唐玉鳳 姚 敏 何 昕 官 梅 劉忠松 官春云 錢(qián)論文

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南長(zhǎng)沙 410128

油菜是我國(guó)主要種植的油料作物, 其種植面積和產(chǎn)量居世界前列。到2020年, 我國(guó)已實(shí)現(xiàn)面積、總產(chǎn)、單產(chǎn)、含油量和雙低品質(zhì)“五齊升”, 但10年來(lái)我國(guó)菜籽油和菜粕產(chǎn)量低于消費(fèi)量, 導(dǎo)致我國(guó)每年進(jìn)口大量油菜籽來(lái)滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)需求。同時(shí), 隨著我國(guó)城市化進(jìn)程的加劇, 導(dǎo)致可用耕地面積逐漸減少[1]。因此, 提高油菜產(chǎn)量和籽粒含油量是解決國(guó)內(nèi)食用油內(nèi)需矛盾有效途徑之一。

葉綠素含量與光合能力有關(guān), 是光合作用的重要組成部分之一, 影響作物產(chǎn)量的重要生理特征[2-3]。梁穎等[4]研究發(fā)現(xiàn)油菜葉綠素含量是影響經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量和生物產(chǎn)量的主導(dǎo)因素。此外, 葉綠素含量不僅影響植物抗逆性、生長(zhǎng)和環(huán)境的適應(yīng)性, 同時(shí)也影響了含油量積累[5-6]。油菜種子和角果皮中葉綠素含量能直接影響光合磷酸化作用產(chǎn)生ATP和NADPH的量, 影響光合作用, 從而影響含油量的積累[7]。Hua等[8]研究表明在角果發(fā)育的過(guò)程中, 高葉綠素含量將會(huì)提高角果糖和淀粉含量等, 增加種子油脂積累。在油菜角果發(fā)育后期階段高效的光合作用也有利于含油量的積累[9]。提高作物光合作用可以從增加源的數(shù)量和改善質(zhì)的性能兩方面開(kāi)展,例如控制綠葉面積、培育優(yōu)良的株型、延長(zhǎng)植株高效光能期等, 即提高光合作用進(jìn)而提高產(chǎn)量的主要途徑[10]。

滯綠基因STAY-GREEN(SGR)是綠色器官衰老與成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子, 而滯綠基因SGR1是葉綠素降解的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因[11]。Thomas等[12]將滯綠分為5類(lèi), 其中SGR1/NYE1導(dǎo)致的滯綠類(lèi)型屬于C型,因?yàn)楣夂献饔煤退ダ线^(guò)程不受其突變顯著影響, 但后續(xù)的研究表明C型滯綠影響了植物的衰老, 如任均等[13]在滯綠的大豆種子中發(fā)現(xiàn)SGR導(dǎo)致的滯綠沒(méi)有顯著影響到葉片衰老進(jìn)程中光合作用效率的下降,但是明顯影響衰老葉片中蛋白的降解與轉(zhuǎn)運(yùn)。最近研究也表明, 在小白菜中發(fā)現(xiàn)的sgr突變體延緩了小白菜葉片的衰老, 能長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞膜及葉綠體類(lèi)囊體膜的結(jié)構(gòu)完整性及膜系統(tǒng)透性, 提高細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性, 使膜脂過(guò)氧化程度降低, 延長(zhǎng)了小白菜的貨架期[14]。

本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜SGR基因家族進(jìn)行分析,揭示SGR基因家族成員之間高度同源, 且在進(jìn)化過(guò)程中非常保守。利用關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到1個(gè)SNP定位在BnaSGR1a-A01的外顯子2區(qū)域, 并與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明BnaSGR1a-A01與BnaSGR2-A03直接相連, 與BnaSGR1-C01、BnaSGR1-A08、BnaSGR2-C03、BnaSGR1-C07、BnaSGRL-C06、BnaSGRL-A10等基因間接相連, 共同調(diào)節(jié)油菜葉綠素含量積累。BnaSGR1a-A01在擬南芥中超表達(dá)分析, 揭示了其調(diào)控葉綠素降解。

