陳璐，周喆，王升啟

軍事醫(yī)學(xué)研究院生物信息中心，北京 100850

牙齒和骨骼組織由于結(jié)構(gòu)特殊而具有很強(qiáng)的抗腐敗能力，在許多復(fù)雜案例中，如歷史人物鑒定、失蹤人員調(diào)查、重大災(zāi)難處理、戰(zhàn)爭(zhēng)遺骸鑒定等，往往是可用于DNA 分析的唯一生物檢材[1-3]。牙齒和骨骼中含有大量無機(jī)成分，起到長(zhǎng)久保存DNA 的作用，即使檢材白骨化或者被破壞，仍可提供DNA 用于檢測(cè)。同時(shí)，這些無機(jī)成分使得牙齒和骨骼類樣本需要特殊的預(yù)處理和提取方法釋放和回收DNA。通常情況下，牙齒和骨骼檢材的DNA 鑒定步驟包括取材和研磨，脫鈣和裂解，DNA 純化和定量，擴(kuò)增和片段分析。然而，在實(shí)際檢案中，死后間隔數(shù)年至數(shù)十年的骨骼和牙齒在被發(fā)掘前，可能已長(zhǎng)久暴露在外界復(fù)雜的環(huán)境中，鑒定人員面臨陳舊骸骨DNA 含量極少、高度降解、嚴(yán)重污染、抑制因素干擾等嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[4-5]。本文綜合了近年來的相關(guān)研究成果和案例報(bào)道，從采集檢材、DNA 提取、DNA 富集和檢測(cè)分析方案等方面進(jìn)行綜述，為法醫(yī)學(xué)陳舊骸骨DNA 研究和鑒定、法醫(yī)考古分子研究、人類學(xué)分子研究等提供參考。

1 骨骼選材

根據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（International Society for Forensic Genetics，ISFG）的DNA 委員會(huì)針對(duì)災(zāi)難遇害者身份鑒定的建議[4]，對(duì)于跨越數(shù)周或更長(zhǎng)時(shí)間的樣本收集或在不利的環(huán)境條件下，骨骼和牙齒樣本是最可靠的DNA 來源。骨骼和牙齒是自然狀態(tài)下保留時(shí)間最久的生物樣本，法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場(chǎng)勘驗(yàn)員應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)條件判斷和選取可以提供更多遺傳信息的檢材。牙齒是人體內(nèi)最堅(jiān)硬的組織之一，完整的牙齒樣本封閉性強(qiáng)，微生物群影響低，利于DNA 保存。牙齒選材一般原則為選擇非離體、封閉、完整的磨牙[6]。人體共計(jì)206 塊骨骼，這些骨骼在個(gè)體間、不同類型間、同一類型不同部位間DNA 含量和抗降解能力均存在差異[7]。一般情況下，選材以承重部位長(zhǎng)骨的致密皮質(zhì)骨為首選，松質(zhì)骨可能也含有豐富的DNA，但抗降解能力差，保存DNA 能力有限[4]。

