酚(PNP)所需酶量為1個酶活單位(U)。比酶活的定義為單位質(zhì)量蛋白所具有的酶活力(U/mg)。

1.3.4 pH值對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響

分別配制pH 5、6、7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液,測定酶活,確定脂肪酶的最適反應(yīng)pH值。將酶液加入不同pH值5～10的Tris-HCl緩沖液中混勻,在4 ℃下孵育1 h,測定酶活。根據(jù)相對酶活評價脂肪酶的pH穩(wěn)定性。

1.3.5 溫度對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響

將25.0 μL適當濃度的脂肪酶液與600.0 μL底物混合均勻,然后置于不同溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)水浴中反應(yīng)后測定酶活,確定脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。探究脂肪酶的溫度穩(wěn)定性,先將酶液置于-20、4、25、50、70、90 ℃孵育1～5 h,再放置于70 ℃水浴中反應(yīng)10 min后測定酶活。

1.3.6 金屬離子對脂肪酶活性的影響

配制1.0、5.0、10.0 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+溶液,其中陰離子均為SO42-,分別與脂肪酶液混合均勻,4 ℃下孵育1 h,測定酶活。

1.3.7 表面活性劑及抑制劑對脂肪酶活性的影響

配制0.05%(V/V)吐溫-20、吐溫-80、曲拉通-100、咪唑啉等表面活性劑溶液和1 mmol/L SDS、阿拉伯膠、EDTA溶液,分別與脂肪酶液混合均勻,4 ℃下孵育1 h,測定酶活。

1.3.8 有機溶劑對脂肪酶活性的影響

選擇甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、乙醚、氯仿等工業(yè)常用有機溶劑,配制體積分數(shù)為30%的溶液,分別與脂肪酶液混合均勻,4 ℃下孵育1 h,測定酶活。

1.3.9 相對酶活計算

所有測定pH(或溫度)的最高酶活為對照(相對酶活為100%),計算不同測定pH(或溫度)條件下的相對酶活。其中,相對酶活為不同pH(或溫度)下的酶活與測定pH(或溫度)下的最高酶活的比值。

其他酶學性質(zhì)探究中均以未處理的粗脂肪酶液酶活為對照(相對酶活為100%),計算各處理條件下的相對酶活。其中,相對酶活為各處理條件下的酶活與未處理條件下酶活的比值。

1.3.10 脂肪酶水解位置特異性測定

參照劉光[16]使用的方法并稍做修改。具體方法：將1 mL三油酸甘油酯、2 mL Tris-HCl緩沖液、1 mL脂肪酶液在15 mL帶蓋離心管中混勻,50 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)1 h,加入2 mL乙醚萃取水解產(chǎn)物,12 000 r/min離心5 min,取上層液進行薄層色譜分析。展開劑體系為正己烷-乙醚-甲酸(體積比為70∶30∶1),碘熏蒸顯色。將三油酸甘油酯、1,3-二油酸甘油酯、1,2-二油酸甘油酯標準品用正己烷溶解后作為參照。

1.3.11 酶促反應(yīng)動力學

分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L的p-NPP溶液,按照1.3.3的方法測定酶活,以p-NPP濃度的倒數(shù)為橫坐標,酶活的倒數(shù)為縱坐標作Lineweaver-Burk圖,測定脂肪酶水解p-NPP的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率vmax。

1.4 數(shù)據(jù)分析

無特殊說明,本試驗所有數(shù)據(jù)均為3次試驗結(jié)果的平均值,使用平均值±標準差表示,采用Orign 8.5進行繪圖,采用SPSS 20.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗脂肪酶液的酶活和蛋白含量

利用M.aphidis發(fā)酵合成脂肪酶,離心去除菌體后得到粗脂肪酶液,其酶活為99.01 U/mL,蛋白含量為280.00 mg/L,比酶活為353.59 U/mg,比文獻[13]報道的最高酶活(35 U/mL)提高了64.01 U/mL。將此粗脂肪酶液用于后續(xù)的酶學性質(zhì)研究。