1 材料與方法

1.1 甘藍(lán)型油菜SGR基因家族鑒定與分析

用 staygreen作為關(guān)鍵詞在 Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)查詢(xún), 下載staygreen蛋白隱馬爾科夫模型, 使用hmmsearch指令進(jìn)行全基因組序列數(shù)據(jù)比對(duì), 利用BLASTP比對(duì)甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜基因組, 篩選出對(duì)應(yīng)的SGR候選同源基因。取BLAST和hmmsearch的交集結(jié)果, 確定候選基因。在SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)檢查候選基因是否含有staygreen結(jié)構(gòu)域。擬南芥、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的基因全長(zhǎng)序列、CDS序列、氨基酸序列等信息分別在Esembl Plants (http://plants.ensembl.org/index.html)和BRAD(http://brassicadb.cn/)獲取。在 GenomeNet (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)使 用 neighbourjoining (NJ)系統(tǒng)發(fā)育方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以及在Evolview (http://www.evolgenius.info/evolview/)進(jìn)行美化。在MEME (http://MEME.nbcr.net/MEME/cgibin/MEME.cgi)對(duì)擬南芥和甘藍(lán)型油菜SGR基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。使用ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)和ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/)預(yù)測(cè)分子量(molecular weight, MW)、等電點(diǎn)(pI)和亞細(xì)胞定位。利用TBtools[15]展示基因結(jié)構(gòu)、染色體定位結(jié)果及共線性分析。

1.2 試驗(yàn)材料和材料表型生理指標(biāo)測(cè)定

203份中國(guó)半冬性甘藍(lán)型油菜材料種植在德國(guó)吉森尤斯圖斯-李比希大學(xué)光照培養(yǎng)室。采用CCM-200葉綠素含量指數(shù)測(cè)定儀檢測(cè)葉片苗期和抽薹期的葉綠素含量。葉綠素含量指數(shù)測(cè)定儀測(cè)定在653 nm和931 nm處的吸光度。每個(gè)材料測(cè)定3個(gè)不同的植株。

1.3 葉綠素含量關(guān)聯(lián)分析

Qian等[16]研究中采用Q+K (population structure and kinship)的混合線性模型(mixed linear model,MLM), 利用TASSEL5.0[17]對(duì)203份甘藍(lán)型油菜的葉綠素含量進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析?；谧顑?yōu)模型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果, 利用R軟件包QQman (https://www.rdocumentation.org/packages/qqman/versions/0.1.2)繪制曼哈頓圖和 Quantile-Quantile散點(diǎn)圖(QQman plot)[18]。設(shè)定位點(diǎn)與性狀顯著關(guān)聯(lián)的閾值為P＜ 4。將與顯著SNP處于同一單體型塊(r2＞ 0.55)的區(qū)間, 定義為候選關(guān)聯(lián)區(qū)間。

50份中國(guó)半冬性油菜的全基因組重測(cè)序和SNP標(biāo)記的獲得已經(jīng)被詳細(xì)的描述[19-20]。利用R軟件包GenABEL[21](https://www.rdocumentation.org/packages/GenABEL/versions/1.8-0)對(duì)A01和C01染色體上與葉綠素相關(guān)的單體型進(jìn)行區(qū)域關(guān)聯(lián)檢測(cè)。R軟件包QQman被用于繪制曼哈頓圖和Quantile-Quantile散點(diǎn)圖。FDR (false discovery rate)值的計(jì)算是利用R語(yǔ)言中的q-value軟件包(http://www.Bioconductor.org/packages/release/bioc/qvalue.html), 最終確定在不同年份不同地點(diǎn)間的顯著水平的p值(p＜ 1×10-3)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

通過(guò)含油量等品質(zhì)性狀選擇了13份種子材料作為轉(zhuǎn)錄組分析的樣品。取發(fā)育15 d角果摘下立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在-80℃直至RNA提取。采用植物總RNA提取試劑盒DP432 (天根生化科技有限公司, 北京)提取極端材料角果的總RNA, 然后將樣品送北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建文庫(kù), 并以HiSeq 2000基因分析系統(tǒng)(Illumina公司, 美國(guó))進(jìn)行RNA-Seq PE100測(cè)序分析。將測(cè)序的結(jié)果比對(duì)到甘藍(lán)型油菜 Darmor-bzh reference genome (https://genomevolution.org/CoGe/)。

