黃 震 曾 健 孫俊生

(1深圳市龍崗中心醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院辦公室；2深圳市龍崗中心醫(yī)院麻醉科；3深圳市龍崗中心醫(yī)院呼吸科 廣東深圳 518116)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種可通過呼吸道傳播的古老傳染病，耐藥結(jié)核病上升和免疫低下人群增加等因素卻給結(jié)核病防治帶來了沉重壓力[1]。面對嚴(yán)峻的結(jié)核病防治形勢，當(dāng)前各種結(jié)核病診治方法已逐漸不能滿足臨床的需求，尋找新的診斷標(biāo)志物和研發(fā)新的實(shí)驗(yàn)診斷方法已成為結(jié)核病研究亟待解決的難題。MPT64也被稱為MPB64[2]，由MTB基因組中的mpt64基因(即Rv1980c)編碼。該蛋白是MTB生長過程中向周圍環(huán)境分泌的一種蛋白質(zhì)，由228個(gè)氨基酸組成，大小約為24kD。MPT64存在于活躍復(fù)制的細(xì)菌細(xì)胞中，在培養(yǎng)初期大量分泌，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而減少[3]。 MPT64不存在于弱毒性的BCG菌株中，提示其可能 是AM毒力相關(guān)因子。MPT64參與機(jī)體與免疫系統(tǒng)的相互作用[4-5 ]，可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫反 應(yīng)，有可能作為診斷活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)志物[6 ]。

文章通過 結(jié)核分枝桿菌MPT64蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，純化重組的MPT64蛋白抗原，研究其免疫學(xué)特性，用ELISA法和免疫組化分別檢測抗體的效價(jià)和特異性，通過對結(jié)核淋巴結(jié)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析驗(yàn)證，探討MPT64在結(jié)核不同分期的表達(dá)情況，同時(shí)檢測了45例結(jié)核患者血清MPT64的表達(dá)，進(jìn)一步分析MPT64的表達(dá)與結(jié)核不同分期的相關(guān)性，探討檢測MPT64在結(jié)核診斷方面的初步應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

Balb/C小鼠由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。限制性內(nèi)切酶、T4連接酶及TaqDNA聚合酶等分子生物學(xué)試劑為QiaGen公司產(chǎn)品。表達(dá)載體pET28a和Ni2+-NTA凝膠為Invitrogen公司產(chǎn)品。大腸桿菌DH5ɑ及BL 21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG以及FITC標(biāo)記的抗人CD19抗體為Biolegen公司產(chǎn)品。常規(guī)試劑為分析純。引物合成及DNA序列測定委托上海Invitrogen生物工程公司完成。收取深圳市龍崗中心醫(yī)院2020年4月-2022年2月手術(shù)切除的結(jié)核淋巴結(jié)組織45例，項(xiàng)目開展通過深圳市龍崗中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 MPT64基因的克隆 從手術(shù)切除的淋巴結(jié)組織中抽提RNA，用RT-PCR擴(kuò)增MPT64編碼區(qū)基因。引物的序列如下：P1：5’-CGGGATCCTCCAACGTCCCCCA -3’(劃線部分為BamH I 酶切位點(diǎn))；P2：5’-GGAATTCCTCAGAAGATCCTCAC-3’(劃線部分為EcoR I 酶切位點(diǎn))。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳分析回收純化，用BamH I和EcoR I分別對PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ。挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，以BamH I、EcoR I 進(jìn)行雙酶切鑒定，將質(zhì)粒命名為pET28a/ MPT64

1.2.2 重組MPT64的表達(dá)與純化 以重組質(zhì)粒pET28a/ MPT64轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)，待菌液的OD600值達(dá)1.0時(shí)，加入IPTG (終濃度為0.8 mmol/L)，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心收集菌體，使用高壓均質(zhì)儀碎菌，經(jīng)過12000g離心10min，收集上清，用Ni2+-NTA凝膠柱進(jìn)行親和層析純化，以含200 mmol/L咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫純化，行SDS-PAGE分析。

