羅卓慧龐 碩張連峰

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心,北京 100730)

環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)是堿性區(qū)亮氨酸拉鏈(basic region-leucine zipper,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子超家族的重要成員之一,定位于細胞核內(nèi),在腦組織的各種細胞中廣泛表達。 CREB 基因與環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件調(diào)制器 ( cAMPresponsiveelement-binding modulator,CREM)和激活轉(zhuǎn)錄因子-1(activating transcription factor-1,AIF-1)兩個同源基因共同構(gòu)成CREB 轉(zhuǎn)錄因子家族[1]。 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,CREB 參與調(diào)節(jié)鈣、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子信號通路以及各種細胞應(yīng)激信號通路,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達調(diào)控單個神經(jīng)元及整體神經(jīng)通路的功能,主要調(diào)節(jié)分化、生存和可塑性,影響學(xué)習(xí)記憶,并與帕金森癥、精神分裂癥、酒精依賴、抑郁、焦慮等多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。

1 CREB 的結(jié)構(gòu)與激活

CREB 蛋白的主要結(jié)構(gòu)域包括Q1 區(qū)、激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(KID)區(qū)、Q2/CAD 區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP)區(qū)4 個區(qū)域。 位于蛋白C 端的基本結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)CREB 與DNA 結(jié)合,Q1 和Q2/CAD 兩個結(jié)構(gòu)域含有豐富的谷氨酰胺,bZIP 區(qū)介導(dǎo)與DNA 的結(jié)合和二聚化,其他的區(qū)域促進CREB 與激活子或轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合。 KID 區(qū)的Ser-133 殘基磷酸化后與轉(zhuǎn)錄激活子CREB 結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)結(jié)合,在內(nèi)在或相關(guān)的乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下CREB 與核心轉(zhuǎn)錄機器相互作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄進行,該過程可持續(xù)數(shù)小時[2],Ser-133 位點是CREB 激活的標志,研究發(fā)現(xiàn)Ser-133 位點激活的CREB 對轉(zhuǎn)錄調(diào)控,繼而調(diào)節(jié)基礎(chǔ)神經(jīng)傳輸,突觸可塑性和空間認知發(fā)揮了不可或缺的作用。 CREB S133A 突變小鼠在空間認知,神經(jīng)傳輸和神經(jīng)電位等方面表現(xiàn)出明顯的缺陷[3],而Ser-142 位點磷酸化后促進CREB二聚體解聚,抑制轉(zhuǎn)錄[4]。 回文序列“TGACGTCA”是cAMP 反應(yīng)元件,可被CREB 特異性識別。 不同物種的CRE 序列存在差異,但“CGTCA”序列相對保守[1]。

興奮性神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)生長因子、G 糖蛋白偶聯(lián)受體(G-PCRs)配體和壓力等可激活CREB 的磷酸化,常見的激活CREB 磷酸化的通路按來源可分為cAMP 信號通路、鈣離子信號通路、生長因子誘導(dǎo)和壓力誘導(dǎo)的信號通路,包括Ca/CaM/CaMK/CREB、GPCRs/AC/cAMP/PKA/CREB、 RTK/Ras/ERK/RSK/CREB 和RTK/PI3K/AKT/CREB 信號通路等[2],近年來又發(fā)現(xiàn)PPARα/CREB[5-6]和CCR5/CREB 通路[7]。 蛋白磷酸酶(protein phosphatase 1,PP1)是CREB 最主要的磷酸酶,抑制CREB 活性[1,4]。 除磷酸化修飾外,研究發(fā)現(xiàn)CREB 還存在糖基化修飾,阻斷CREB 的糖基化可增強神經(jīng)元軸突和樹突生長,促進長期記憶鞏固[8]。