近20 年來，首選長(zhǎng)骨作為陳舊骨骼身份鑒定的DNA來源已經(jīng)成為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的共識(shí)[7-8]。美國(guó)武裝部隊(duì)DNA 鑒定實(shí)驗(yàn)室（Armed Forces DNA Identification Laboratory，AFDIL）于1994—2004 年處理了約2 000 份二戰(zhàn)期間、越南戰(zhàn)爭(zhēng)期間人類骸骨和牙齒樣本，結(jié)果顯示，承重的長(zhǎng)骨（如股骨、脛骨、跖骨）是最好的標(biāo)本類型，尤其長(zhǎng)骨皮質(zhì)最密集的部分效果最佳。松質(zhì)骨常因暴露在環(huán)境中受到破損和污染，孔隙難以徹底清理，DNA 提取效果不如致密的皮質(zhì)骨[8]。研究人員比較了股骨和脛骨5 個(gè)解剖位置的DNA 回收情況和STR 圖譜，包含近端干骺端、近端骨干、骨干中段、遠(yuǎn)端骨干和遠(yuǎn)端干骺端，結(jié)果顯示，股骨的DNA 回收率明顯高于脛骨，其中股骨中段和遠(yuǎn)端骨干可得到完整的STR 圖譜[9]。一些死后間隔時(shí)間較短的骨骼鑒定意見支持首選松質(zhì)骨[7,10]。MUNDORFF 等[10]從3 具白骨化的骸骨中提取55 個(gè)骨骼部位的DNA，比較單個(gè)個(gè)體骨骼樣本不同位置的DNA 產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小的松質(zhì)骨平均每單位質(zhì)量骨粉產(chǎn)生的DNA 數(shù)量比致密的皮質(zhì)骨高得多，該結(jié)果在另外10 例骨骼樣本中也得到支持，該研究所用樣本為死后3～21 年骸骨。另一項(xiàng)對(duì)死后間隔4 年的49 例不同類型骨骼的研究[7]結(jié)果表明，足部的小型松質(zhì)骨優(yōu)于其他類型，認(rèn)為這可能是由于骨骺線間的軟組織殘留物在細(xì)菌所形成的生物膜下保存良好，使得DNA 未被降解[2]。綜合文獻(xiàn)，當(dāng)僅考慮死后間隔時(shí)間時(shí)，如死后間隔大于50 年，首選長(zhǎng)骨的骨皮質(zhì)回收DNA，如死后間隔小于20 年，松質(zhì)骨更佳。

隨著各類疑難案例中陳舊骨骼樣本鑒定需求的增加，陳舊骨骼DNA 高度降解、嚴(yán)重污染成為DNA 檢測(cè)的最大挑戰(zhàn)。借鑒古人類DNA 研究，人類顳骨巖部作為鑒定檢材逐漸被法醫(yī)學(xué)界引入和嘗試[2,11-14]。顳骨巖部位于顱底蝶骨和枕骨之間，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最硬和最致密的骨骼[15]。2014年，GAMBA 等[16]分析了13例意大利考古遺址挖掘的遺?。◤墓?700年到公元前800 年）中顳骨巖部、牙本質(zhì)、股骨、肋骨、掌骨和跖骨的內(nèi)源性DNA 產(chǎn)量，結(jié)果顯示，顳骨巖部DNA產(chǎn)量最高，更適合降解樣本，認(rèn)為這可能與高密度顳骨巖部導(dǎo)致細(xì)菌介導(dǎo)的DNA 減少有關(guān)[17]。PINHASI等[18]進(jìn)一步比較了顳骨巖部3個(gè)區(qū)域的內(nèi)源性DNA 產(chǎn)量，即小梁骨的海綿部分、環(huán)繞骨質(zhì)內(nèi)耳的皮質(zhì)骨致密部分和耳囊內(nèi)致密部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耳囊內(nèi)DNA數(shù)量為環(huán)繞骨質(zhì)內(nèi)耳的皮質(zhì)骨致密部分的65倍，為小梁骨海綿部分的177倍。最近，有研究[2]分析了3具完整的第二次世界大戰(zhàn)期間骸骨，得到了相同結(jié)果，即所有骨骼中顳骨巖部耳囊內(nèi)致密部位的DNA 產(chǎn)量較高。該研究團(tuán)隊(duì)還認(rèn)為，第三掌骨和跖骨DNA 回收效果良好，取樣簡(jiǎn)單，減少了潛在的DNA 污染，在發(fā)掘的骸骨樣本較完整時(shí)可以采用[13]。當(dāng)生物檢材極難獲取時(shí)，除上述骨骼類型外，第一肋骨近端或椎體末端[19]，第12 胸椎的板層和棘突處[20]，腳部楔形骨、遠(yuǎn)端腳趾骨、距骨[21]等也被證實(shí)可用于骸骨DNA 鑒定，而顱骨碎片可能最難獲得有效序列數(shù)據(jù)[8]。