2.2 pH值對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響

注：同一條折線上的不同字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。圖2、圖3同。圖1 pH值對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of pH on lipase activity and stability

pH值對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響見圖1。由圖1可以看出,脂肪酶的相對酶活隨著緩沖液pH值的增大呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,在pH 8時脂肪酶表現(xiàn)出最大活性,相對酶活為100%,表明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶的最適反應(yīng)pH值為8。pH 5～6時脂肪酶酶活顯著降低,相對酶活不到1%,在pH 9～10時相對酶活保持在60%以上。研究表明,脂肪酶分子活性中心受到酸性環(huán)境的影響,導致部分基團解離受阻,影響脂肪酶與底物結(jié)合,反應(yīng)速率降低,導致酶活減小[17],多數(shù)微生物脂肪酶的最適反應(yīng)pH偏堿性[8,18-19]。以最適反應(yīng)pH 8為基礎(chǔ),分別測定不同pH值處理后的脂肪酶酶活,并計算出各相對酶活。分析M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶的pH穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)不同pH值處理后的脂肪酶相對酶活差別較小,說明脂肪酶在pH 5～10范圍內(nèi)具有一定的酸堿穩(wěn)定性,有利于儲藏和實際應(yīng)用。因此,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶更適合應(yīng)用于堿性環(huán)境中,屬于耐堿性脂肪酶。

2.3 溫度對脂肪酶活性和穩(wěn)定性的影響

溫度對脂肪酶活性的影響見圖2。由圖2可知,40～90 ℃范圍內(nèi),相對酶活隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在70 ℃時表現(xiàn)出最大的催化活性,此時相對酶活為100%,表明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃。當溫度為80 ℃和90 ℃時,相對酶活逐漸降低,但仍保留70%以上的相對活性,表明脂肪酶具有一定的耐高溫特性。溫度升高可以提升反應(yīng)體系活化能,使底物與脂肪酶之間有效碰撞增加,有利于酶活力提高。但溫度過高時,脂肪酶發(fā)生變性,酶活降低。

圖2 溫度對脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase activity

溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響見圖3。由圖3可知,-20～70 ℃下處理1～5 h的脂肪酶相對酶活均高于75%,表明其具有良好的熱穩(wěn)定性。70 ℃下處理1～4 h后相對酶活保持在80%以上,表明該脂肪酶具有耐高溫特性。90 ℃處理1 h后,相對酶活接近0%,時間延長后完全失活,表明該酶不能耐受90 ℃的高溫。說明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶能夠在較高反應(yīng)溫度條件下進行應(yīng)用。

圖3 溫度對脂肪酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of lipase

2.4 金屬離子對脂肪酶活性的影響

金屬離子對脂肪酶活性的影響見表1。由表1可以看出：Mn2+和Mg2+不同濃度下的脂肪酶相對酶活差別不大;隨著Ca2+濃度的升高,相對酶活逐漸增大;0.1、10 mmol/L Cu2+對脂肪酶的相對酶活具有顯著的抑制作用;隨著Fe2+、Fe3+、Zn2+濃度的升高,脂肪酶相對酶活逐漸降低,其中10 mmol/L Zn2+抑制作用最大,此時的相對酶活僅為3.81%±0.33%。因此,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶的實際應(yīng)用中應(yīng)該減少Ca2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+等金屬離子的濃度,且避免Zn2+的存在。

表1 金屬離子對脂肪酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on lipase activity

2.5 表面活性劑及抑制劑對脂肪酶活性的影響

吐溫-20、吐溫-80、阿拉伯膠等表面活性劑可以通過改變脂肪酶的三維構(gòu)象來影響酶活[20]。EDTA常作為蛋白酶抑制劑與金屬酶類分子中的金屬離子發(fā)生螯合作用,改變酶分子構(gòu)象從而抑制酶活。表面活性劑和抑制劑對脂肪酶活性的影響見圖4。由圖4可以看出,吐溫-20、吐溫-80、曲拉通-100和SDS均能明顯提高相對酶活,其中曲拉通-100的促進作用最顯著,相對酶活達152.36%±1.66%。阿拉伯膠和咪唑啉存在條件下,脂肪酶相對酶活受到顯著抑制,其中咪唑啉對脂肪酶活抑制作用最強,相對酶活僅為39.15%±1.95%。抑制劑EDTA對酶活無顯著的促進或抑制作用,說明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶不屬于金屬酶類,這與各種金屬離子的作用結(jié)果具有一致性。因此,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶在應(yīng)用中需要注意表面活性劑種類的選擇。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 表面活性劑及抑制劑對脂肪酶活性的影響Fig.4 Effects of surfactants and inhibitors on lipase activity

2.6 有機溶劑對脂肪酶活性的影響

有機溶劑可以改變脂肪酶的構(gòu)象,從而影響脂肪酶的功能和催化活性,大部分醇類對多數(shù)微生物脂肪酶活力具有促進作用。從表2可以看出,甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、DMSO等親水性有機溶劑對脂肪酶表現(xiàn)出一定的激活作用,其中,30%異丙醇可以將脂肪酶的相對酶活提高約30%?？赡苁且驗橹久阜肿颖砻娼Y(jié)構(gòu)親水,極性較大的親水性有機溶劑能夠促進酶與底物的結(jié)合[8,20]。在疏水性有機溶劑中,苯、甲苯、乙醚、正己烷能夠顯著提高脂肪酶催化活性,而脂肪酶在氯仿中孵育1 h后的相對酶活下降了約46%,呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。因此,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶對工業(yè)生產(chǎn)中多種常用有機溶劑具有良好的耐受性。