1.5 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

利用收集的13個(gè)半冬性油菜品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-seq)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析, 利用基因表達(dá)模式對(duì)基因進(jìn)行分類(lèi), 運(yùn)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析[22](weighted correlation network analysis, WGCNA)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 軟閾值設(shè)置為0.9, Pearson相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient, PCCs)大于或等于0.50的基因被用于CYTOSCAPE3.7.1進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[23]。

1.6 超表達(dá)載體構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

根據(jù)BnaSGR1a-A01基因序列設(shè)計(jì)引物19OV141-F與19OV141-1R, 擴(kuò)增19OV141T1片段。設(shè)計(jì)引物 19OV141-1F 與 19OV141-R, 擴(kuò)增19OV141T2片段。引物19OV141-F與19OV141R以19OV141T1和19OV141T2為模板, 重疊延伸PCR擴(kuò)增19OV141片段, 引物序列見(jiàn)表1。PC1300S載體用SacI與BamHI雙酶切處理并回收, 與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物19OV141進(jìn)行重組, 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,涂抗性平板。挑選克隆子搖菌, 引物19OV141-F與pCB-seqE菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆, 然后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。之后使用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥, 哥倫比亞野生型擬南芥(Columbia-0)為受體, 轉(zhuǎn)化植株收種后, 利用次氯酸鈉消毒后接種于含50 mg L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基中, 22℃ ± 2℃培養(yǎng)1周后, 挑選正常萌發(fā)的陽(yáng)性植株種植于土壤中, 培養(yǎng)管理至收種。剪取T1代轉(zhuǎn)化植株葉片, 利用T5 Direct PCR Kit (Plant)試劑盒及HPT II特異性引物檢測(cè)。

1.7 葉綠素含量測(cè)定

從OE-BnaSGR1-13、OE-BnaSGR1-14和對(duì)照植株中選取3株稱(chēng)取0.01 g擬南芥新葉, 加入1 mL 95%乙醇暗處浸提6 h至葉組織完全變白, 取浸提液測(cè)定OD649與OD665(95%乙醇為對(duì)照), 葉綠素計(jì)算公式[24]為:

1.8 BnaSGR基因表達(dá)情況檢測(cè)

參照植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取植物總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)下載BnaSGR1a-A01(BnaA01g12570D)序列, 通過(guò)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)該基因的qRT-PCR特異性引物。引物序列見(jiàn)表1。參照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配置20 μL的反應(yīng)體系: 2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR) 10 μL, cDNA模板1 μL, 正、反向引物(0.2 μmol L-1)各0.8 μL, 去離子水7.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性1 min; 95℃變性10 s, 55℃退火30 s,72℃延伸15 s, 循環(huán)數(shù)40個(gè)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。選用AtACT2(AT3G18780)作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt的方法分析目標(biāo)基因的表達(dá), qRT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果由PCR儀自帶軟件自動(dòng)導(dǎo)出, 利用GraphPad Prism 9作圖。

表1 本研究中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜SGR基因家族成員鑒定及性質(zhì)分析

利用4個(gè)AtSGR(At4G22920、AT4G11910、AT4G44000和AT4G11911)核苷酸和氨基酸序列分別在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索, 并結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守結(jié)構(gòu)域(conservative domain, CD)搜索分析, 最終獲得12個(gè)甘藍(lán)型油菜SGR基因(BnaSGR)、6個(gè)白菜SGR基因(BraSGR)、6個(gè)甘藍(lán)SGR基因(BoSGR), 其中12個(gè)基因定位到甘藍(lán)型油菜染色體上,BnaSGR同源基因之間長(zhǎng)度差異較大,BnaSGR1-C01最長(zhǎng)有5975 bp, 而B(niǎo)naSGLP-Cnn最短僅有983 bp。在甘藍(lán)中, 6個(gè)基因定位到染色體上,最長(zhǎng)的是BoSGR1-C01, 有 1252 bp, 最短的是BoSGLP-C02, 有982 bp。在白菜中, 有6個(gè)基因定位到染色體上,BraSGR1a-A01最長(zhǎng), 有5705 bp, 最短的BraSGR1b-A01僅有804 bp。它們的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度和基因相對(duì)分子質(zhì)量差異也較大。這些成員理論等電點(diǎn)均大于7, 表明SGR為堿性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明22個(gè)SGR蛋白定位在葉綠體, 2個(gè)定位在質(zhì)膜上(表2)。