綜上所述，陳舊骸骨檢材選取股骨、脛骨承重骨的皮質(zhì)部位提取DNA 效果最佳，并且方便識(shí)別、保存和運(yùn)輸。在有完整顱骨檢材時(shí)，采集顳骨巖部也是值得推薦的選擇。當(dāng)以上骨骼部位均不可采集時(shí)，椎骨、距骨、掌骨等均有采集價(jià)值。

2 DNA 準(zhǔn)備

2.1 DNA 提取

人類骨骼組織主要由骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞組成，其細(xì)胞間質(zhì)主要由膠原和羥基磷灰石構(gòu)成，膠原約占骨質(zhì)量的30%，羥基磷灰石約占骨干質(zhì)量的65%～75%[22]。因此，骨組織抗腐敗降解能力強(qiáng)但同時(shí)高度鈣化增加了骨組織DNA 的回收難度。理想的骸骨DNA 提取效果是消耗少量骨粉獲得高質(zhì)量DNA。因此，DNA 提取過程應(yīng)盡量減少和簡(jiǎn)化提取步驟，以避免DNA 的進(jìn)一步降解和污染，從而實(shí)現(xiàn)DNA 提取快速、高效、簡(jiǎn)便、純凈。傳統(tǒng)的骨骼、牙齒DNA 提取方法主要分為去礦物質(zhì)、裂解和純化三步。去礦物質(zhì)又稱脫鈣，其基于一個(gè)前提，即DNA 被緊密地結(jié)合在密集的骨結(jié)晶聚合體中，沒有脫鈣處理，DNA 就不會(huì)被釋放到溶液中[23]。樣本脫鈣后，利用蛋白酶K 裂解細(xì)胞釋放DNA，最后以過濾柱[8,24]、磁珠[25-26]純化回收DNA。

經(jīng)典的骨骼DNA 提取方案[8]為向1～2 g 骨粉中加入3 mL 提取液[10 mmol/L Tris，pH=8.0；100 mmol/L NaCl，50 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra-acetic acid，EDTA），pH=8.0；0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）]和100 μL 20 mg/mL蛋白酶K，充分混勻后56 ℃輕輕振蕩過夜。次日，利用有機(jī)溶劑（V苯酚：V氯仿：V異戊醇=25∶24∶1）進(jìn)行DNA 純化和濃縮。但此方法不能完全去除礦物質(zhì)，即非完全脫鈣法，且其孵育過程中需要更換脫鈣液或脫鈣后移取上清液，增加了操作步驟且易損失DNA。因此，LOREILLE 等[27]提出完全脫鈣法，即每克骨粉中加入15 mL 提取液（0.5 mol/L EDTA 和1%月桂醇-肌氨酸鈉）和200 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，至骨粉完全物理溶解后采用有機(jī)試劑法回收DNA。該方法較非完全脫鈣法的DNA 提取率平均提高約4.6 倍[28]。SEO 等[24]利用上述DNA 提取方法，通過比較2 mL 和9 mL 的脫鈣液，結(jié)果同樣支持完全脫鈣處理能夠回收更多DNA。董慧婷等[29]比較了不同濃度EDTA 脫鈣液對(duì)骨骼DNA的提取效率，結(jié)果表明，0.5 mol/L EDTA 在3～24 h內(nèi)效率均最高。研究[24]發(fā)現(xiàn)，QIAquick?離心柱不僅回收更多DNA，并且含PCR 抑制物少，STR 分型效果更好。Qiagen MinElute 柱提法試劑盒作為一種骨骼DNA 純化方案，旨在回收高質(zhì)量DNA 的同時(shí)，降低脫鈣液中抑制劑的干擾。但有研究[30]報(bào)道，Qiagen MinElute 柱提取DNA 損失率為21.75%～60.56%，且不擅長(zhǎng)回收較小片段。