2.7 位置特異性測定

不同來源脂肪酶水解三油酸甘油酯的作用位點有所差異,常見的為sn-1,3專一性脂肪酶,僅作用于三油酸甘油酯的1位和3位酯鍵發(fā)生水解反應(yīng)[7,20]。sn-2的位置特異性脂肪酶較少,主要原因是2位酯鍵的空間位阻較大,結(jié)合困難,不易發(fā)生水解反應(yīng)。薄層色譜分析M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶作用三油酸甘油酯的水解產(chǎn)物,結(jié)果見圖5,水解反應(yīng)產(chǎn)物中同時出現(xiàn)了1,3-二油酸甘油酯和1,2-二油酸甘油酯,并且含量相近,說明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶水解三油酸甘油酯無位置特異性,催化效率較高。

表2 有機溶劑對脂肪酶活性的影響Table 2 Effects of organic solvents on lipase activity

a.三油酸甘油酯標準品;b.1,3-二油酸甘油酯標準品;c.1,2-二油酸甘油酯標準品;d.三油酸甘油酯的水解產(chǎn)物圖5 脂肪酶水解三油酸甘油酯反應(yīng)產(chǎn)物的薄層色譜Fig.5 Thin layer chromatogram of the reaction product of lipase hydrolysis of triglycerides

2.8 酶促反應(yīng)動力學

酶促反應(yīng)動力學中米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率vmax與脂肪酶種類以及作用底物有關(guān),Km越小,vmax越大,表示酶與底物結(jié)合能力越強,反應(yīng)越快[21]。以p-NPP為作用底物研究M.aphidis同源性菌株——黑曲霉合成脂肪酶的酶促動力學報道中,舒正玉等[22]表征AspergillusnigerF044合成脂肪酶的米氏常數(shù)Km為7.37 mmol/L,劉光[16]報道黑曲霉合成脂肪酶米氏常數(shù)Km為10 μmol/L,Romero等[23]研究黑曲霉MYA135合成脂肪酶的米氏常數(shù)Km為2.81 mmol/L。Osuna等[21]對Aspergillusniger合成脂肪酶的米氏常數(shù)Km為27.2 mmol/L。由圖6可知,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶水解p-NPP的米氏常數(shù)Km為1.14 mmol/L,顯著小于上述報道的黑曲霉脂肪酶水解p-NPP的米氏常數(shù),此時M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶的最大反應(yīng)速率vmax為119.05 mol/min,說明M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶與底物p-NPP具有更強的結(jié)合能力。

圖6 脂肪酶水解p-NPP的Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot of p-NPP hydrolysis by lipase

3 結(jié)論

對蚜蟲莫氏黑粉菌發(fā)酵合成的脂肪酶進行酶學性質(zhì)表征,明確了脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為70 ℃,pH值為8。Mg2+對脂肪酶酶活促進作用并不顯著,Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子對脂肪酶活力具有一定的抑制作用,其中Zn2+抑制效果最為顯著。吐溫-20、吐溫-80、曲拉通-100、SDS、阿拉伯膠等表面活性劑對脂肪酶活力具有顯著的促進作用。甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、乙醚、正己烷等大部分親水性和疏水性有機溶劑對脂肪酶活力具有促進激活的效果,但氯仿對脂肪酶酶活起到抑制作用。脂肪酶能夠同時水解三油酸甘油酯的1,3位和2位酯鍵,沒有水解位點特異性。同時,發(fā)現(xiàn)脂肪酶水解p-NPP的米氏常數(shù)Km為1.14 mmol/L,最大反應(yīng)速率vmax為119.05 mol/min。

與已報道的微生物脂肪酶相比,M.aphidis所產(chǎn)脂肪酶在-20～70 ℃條件下孵育5 h后能夠保持較高的催化活性,在酸性和堿性環(huán)境下保持良好的穩(wěn)定性,是一種性質(zhì)穩(wěn)定的耐高溫堿性脂肪酶。該脂肪酶水解三油酸甘油酯時無位置特異性,能夠同時水解多個酯鍵,水解效率高,在高溫、堿性和有機溶劑等環(huán)境條件下具有良好的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。