1.2.3 抗MPT64抗體的制備、純化及鑒定 將純化的MPT64使用3kD超濾管離心除去咪唑、0.22μm濾器過濾除菌后，經(jīng)過Bradford法測定并調(diào)整蛋白的濃度為1 g/L，與等體積的弗氏完全佐劑乳化后免疫Balb/C小鼠。待末次免疫完畢后1周，使用毛細(xì)管內(nèi)眥取血并分離血清。以純化的重組MPT64 (5mg/L)包被ELISA板，用直接ELISA法檢測抗血清的效價(jià)。用Western blot鑒定抗體的特異性，即分別取未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌裂解物以及純化的重組蛋白(MPT64)進(jìn)行SDS-PAGE，以制備的抗血清(1：5 000)為一抗，兔抗鼠IgG-HRP(1∶5000)為二抗進(jìn)行反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.4 淋巴結(jié)組織表達(dá)MPT64 取45例將新鮮的組織按照病理切片的常規(guī)操作進(jìn)行，同一份組織切片使用H-E染色后進(jìn)行病理分期，一份使用制備的抗MPT64多克隆抗體(1：5000稀釋)作一抗，使用兔抗鼠IgG-HRP(1：5000)為二抗進(jìn)行反應(yīng)，DAS顯色后進(jìn)行評分。每組都包括適當(dāng)?shù)年栃约瓣幮詫φ?，認(rèn)為胞漿染色是陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包分析。由于蛋白表達(dá)的不常規(guī)分布，用非參數(shù)型檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)來評估三組組織中MPT64表達(dá)水平的不同，設(shè)置p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MPT64編碼區(qū)基因的擴(kuò)增及MPT64表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在約600bp與800bp之間可見一條特異帶，與預(yù)期的擴(kuò)增的目的基因片段的620bp大小相符。提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和BamH I、EcoR I 雙酶切鑒定后，擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切下來的片段同預(yù)期的片段的大小相符，經(jīng)進(jìn)一步測序鑒定，大小約為620bp。BLAST分析顯示，得到TSPA33編碼區(qū)基因，堿基無突變，閱讀框正確。將其片段酶切后連至質(zhì)粒pET28a，構(gòu)建得重組質(zhì)粒pET28a/MPT64，轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和BamH I、EcoR I 雙酶切鑒定后，測序結(jié)果顯示無堿基突變，閱讀框正確 (詳見圖 1)。

圖1 PCR獲得的MPT64基因行瓊脂糖凝膠電泳分析注：1：MPT64基因的RT-PCR產(chǎn)物；2：無模板對照；M：marker

2.2 重組 MPT64的表達(dá)、純化與鑒定

以表達(dá)質(zhì)粒pET28a/ MPT64轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到含重組質(zhì)粒的基因工程菌。行12% 濃度SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌在Mr約20～30kD之間有1條外源性高表達(dá)的蛋白條帶。該融合蛋白的Mr同預(yù)測的大小相吻合；而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌未見有外源蛋白表達(dá)的條帶，以pET28a載體轉(zhuǎn)化的菌株在IPTG誘導(dǎo)后也未見有外源性蛋白表達(dá)的條帶，表明 MPT64在大腸桿菌中得到高效表達(dá)。工程菌菌體裂解上清經(jīng)Ni2+-NTA凝膠柱純化獲取了重組 MPT64 (見圖2A)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得的重組MPT64蛋白，掃描分析其純度約為95%(見圖2B)。

圖 2 MPT64誘導(dǎo)表達(dá)后的SDS-PAGE鑒定及WB鑒定A：M：蛋白marker；1：無IPTG誘導(dǎo)的BL21(pET28a/ MPT64)；2：IPTG誘導(dǎo)的BL21(pET28a)；3，4，5：IPTG分別誘導(dǎo)1、2、3小時(shí)的BL21(pET28a/ MPT64)；3.IPTG誘導(dǎo)的BL21(pET28a)；B：純化后的MPT64蛋白

2.3 鼠抗人MPT64抗體效價(jià)測定

以純化的重組MPT64 (5 mg/L)包被ELISA板，以未經(jīng)MPT64免疫的Balb/C小鼠血清作為陰性對照，抗MPT64血清和未免疫血清按照1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000稀釋，以相同稀釋倍數(shù)的免疫血清測得OD450nm/未免疫血清測得的OD450nm最大值的稀釋度為其效價(jià)。發(fā)現(xiàn)在1∶32000時(shí)，其ODimmu/ODunimmu為6.78，即鼠抗人MPT64血清效價(jià)為1∶32000 (見圖3A)；經(jīng)純化的WB鑒定，發(fā)現(xiàn)制備的抗體能夠與純化的MPT64特異性結(jié)合(見圖3B)。

圖3 鼠抗MPT64血清效價(jià)的測定及特異性驗(yàn)證(A)*：在血清稀釋度同為1∶64000時(shí)，免疫小鼠血清測得的OD值/未免疫小鼠血清測得的OD值最大；(B)1：pET28a/ MPT64誘導(dǎo)、純化的MPT64經(jīng)免疫血清行WB鑒定