近年骨骼和牙齒DNA 提取方案在快速、高效方面也取得了進(jìn)步。LIU 等[31]提出了一種簡(jiǎn)便快速的有機(jī)試劑提取和磁珠回收骨骼DNA 方案，該方案在6 h內(nèi)可以完成1 g 陳舊骨粉DNA 提取，大大縮短了骨骼DNA 的提取時(shí)間。美國(guó)Promega 公司新研制的骨骼脫鈣緩沖液可在4 h 內(nèi)成功提取25 mg 新鮮骨粉DNA，如果配合自動(dòng)DNA IQTM工作流程將提高提取效率[31]。PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒是美國(guó)Applied Biosystems 公司專門為處理具有挑戰(zhàn)性的法醫(yī)學(xué)樣本（如骨頭、牙齒、煙頭、口香糖、信封蓋和磁帶等）而設(shè)計(jì)，被廣泛采用[32-34]。該方法一次最大樣本量為50 mg 的骨粉或牙粉，經(jīng)PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒裂解，1.0 mol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和蛋白酶K 混合混勻，在56 ℃孵育2 h 后，即可進(jìn)入磁珠結(jié)合、洗滌、洗脫步驟。該方法相較傳統(tǒng)的脫鈣提取法，大大減少了孵育時(shí)間，并且在大樣本量提取需求時(shí)結(jié)合工作站，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取，如利用PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒和AutoMate ExpressTM系統(tǒng)[35-36]，可在3 h 內(nèi)完成骨骼DNA提取。

2.2 DNA 修復(fù)

隨著大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)檢測(cè)低水平變異頻率的閾值降低，死后50 年以上的陳舊骸骨DNA 被證明存在干擾后續(xù)遺傳標(biāo)記檢測(cè)及其結(jié)果解釋的損傷[37-38]。考古學(xué)中，骸骨DNA 常見胞嘧啶脫氨損傷，即C→T、G→A改變。有研究[39]證明，這類DNA 損傷中的尿嘧啶可以被尿嘧啶-N-糖基化酶（uracilN-glycosylase，UNG）有效去除。NEBNext 甲醛固定和石蠟包埋組織DNA 修復(fù)試劑盒不僅可以切除脫氨氮胞嘧啶殘基，還可以修復(fù)雙鏈DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）以保留用于PCR 的長(zhǎng)片段。未經(jīng)處理的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）PCR 擴(kuò)增子序列中檢見高達(dá)850 個(gè)因胞嘧啶脫氨導(dǎo)致的C→T、G→A改變，而經(jīng)該試劑盒修復(fù)的DNA 結(jié)果中此類變異降低為10 個(gè)[37]。PreCRTM修復(fù)混合液可以修復(fù)氧化性損傷DNA 和紫外線照射性損傷DNA，表現(xiàn)為修復(fù)后DNA 的STR 檢測(cè)信號(hào)增加。但是在陳舊骸骨DNA 上絕大多數(shù)基因座檢測(cè)信號(hào)卻減少了，表明骸骨樣本可能包含多種類型損傷，而PreCRTM酶只適用于雙鏈構(gòu)象DNA[40-41]。綜上，損傷DNA 修復(fù)既可以產(chǎn)生更好的檢測(cè)結(jié)果以幫助結(jié)果解釋，還可以節(jié)省樣本和反復(fù)實(shí)驗(yàn)的消耗成本，可以在實(shí)踐中考慮使用。

綜上所述，陳舊骸骨DNA 提取關(guān)鍵在于降低污染和最大程度回收DNA。當(dāng)樣本條件差時(shí)，取0.5～1 g骨粉單次提取可以減少樣本暴露和轉(zhuǎn)移，采用完全脫鈣處理能夠盡可能釋放殘余DNA，最后可經(jīng)過柱提法或磁珠法純化回收。當(dāng)樣本數(shù)量眾多且保存條件尚可時(shí)，可以采用PrepFilerTMBTA 法醫(yī)DNA 提取試劑盒，骨粉投入量?。?5 mg），且結(jié)合磁珠法能夠?qū)崿F(xiàn)批量自動(dòng)化提取，效率高。此外，DNA 修復(fù)處理能夠在一定程度上提高某類損傷DNA 的鑒定結(jié)果質(zhì)量，建議用于陳舊骨骼DNA 個(gè)體識(shí)別鑒定。