2.2 擬南芥、白菜、甘藍(lán)及甘藍(lán)型油菜的SGR基因進(jìn)化樹(shù)和結(jié)構(gòu)分析

擬南芥、甘藍(lán)型油菜與白菜、甘藍(lán)都屬于十字花科蕓薹屬作物, 根據(jù)4個(gè)物種的SGR蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1), 直觀地反映出28個(gè)SGR家族成員的進(jìn)化和分組歸屬, 根據(jù)進(jìn)化樹(shù), 將SGR蛋白分為4個(gè)亞族(SGR1、SGR2、SGRL和SGLP)。在24個(gè)SGR基因中鑒定出2組Br-Bo-An-Cn同源基因?qū)?表 2), 即BnaSGR1a-A01、BraSGR1a-A01、BnaSGR1-C01、BoSGR1-C01和BnaSGR1-A03、BraSGR1-A03、BnaSGR1-Cnn、BoSGR1-C03。

SGR基因家族成員外顯子、內(nèi)含子分布(圖2)表明,SGRs的內(nèi)含子、外顯子分布有一定規(guī)律, 大部分基因有4個(gè)外顯子, 而B(niǎo)naSGR2-A03具有5個(gè)外顯子,BnaSGR1a-A01具有 6個(gè)外顯子,BnaSGR1b-A01只有3個(gè)外顯子,BnaSGR1-C01具有12個(gè)外顯子,BraSGR1a-A01具有11個(gè)外顯子, 最少的是BraSGR1b-A01, 只有2個(gè)外顯子。Motif分析發(fā)現(xiàn)位于同一亞族的成員其保守基序具有一定的相似性, 大部分基因具有Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5和Motif6, 而AtSGRL、BnaSGRL-A10、BnaSGRL-C06、BraSGRL-Scaffold000123、BoSGRLC06只具有Motif1、Motif2、Motif5,BnaSGR1b-A01、BraSGR1b-A01只具有Motif1和Motif6。說(shuō)明Motif的亞家族特異性分布可能導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜中BnaSGR基因的功能分化。

圖2 擬南芥、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜SGR基因的系統(tǒng)比較分析Fig. 2 Systematic comparative analysis ofSGRgenes ofArabidopsis thaliana,Brassica rapa,Brassica oleracea, andBrassica napuschromosomes

2.3 染色體定位及共線性分析

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為了進(jìn)一步揭示擬南芥、甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)SGR基因家族進(jìn)化關(guān)系, 對(duì)其進(jìn)行了染色體定位和共線性分析。染色體定位結(jié)果顯示(圖3), 12個(gè)BnaSGR基因全部定位到8條染色體上, 分布比較均勻, 每條染色體有1個(gè)或者2個(gè)BnaSGR基因, 沒(méi)有串聯(lián)重復(fù)事件。6個(gè)白菜BraSGR基因分布在A01、A03、A08和Scaffold000123上, 每條染色體有1個(gè)或2個(gè)BraSGR基因。6個(gè)BoSGR分布在C01、C02、C03、Scaffold000269和C07染色體上, 其中C03上有2個(gè)BoSGR基因, 而其他染色體上只有1個(gè)。大多數(shù)的An-Ar和Cn-Co同源基因?qū)哂邢嗨频娜旧w位置。

(圖3)