2.4 鼠抗人MPT64抗體在膀胱癌免疫組化中的應(yīng)用

以制備的兔抗人MPT64作為一抗，進(jìn)行免疫組化檢測。結(jié)果顯示，結(jié)核淋巴結(jié)組織其MPT64 表達(dá)遠(yuǎn)高于周圍正常組織 (見圖4A和4B)，表明所制備的抗體可與人MPT64特異性結(jié)合。而后根據(jù)不同分期與免疫組化對細(xì)胞膜表面MPT64的表達(dá)指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，可知浸潤期或進(jìn)展期，溶解播散期，吸收好轉(zhuǎn)期，硬結(jié)鈣化期與MPT64表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即隨著結(jié)結(jié)核病情治療好轉(zhuǎn)MPT64表達(dá)越低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

圖4 制備抗人MPT64在淋巴結(jié)免疫組化中的應(yīng)用注：(A)結(jié)核淋巴結(jié)組織MPT64 表達(dá)高；(B)正常淋巴結(jié)組織MPT64低表達(dá)。

表1 MPT64蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性

3 討論

目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的方法較多，如傳統(tǒng)的抗酸染色和分枝桿菌培養(yǎng)，較后出現(xiàn)的熒光定量PCR和噬菌體檢測法，還有抗原抗體檢測和干擾素釋放檢測等免疫學(xué)檢測方法，這些方法既有各自的優(yōu)點(diǎn)，但也存在某些不足，如檢測時(shí)間長、操作繁瑣或準(zhǔn)確性較低等。MPT64是MTB生長過程中分泌最多的蛋白之一，有研究者應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)對肺結(jié)核患者血清外泌體中的蛋白質(zhì)肽類進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)外泌體中包含20種能用于MTB檢測的蛋白質(zhì)，其中就包括MPT64、Ag85B等MTB分泌蛋白[7]。Liu Z等應(yīng)用自建的ELISA方法檢測肺結(jié)核患者血液中MPT64，其陽性率可達(dá)71.2%，明顯高于CFP10、ESAT6等其它分泌蛋白[8]。因此，MPT64作為MTB的一種抗原可用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷。

該研究用RT-PCR技術(shù)從手術(shù)切除的結(jié)核淋巴結(jié)中獲取了人MPT64編碼基因，并用pET28質(zhì)粒構(gòu)建了其原核表達(dá)載體，以純化的重組蛋白為免疫原免疫Balb/C小鼠，制備了效價(jià)高、特異性好的多克隆抗體，免疫組織化學(xué)染色檢測顯示該抗體能識別天然的人MPT64分子，具有良好的活性。該研究進(jìn)一步探討了MPT64蛋白在結(jié)核淋巴結(jié)組織中的表達(dá)。通過結(jié)核病浸潤期或進(jìn)展期，溶解播散期，吸收好轉(zhuǎn)期，硬結(jié)鈣化期不同分期MPT64的表達(dá)情況分析。結(jié)果顯示，MPT64在結(jié)核淋巴結(jié)中中表達(dá)高于正常淋巴結(jié)組織，而后根據(jù)不同分期與免疫組化對細(xì)胞膜表面MPT64的表達(dá)指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)核病情治療好轉(zhuǎn)MPT64表達(dá)越低，提示MPT64蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間有較好的相關(guān)性，對45例結(jié)核患者的血清進(jìn)行MPT64檢測，檢測陽性率高達(dá)77.8%。

研究者嘗試通過直接檢測痰液、淋巴結(jié)穿刺液[9]和胸腔積液[10]等標(biāo)本中的MPT64來實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的直接診斷。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過結(jié)核病浸潤期或進(jìn)展期，溶解播散期，吸收好轉(zhuǎn)期，硬結(jié)鈣化期不同分期MPT64的表達(dá)情況分析，提示MPT64蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間有較好的相關(guān)性。同時(shí)，進(jìn)一步比較MPT64在結(jié)核初治組與復(fù)治組MPT64的表達(dá)情況，最后與經(jīng)典的結(jié)核診斷ELISpot方法比較，發(fā)現(xiàn)MPT64是MTB分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，其作為結(jié)核病生物標(biāo)志物的價(jià)值在肺外結(jié)核病診斷中也得到了初步驗(yàn)證，加之該蛋白在結(jié)核病患者血液中的含量明顯高于其它分泌蛋白，其作為結(jié)核病血清診斷標(biāo)志物的價(jià)值已逐漸受到重視并得到初步發(fā)掘[11]。

綜上所述，血清及淋巴結(jié)組織標(biāo)本顯示MPT64檢測在結(jié)核病診斷中都具有較好的臨床性能，由于MPT64蛋白可被大多數(shù)結(jié)核患者和結(jié)核感染者的免疫系統(tǒng)所識別，既能誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，又能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)，是用于結(jié)核分枝桿菌診斷的良好指標(biāo)，可作為TB血清學(xué)及痰液診斷的備選抗原之一[12]。如將MPT64與其他特異性抗原聯(lián)合使用進(jìn)行血清學(xué)診斷，有望進(jìn)一步提高TB早期診斷的靈敏度。