3 目標(biāo)片段分析方法

陳舊骸骨檢材的個(gè)體識(shí)別鑒定策略包括片段分析和序列分析。片段分析即特定遺傳標(biāo)記檢測(cè)，如STR、miniSTR、SNP 等；序列分析指測(cè)序獲得樣本部分或全部序列信息，如Sanger 測(cè)序mtDNA 高變區(qū)序列。由于陳舊骸骨內(nèi)源性DNA 數(shù)量有限且常伴隨DNA 降解和損傷，為獲取足夠可信的DNA 分型數(shù)據(jù)需要在檢測(cè)前進(jìn)行目標(biāo)DNA 片段富集。常用的DNA片段富集方法為多重PCR 技術(shù)和雜交捕獲技術(shù)，不同的富集技術(shù)需要結(jié)合特定的檢測(cè)方法。本部分重點(diǎn)介紹以下幾種富集技術(shù)與檢測(cè)方法的組合及應(yīng)用。

3.1 多重PCR-毛細(xì)管電泳

多重PCR 技術(shù)可以同時(shí)擴(kuò)增成百上千條特定序列，高效利用有限的DNA，同時(shí)兼容多種遺傳標(biāo)記，如STR、miniSTR、SNP 等，適用于高度降解DNA。目前，基于毛細(xì)管檢測(cè)平臺(tái)的商品化STR 身份鑒定系統(tǒng)在陳舊骸骨DNA 鑒定案例中仍為首選。早期案例中通常聯(lián)合多種STR 遺傳標(biāo)記以增加檢出的基因座，如2015 年，10 例二戰(zhàn)期間位于波斯尼亞和黑塞哥維那的遺骸樣本經(jīng)15 個(gè)常染色體STR 和23 個(gè)Y-STR 分型，其中9 例獲得有價(jià)值的常染色體STR 圖譜，成功用于死后70 年的受害者身份鑒定，親屬匹配率達(dá)60%[42]。另1 例報(bào)道[34]中，335 名意大利人在二戰(zhàn)期間于羅馬附近被德國(guó)納粹屠殺，法醫(yī)專家小組經(jīng)過多種STR 基因座分型，確認(rèn)了其中323 名受害者（成功率為96.42%）。1990—2018 年，AFDIL 對(duì)2 177 份骸骨和1 656 顆牙齒進(jìn)行了分析鑒定以尋找戰(zhàn)爭(zhēng)中失蹤的美軍人員，主要依靠聯(lián)合應(yīng)用多重?cái)U(kuò)增常染色體STR、Y-STR、miniSTR、mtDNA 等遺傳標(biāo)記[5]。2021 年，鑒定人員采用21 個(gè)常染色體STR 和23 個(gè)Y-STR 分型，完成了2 例土埋40 余年股骨的親權(quán)鑒定分析[43]。

2021 年以來，多項(xiàng)陳舊骸骨鑒定研究[7,20,44]采用美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司推出的六色熒光標(biāo)記試劑盒GlobalFilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒[45]，其包含所有DNA 聯(lián)合索引系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）基因座、歐洲常用STR 和10 個(gè)miniSTR，不僅具有全球DNA 數(shù)據(jù)庫兼容性，還專門針對(duì)降解DNA、痕量DNA 和低水平DNA 樣本。因此，GlobalFilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒作為單個(gè)STR 鑒定系統(tǒng)，因涵蓋多種STR 基因座且便捷省時(shí)成為熱門選擇。此外，ZUPANI? PAJNI? 等[44]嘗試用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)GlobalFilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒中的基因座序列，不僅提高了單獨(dú)應(yīng)用毛細(xì)管電泳分型無法獲得的圖譜比例，還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)序列雜合性等位基因。值得注意的是，陳舊的骨骼和牙齒檢材通常攜帶環(huán)境微生物，從而產(chǎn)生微生物來源偽峰，這類偽峰在骨骼和牙齒的STR 圖譜中并不罕見[46]，因此，正確認(rèn)識(shí)此類現(xiàn)象并且準(zhǔn)確解釋STR 圖譜非常重要。