圖3 白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜染色體上SGR基因的分布Fig. 3 Distribution ofSGRgenes inBrassica rapa,Brassica oleracea, andBrassica napuschromosomes染色體編號(hào)標(biāo)記在每個(gè)染色體的左側(cè)。A和C分別是白菜和甘藍(lán)的染色體; chrA和chrC分別是甘藍(lán)型油菜的A亞組和C亞組染色體;Random意味著基因被隨機(jī)分配到一個(gè)特定的染色體上, chrCnn表示屬于C亞基因組但不確定染色體信息。The numbers of chromosomes are labeled on the left side of each chromosome. A and C are the chromosomes fromBrassica rapaandBrassica oleracea; chrA and chrC are the chromosomes of the A-subgenomes and C-subgenomes fromBrassica napus, respectively. Random means genes are distributed randomly to the specific chromosome, and chrCnn is unanchored scaffold that cannot be mapped to a specific chromosome from the C-subgenomes.

而共線性分析圖(圖4)顯示, 擬南芥、甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜4個(gè)物種之間, An和Cn亞基因組與相應(yīng)的二倍體Ar和Co基因組基本上是共線的。甘藍(lán)型油菜中,BnaSGR1-A03和BnaSGR1-C07、BnaSGR1-A08和BnaSGR1-Cnn與BnaSGRL-A10和BnaSGRL-C06,這3對(duì)同源基因緊密相連, 這可能是由于在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史中片段重復(fù)和染色體重排造成的。

圖4 甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、白菜和擬南芥的SGR基因共線性分析Fig. 4 Syntenic analysis ofSGRgenes inBrassica napus,Brassica oleracea,Brassica rapa, andArabidopsis thaliana同一條粉色曲線上的2個(gè)基因是甘藍(lán)型油菜內(nèi)的線性關(guān)系, 同一條綠色曲線是甘藍(lán)型油菜對(duì)白菜、甘藍(lán)的線性關(guān)系, 同一條棕色曲線是擬南芥對(duì)甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的線性關(guān)系。Syntenic analysis betweenBrassica napusshowed by pink lines. Syntenic analysis betweenBrassica napus,Brassica rapa, andBrassica oleraceaare indicated by green lines. Syntenic analysis amongArabidopsis thaliana,Brassica napus,Brassica rapa, andBrassica oleraceaare indicated by brown lines.

2.4 候選基因的關(guān)聯(lián)分析

在光照培養(yǎng)室中, 203份油菜苗期和抽薹期葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析, 選取-log10(P)＞4作為SNP標(biāo)記與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)的臨界值, 在A01染色體上檢測(cè)到一個(gè) 125 kb的單體型區(qū)域(6,193,165～6,317,757 bp) 與葉綠素含量相關(guān), 這個(gè)區(qū)間包含1個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的擬南芥同源基因BnaSGR1a-A01(BnaA01g12570D)。在C01染色體上檢測(cè)到一個(gè) 847 kb的單體型區(qū)域(9,059,861～9,906,618 bp) 與葉綠素含量相關(guān), 這個(gè)區(qū)間包含1個(gè)與葉綠素含量相關(guān)的擬南芥的同源基因BnaSGR1-C01(BnaC01g14360D) (圖5)。在擬南芥中, 已有研究表明SGR1是葉綠素降解的正調(diào)節(jié)因子,SGR1受各種衰老信號(hào)誘導(dǎo), 編碼一個(gè)全新的葉綠體蛋白,在植物中高度保守[25]。