3.2 mtDNA 擴(kuò)增-Sanger 測(cè) 序

mtDNA 拷貝數(shù)目多、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高突變區(qū)變異頻率高，是檢測(cè)微量、高度降解骸骨和牙齒樣本的常用遺傳標(biāo)記。mtDNA 具有母系遺傳特點(diǎn)，常與STR、SNP 遺傳標(biāo)記聯(lián)合使用，起到排除或不排除母系關(guān)系的作用。鑒定應(yīng)用中，通常擴(kuò)增和測(cè)序mtDNA 的高變區(qū)（hypervariable region，HV）Ⅰ、HVⅡ 2個(gè)片段便可以得到理想效果，如斯洛文尼亞的萬人坑中，88例受害者殘骸中的HVⅠ和HVⅡ檢出率分別達(dá)到95%和98%，這些殘骸距身份鑒定已間隔65 年（1945—2010 年）[47]。俄國(guó)沙皇遺骨鑒定案例中，骸骨在死后73 年被發(fā)現(xiàn)，英國(guó)法庭科學(xué)服務(wù)部通過比對(duì)每具骸骨的mtDNA 控制區(qū)740 bp 序列和俄皇后母系直系后裔曾外甥的mtDNA 序列，確證了骸骨的皇族成員身份[48]。mtDNA檢測(cè)靈敏度極高，實(shí)驗(yàn)過程中建立完整的防污染系統(tǒng)規(guī)范十分重要，如實(shí)驗(yàn)區(qū)域的絕對(duì)清潔，實(shí)驗(yàn)前后充足的消毒滅菌處理，實(shí)驗(yàn)人員完備的防護(hù)措施，實(shí)驗(yàn)各個(gè)階段添加陽性和陰性對(duì)照品，PCR 前后分區(qū)域進(jìn)行操作以及DNA 質(zhì)量控制數(shù)據(jù)庫等。

3.3 下一代測(cè)序

3.3.1 STR 和SNP

高通量測(cè)序技術(shù)又稱下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）能夠同時(shí)檢測(cè)STR 基因座的長(zhǎng)度多態(tài)性和序列多態(tài)性，可兼容STR、SNP 多種遺傳標(biāo)記，同時(shí)測(cè)序多個(gè)樣本，使得鑒定效率得到很大的提高。目前，美國(guó)Verogen 公司推出的ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒在高通量鑒定應(yīng)用中占主導(dǎo)地位[49]，最多可檢測(cè)230 個(gè)基因座，涵蓋27 個(gè)常染色體STR、24 個(gè)Y-STR、7 個(gè)X-STR、94 個(gè)個(gè)體識(shí)別SNP、22 個(gè)表型SNP 和56 個(gè)生物祖先SNP，其中絕大多數(shù)基因座產(chǎn)物長(zhǎng)度小于200 bp，非常適合陳舊骸骨和牙齒高度降解樣本的鑒定。ZHANG 等[50]通過模擬痕量和降解樣本實(shí)驗(yàn)得出，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒在DNA 模板為50 pg 或樣本高度降解[降解系數(shù)（degradation index，DI）為72.28]時(shí)，可以檢出大于80%的等位基因。SHARMA 等[51]使用一系列降解DNA 樣本和24 個(gè)種類為骨骼、血卡和牙齒的模擬案件樣本測(cè)試ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒。兩組連續(xù)降解的DNA 樣本結(jié)果顯示，當(dāng)DI>4 時(shí)，STR 開始丟失。丟失的位點(diǎn)主要是具有長(zhǎng)擴(kuò)增子以及低讀數(shù)（覆蓋率）的基因座，如PentaE、DXS8378和rs1736442。然而，嚴(yán)重降解的DNA（DI 為44）仍能獲得18 個(gè)CODIS 基因座（占比90%）。作者模擬的多種類型案件樣本與上述降解DNA 樣本結(jié)果相符[51]。研究[51]表 明，F(xiàn)orenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒可以成功用于降解DNA 樣品。同年，在南非開普敦海岸發(fā)現(xiàn)的腐爛的人類下肢和手鑒定案例中，采用ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒高通量測(cè)序，確認(rèn)了2 份檢材來自同一個(gè)體，協(xié)助遺體的識(shí)別和認(rèn)親。該案例是全球首次采用高通量測(cè)序方法從海洋分解的軟組織裂解物中獲得完整DNA 的報(bào)道[52]。

3.3.2 mtDNA 全序列

基于高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司的精準(zhǔn)身份識(shí)別mtDNA 全基因組試劑盒[53]包含162 對(duì)多重?cái)U(kuò)增引物，以平鋪方法覆蓋整個(gè)線粒體基因組。這些引物對(duì)平分于2 個(gè)離心管，擴(kuò)增子平均長(zhǎng)度為163 bp，起始DNA 低至2 pg，專門針對(duì)高度受損、降解的牙齒和骨骼樣本。該線粒體基因組高通量測(cè)序試劑盒已經(jīng)被驗(yàn)證效果良好[54-55]。

3.3.3 雜交捕獲

自2010 年以來，雜交捕獲在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得了關(guān)注。雜交捕獲的主要優(yōu)勢(shì)是適用于降解DNA，沒有PCR 引物對(duì)數(shù)限制及可能的錯(cuò)配和污染[56]。雜交捕獲通常是在提取的DNA 模板進(jìn)行基因組庫制備后引入的，以便富集mtDNA 或核基因組內(nèi)的目的片段，應(yīng)用MPS 生成DNA 序列[56]。在陳舊、降解的骨骼樣本中，內(nèi)源性人類DNA的比例可能非常低，而雜交捕獲技術(shù)能成功應(yīng)用于含有少于1%內(nèi)源性DNA、平均長(zhǎng)度僅為70 bp 的古人類DNA 鑒定中[57]。在法醫(yī)學(xué)研究中，雜交捕獲方案首先被應(yīng)用于陳舊樣本的mtDNA序列鑒定[58-59]。例如，TEMPLETON 等[60]應(yīng) 用DNA 探針捕獲技術(shù)檢測(cè)7 例二戰(zhàn)期間（約70 年）和考古樣本（約2 500 年）中的骸骨樣本，經(jīng)2 輪雜交捕獲得到了近100%的線粒體基因組覆蓋率，成功在5 例樣本中獲得線粒體基因組圖譜。BOSE等[61]提出了最早用于法醫(yī)學(xué)樣本檢測(cè)的SNP捕獲體系之一，該體系含451個(gè)遺傳標(biāo)記，即375 個(gè)SNP 和36 個(gè)微單倍型，其在模擬降解樣本上表現(xiàn)良好，相比于PCR 富集，SNP 回收率有所提高。對(duì)于片段長(zhǎng)度≤75 bp 的樣本，該體系使用0.5 ng DNA 可以分析98%以上的SNP，回收片段小至25 bp，非常適用于高度降解的DNA 檢測(cè)[61]。GORDEN 等[62]構(gòu)建了25 000 個(gè)和95 000 個(gè)SNP 捕獲體系，用于14 例死后75 年骸骨樣本共計(jì)21 對(duì)親緣關(guān)系鑒定，分別成功鑒定出16 和17 個(gè)成對(duì)的親緣關(guān)系，包括親子、全同胞、祖孫、叔侄、祖侄關(guān)系等。雜交捕獲對(duì)于STR 富集具有可嘗試性[63]，但效果不佳。值得注意的是，目前雜交捕獲技術(shù)靈敏度欠佳，成本高，使用者工作強(qiáng)度大。

3.4 基因芯片

基因芯片可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的多個(gè)遺傳標(biāo)記，具有快速檢測(cè)的特點(diǎn)，在高通量測(cè)序早期階段應(yīng)用較多。2014 年，針對(duì)濟(jì)州特別自治道大規(guī)模陳舊骸骨（1948 年遇難者）鑒定需求，韓國(guó)法醫(yī)學(xué)專家開發(fā)了一個(gè)基于美國(guó)Affymetrix 公司重測(cè)序陣列平臺(tái)的169 個(gè)個(gè)體識(shí)別SNP 檢測(cè)芯片，測(cè)試結(jié)果顯示，該芯片中120 多個(gè)SNP 能夠在低至約10 pg 的DNA 樣本和人工降解樣本中獲得分型[64]。濟(jì)州特別自治道402具骸骨的鑒定過程中，該芯片作為SNP 分型的補(bǔ)充工具，在74 具可得STR 圖譜的基礎(chǔ)上增加檢出了51 具骸骨的分型，為STR 數(shù)據(jù)不足的樣本增加了遺傳信息[65]。