圖5 203份油菜苗期和抽薹期葉綠素含量全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig. 5 Genome-wide association study of chlorophyll content at seedling and bolting stages in 203 rapeseed accessions單體型區(qū)域(6,193,165～6,317,757 bp)和單體型區(qū)域(9,059,861～9,906,618 bp)與葉綠素含量顯著相關(guān)。這2個(gè)單體型區(qū)域包含2個(gè)擬南芥直系同源基因BnaSGR1a-A01(BnaA01g12570D)和BnaSGR1-C01(BnaC01g14360D), 這些基因涉及到葉綠素合成。熱圖顯示了這些SNPs之間存在強(qiáng)的連鎖不平衡。水平紅色虛線表示臨界值(-log10(P)=4.0)。ss_GH: 在光照培養(yǎng)室調(diào)查苗期葉綠素含量指數(shù), bs_GH: 在光照培養(yǎng)室調(diào)查抽薹期葉綠素含量指數(shù)。Haplotype region (6,193,165-6,317,757 bp) and haplotype region (9,059,861-9,906,618 bp) were significant association with chlorophyll content. In these haplotype regions carrying two orthologues ofArabidopsisgeneBnaSGR1a-A01(BnaA01g12570D) andBnaSGR1-C01(BnaC01g14360D) are involved in chlorophyll biosynthesis process. The heat map spans the SNP markers in LD with the most strongly associated SNPs. The horizontal red dotted line represents the significant threshold (-log10(P)=4). ss_GH: chlorophyll content index in seedling stage (glasshouse experiments, 2012), bs_GH: chlorophyll content index in bolting stage (glasshouse experiments, 2012).

利用50重測(cè)序材料對(duì)這2個(gè)單體型區(qū)間進(jìn)行進(jìn)一步分析, 在A01染色體上的單體型區(qū)域, 檢測(cè)到1個(gè)SNP (chrA01: 6306874)定位在BnaSGR1a-A01基因區(qū)域的外顯子2區(qū)域, 并與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)(圖6-A, B)。通過(guò)比較BnaSGR1a-A01基因區(qū)域的2個(gè)等位基因G和T對(duì)應(yīng)的葉綠素含量和基因表達(dá)水平分析, 表明等位基因G對(duì)應(yīng)的材料顯示了高的葉綠素含量和基因表達(dá)水平(圖6-C, D)。

圖6 50個(gè)重測(cè)序材料葉綠素含量候選基因關(guān)聯(lián)分析Fig. 6 Association analysis of candidate genes for chlorophyll content within whole-genome resequencing of 50 accessionsA: 單體型(6,193,165～6,312,172 bp;r2=0.55)區(qū)域葉綠素含量的關(guān)聯(lián)分析。藍(lán)色虛線表示全基因組顯著性的閾值P值為1.0×10-3。B:BnaSGR1a-A01基因區(qū)域變異位點(diǎn)分析。該SNP chrA01:6306874定位于BnaSGR1a-A01基因外顯子2區(qū)域。C和D: 比較分析等位基因G和T對(duì)應(yīng)材料的表達(dá)和葉綠素表型分析。等位基因在群體中的頻率大于0.05將被用于此分析。箱型圖顯示了等位基因G對(duì)應(yīng)的材料有較高的葉綠素含量和相對(duì)高的基因表達(dá)水平。A: the regional association analysis of chlorophyll content in haplotype region (6,193,165-6,312,172 bp;r2=0.55). The blue dotted line indicates a thresholdP-value of 1.0×10-3for genome-wide significance. B: SNP chrA01:6306874 locates in exon two region ofBnaSGR1a-A01gene showed associated with chlorophyll content. C and D: the comparative analysis of allele G and T related to gene expression and chlorophyll content. Allele frequency greater than 0.05 in the population will be used for this analysis. The box plot showed that the allele G corresponding to inbred lines had higher chlorophyll content and gene expression level.

構(gòu)建含CaMV 35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體(圖7-A), 將G單倍型的基因轉(zhuǎn)入擬南芥中獲得BnaSGR1過(guò)表達(dá)株系。對(duì)野生型和超表達(dá)擬南芥一個(gè)月苗齡的第4～6片真葉進(jìn)行對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株葉片顏色較野生型變淺(圖7-B)。qRT-PCR結(jié)果表明(圖7-C), 轉(zhuǎn)基因擬南芥中,BnaSGR1a-A01的表達(dá)量顯著高于野生型。比較分析野生型和超表達(dá)擬南芥材料中葉片葉綠素含量(圖7-D～F)發(fā)現(xiàn), 超表達(dá)株系葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著低于野生型。表明BnaSGR1a-A01調(diào)控葉綠素降解。