綜上所述，多重PCR-CE 技術(shù)及結(jié)果解釋規(guī)范、成熟，產(chǎn)品豐富，效果穩(wěn)定，在全球法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室普遍適用，且數(shù)據(jù)量積累龐大，便于開展陳舊骸骨DNA 個(gè)體識(shí)別及比對(duì)工作，因此，當(dāng)前及短期內(nèi)陳舊骸骨的DNA 鑒定仍將以多重PCR-CE 技術(shù)為首選。為了從微量的陳舊骸骨DNA 中解析更多個(gè)體的遺傳信息，基于高通量測(cè)序技術(shù)的研發(fā)正在快速發(fā)展并逐漸成為取代CE 技術(shù)的強(qiáng)有力手段。此外，高通量測(cè)序技術(shù)低成本化發(fā)展且可以融合更多創(chuàng)新技術(shù)，越來越多新技術(shù)的引入也將促進(jìn)高通量測(cè)序在陳舊檢材鑒定中的作用。測(cè)序前片段富集方面，多重PCR 雖然存在引物對(duì)容量和平衡的問題，但從技術(shù)便捷性和成熟性方面考慮，仍然具有壓倒性優(yōu)勢(shì)，而雜交捕獲技術(shù)則需要進(jìn)一步優(yōu)化過程，降低成本。

4 展 望

近5 年，隨著高通量測(cè)序技術(shù)逐漸低成本化以及多學(xué)科間交叉融合研究和發(fā)展，陳舊骸骨DNA 檢測(cè)技術(shù)不斷被探索和完善，可檢測(cè)的骨骼類型豐富，DNA 回收量和回收率提高，靶向型高通量測(cè)序體系快速發(fā)展。綜合相關(guān)研究和案例，在陳舊骨骼鑒定中，選取長(zhǎng)骨樣本成功率高，DNA 提取時(shí)確保完全鈣化并減少液體轉(zhuǎn)移步驟，有利于DNA 回收。目的片段富集以多重?cái)U(kuò)增技術(shù)為主，結(jié)合高通量測(cè)序平臺(tái)，是目前實(shí)現(xiàn)陳舊骨骼高效檢驗(yàn)的最優(yōu)組合。值得思考的是，骸骨的保存狀態(tài)對(duì)DNA 檢驗(yàn)起到?jīng)Q定性作用。骸骨被發(fā)掘前的保存環(huán)境十分復(fù)雜，如溫度、濕度、酸堿度、深度、微生物集群等，這些外界環(huán)境因素對(duì)骸骨DNA 的影響和關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步研究。此外，目前骨骼DNA 采樣部位通常是根據(jù)鑒定人員經(jīng)驗(yàn)來決定，有時(shí)會(huì)對(duì)保存較差的骸骨樣本造成較大甚至不可逆的破壞性。如果能夠加入影像學(xué)手段，如CT[66]和X 射線以幫助判斷骨骼或牙齒狀態(tài)，有針對(duì)性地選用適量體積，可以在解決骸骨DNA 鑒定的同時(shí)對(duì)骸骨進(jìn)行最大程度的保護(hù)。此外，陳舊骸骨的DNA 分析中，如何把握分型結(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要。如上文所描述，陳舊骸骨DNA 分型圖譜可能存在微生物引入的偽峰，當(dāng)DNA 高度降解且為痕量，測(cè)序會(huì)出現(xiàn)次要等位基因未達(dá)閾值的假陰性現(xiàn)象等。本文綜述了當(dāng)前骨骼和牙齒DNA 檢測(cè)的主要技術(shù)，特別針對(duì)陳舊降解骸骨，為相關(guān)人員的應(yīng)用和研究提供參考。