圖7 BnaSGR1a-A01在擬南芥中超表達(dá)分析Fig. 7 Overexpression ofBnaSGR1a-A01inArabidopsisA: 超表達(dá)骨架載體示意圖; B: 野生型擬南芥與超表達(dá)擬南芥1個(gè)月苗齡第4～6片真葉對(duì)比, 標(biāo)尺為5 mm; C: 野生型擬南芥與超表達(dá)擬南芥的qRT-PCR檢測(cè); D～F: 野生型擬南芥與超表達(dá)擬南芥的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素測(cè)定。Col-0: 非轉(zhuǎn)基因植株,OE-BnaSGR1-13和OE-BnaSGR1-14: 轉(zhuǎn)基因植株。用Excel軟件的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(Student’st-test), *表示平均值間差異顯著(P＜ 0.05), **表示平均值間差異極顯著(P＜ 0.01), 誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。A: the schematic diagram of the overexpresed vector backbone; B: the comparison of one-month seedling age true leaves (No. 4-6) of Col-0 and OE lines, bar:5 mm; C: the qRT-PCR detection of Col-0 and OE lines; D-F: the determination of chlorophylla, chlorophyllband total chlorophyll in Col-0 and OE lines; Col-0: non-transgenic plant; OE-BnaSGR1-13,OE-BnaSGR1-14: transgenic plant. *:P＜ 0.05; **:P＜ 0.01.Error bars indicate the standard derivations.

2.5 BnaSGR1a-A01共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證BnaSGR1a-A01基因的功能,利用13個(gè)半冬油菜品種角果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖8-A)。GO分析結(jié)果(圖8-C) 表明BnaSGR1a-A01與葉綠素分解代謝過(guò)程、色素分解代謝過(guò)程、含卟啉化合物分解代謝過(guò)程和四吡咯分解代謝過(guò)程等顯著相關(guān)?；诠δ茏⑨尠l(fā)現(xiàn)在局部共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中(圖8-B), 3種主要類(lèi)型基因聚類(lèi)與BnaSGR1a-A01基因相關(guān), 包括葉綠素(32個(gè))、光系統(tǒng)(36個(gè))和轉(zhuǎn)錄因子(25個(gè))等。其中BnaSGR1a-A01直接與BnaSGR2-A03和BnaSOX-C02等基因相連,間接與BnaSGR2-C03、BnaSGR1-A08、BnaSGRLC06、BnaSGR1-C01、BnaSGR1-C07、BnaSGRL-A10相連。

圖8 BnaSGR1a-A01基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 8 Co-expression network analysis ofBnaSGR1a-A01genesA: 甘藍(lán)型油菜長(zhǎng)角果中BnaSGR1a-A01的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。紅色節(jié)點(diǎn)表示BnaSGR候選基因, 青綠色三角形節(jié)點(diǎn)代表著與BnaSGR基因直接相連接的基因。B: 在甘藍(lán)型油菜長(zhǎng)角果中的部分BnaSGR1a-A01共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)?；诠δ茏⑨?BnaSGR1a-A01共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的基因被分為以下3類(lèi): 葉綠素(淺藍(lán)色節(jié)點(diǎn))、光系統(tǒng)(青綠色節(jié)點(diǎn))和轉(zhuǎn)錄因子(深橄欖綠節(jié)點(diǎn))。C:BnaSGR1a-A01基因GO pathway分析網(wǎng)絡(luò)。顏色的深淺表示BnaSGR1a-A01與這些代謝路徑相關(guān)性的強(qiáng)弱。A: the co-expression network ofBnaSGR1a-A01in the silique ofBrassica napus. Red nodes representBnaSGRgenes, turquoise triangle node represent these genes directly correlation withBnaSGRgenes. B: the partly co-expression network ofBnaSGR1a-A01in the silique ofBrassica napus. Based on the functional annotation, the genes in theBnaSGR1a-A01co-expression network are classified into the following three groups: chlorophyll (light blue nodes), photosystem (turquoise nodes), and transcription factors (darkolivegreen nodes). C: GO pathway ofBnaSGR1a-A01co-expression networks. Deep yellow represents thatBnaSGR1a-A01is significant correlation with these metabolism process.

3 討論

本研究基于模式作物擬南芥中AtSGR1基因序列及甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)的基因組序列, 在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)全基因組范圍內(nèi)分別鑒定到了12個(gè)、6個(gè)和6個(gè)SGR基因家族成員, 它們都含有保守的SGR結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)鑒定到的甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)中的SGR基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn), 全部成員蛋白的等電點(diǎn)大于7, 家族成員以4個(gè)外顯子為主。此前在甜瓜中報(bào)道的SGR基因家族成員等電點(diǎn)也大部分大于7, 外顯子和內(nèi)含子組成也與本研究較一致, 以4個(gè)外顯子和3個(gè)外顯子2種為主[26]。通過(guò)Motif預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)擬南芥和甘藍(lán)型油菜家族成員都含有Motif1, 說(shuō)明Motif1是SGR基因家族的特征性Motif, staygreen domain位于Motif1。

模式植物擬南芥和甘藍(lán)型油菜都是屬于十字花科蕓薹屬, 親緣關(guān)系較近, 鑒于擬南芥AtSGR1在葉綠素降解代謝調(diào)控過(guò)程中的重要性。本研究通過(guò)單體型區(qū)域關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到BnaSGR1a-A01與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián), 并挖掘優(yōu)異等位基因, 為油菜葉綠素含量遺傳改良提供了有應(yīng)用價(jià)值的新基因資源。此外, 在擬南芥中超表達(dá)BnaSGR1a-A01基因, 發(fā)現(xiàn)超表達(dá)植株葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量顯著低于野生型, 表明BnaSGR1調(diào)控葉綠素降解。目前, 已在擬南芥、水稻、胡椒、番茄、豌豆、香蕉、小白菜等植物中, 發(fā)現(xiàn)SGR1同源基因突變延緩了葉綠素降解[6,14,27-30]。

此外, 本研究構(gòu)建BnaSGR1a-A01的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)BnaSGR1a-A01和BnaSGR2-A03直接相連, 并通過(guò)BnaSGR2-A03間接與BnaSGR2-C03、BnaSGR1-A08、BnaSGRL-C06、BnaSGR1-C01、BnaSGR1-C07、BnaSGRL-A10相連。Wu等[31]表明擬南芥中SGR2作為SGR1同源基因, 在葉綠素降解中起積極作用。SGRL在體內(nèi)與SGR1和SGR2形成同/異源二聚體,并與LHCII和葉綠素分解代謝酶相互作用調(diào)節(jié)葉綠素降解[32]。BnaSGR1a-A01和BnaATSO-C02直接連接,BnaATSO-C02與擬南芥中參與編碼亞硫酸鹽氧化酶的ATSO基因同源, 研究表明[33], 亞硫酸鹽氧化酶表達(dá)被抑制時(shí), 會(huì)導(dǎo)致葉片黃化與葉綠素含量下降。這些研究結(jié)果表明BnaSGR基因形成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)體系, 共同調(diào)節(jié)油菜葉綠素含量。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法在全基因組水平上對(duì)甘藍(lán)型油菜SGR家族成員進(jìn)行了分析, 表明甘藍(lán)型油菜SGR基因家族成員之間具有線性關(guān)系, 高度同源, 且在進(jìn)化過(guò)程中非常保守。此外, 區(qū)域關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到1個(gè)SNP定位在BnaSGR1a-A01的外顯子2區(qū)域, 并與葉綠素含量顯著關(guān)聯(lián)。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果驗(yàn)證了BnaSGR1a-A01與BnaSGR2-A03直接相連, 與BnaSGR1-C01、BnaSGR1-A08、BnaSGR2-C03、BnaSGR1-C07、BnaSGRL-C06、BnaSGRL-A10等基因間接相連形成了一個(gè)網(wǎng)絡(luò)體系, 共同調(diào)節(jié)葉綠素含量。BnaSGR1a-A01轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證分析結(jié)果表明,BnaSGR1調(diào)控葉綠素降解。研究結(jié)果有利于我們挖掘有利的基因資源, 為高葉綠素含量的油菜改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。