CREB 是轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,CREB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子共同調(diào)節(jié),CREB的轉(zhuǎn)錄激活子包括激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)、CREB 調(diào)控的轉(zhuǎn)錄輔激活因子(CREB regulated transcription activator 1, CRTC1)和CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein, CBP)。 AP-1 是亮氨酸拉鏈蛋白Fos 和Jun 的異二聚體,通過調(diào)節(jié)CREB 的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)突觸強度和突觸數(shù)目間接調(diào)節(jié)突觸可塑性,CREB 又可正反饋調(diào)節(jié)AP-1 的表達[9]。 靜息狀態(tài)下神經(jīng)元中的CRTC1 定位于突觸上,在局部刺激下CRTC1 被鈣流或鈣調(diào)磷酸酶激活,迅速轉(zhuǎn)移至核內(nèi),與喂食狀態(tài)感應(yīng)核受體(fedstate sensing nuclear receptor, FXR) 競爭性結(jié)合CREB[10]。 CRTC1 的核內(nèi)表達受cAMP 調(diào)節(jié)[11],CRTC1 與CREB 的bZIP 區(qū)結(jié)合,促進CREB 與DNA 二聚化結(jié)合可激活CREB 的非磷酸化狀態(tài)[12]。CBP/p300 具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,與CREB 的KID 區(qū)結(jié)合并與和Ser133 位點相互作用[12],通過招募p53、ATF-1、ATF-2、junB、c-myc、E2F、c-jun 等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[13]。

2 CREB 的下游目標基因

CREB 被多種信號通路激活后,可在T 細胞、肝細胞和精母細胞的分化等長期適應(yīng)過程中發(fā)揮作用。 已確定的CREB 目標基因超過100 種,這些基因在結(jié)構(gòu)上含有一個或多個CREB 結(jié)合位點,影響核轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)傳輸、代謝、細胞增殖與生長、細胞結(jié)構(gòu)等方面[2,14]。

CREB 可通過調(diào)節(jié)下游基因調(diào)節(jié)突觸可塑性。一方面,CREB 可激活一系列突觸可塑性相關(guān)基因包括BDNF、NGF、tPA、Arc、PPARGC1、PLCγ、VGF等[15]。 BDNF 和NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子,在發(fā)育過程中支持神經(jīng)元和神經(jīng)突生長,共同調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞連接、纖維引導(dǎo)和突觸形態(tài)。 BDNF 在海馬體中指導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生,在突觸前和突觸后位置發(fā)揮旁分泌因子和自分泌因子的作用,促進血清素和多巴胺的傳遞。 體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)BDNF 可促進神經(jīng)遞質(zhì)釋放,突觸傳輸和LTP[16]。 作為一種神經(jīng)保護因子,BDNF 對許多神經(jīng)和精神疾病都具有治療潛力[17]。 BDNF 調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與可塑性,在LTP 中通過增加突觸囊泡的釋放調(diào)節(jié)突觸的結(jié)構(gòu)和功能,表現(xiàn)為長期調(diào)節(jié)作用[18]。 NGF 通過調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)LTP[19]。 tPA 是細胞外絲氨酸蛋白酶,促進纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶,纖溶酶可降解部分細胞外基質(zhì),通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體增加谷氨酸誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流,增加PKA 活性[18]。 Arc 是一種立早基因(immediately early genes, IEG),通過調(diào)節(jié)AMPA 型谷氨酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isooxazopropionic acid receptor,AMPAR)的轉(zhuǎn)運和細胞骨架調(diào)控突觸強度[20]。 線粒體定位于神經(jīng)元軸突末梢和樹突,是真核細胞內(nèi)的負責(zé)能量供給和鈣緩沖細胞器,調(diào)節(jié)鈣和氧化還原信號,與LTP 的發(fā)生與維持密切相關(guān)[21],PPARGC1 是調(diào)節(jié)線粒體融合的重要基因,促進形成緩慢的氧化纖維,影響線粒體發(fā)生和突觸形成[21]。 PLCγ 通過被TrkB 招募,激活下游突觸可塑性信號通路,主要維持海馬內(nèi)樹突形態(tài)與棘突收縮功能[21-23],VGF 是一種分泌多肽,在神經(jīng)細胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中均表達,定位于胞體與突觸內(nèi),劑量依賴性增加突觸電位[24]。

另一方面,許多目標基因自身就是轉(zhuǎn)錄因子,如C/EBPβ、Egr1、Nurr1 等,這些基因?qū)ι窠?jīng)功能表現(xiàn)為間接調(diào)節(jié)作用[14]。

3 CREB 通過調(diào)節(jié)突觸可塑性調(diào)控記憶

突觸可塑性是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與感知、學(xué)習(xí)和記憶的細胞基礎(chǔ)[25-27],突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)觸發(fā)突觸后膜的能力稱為突觸效能,受到刺激時突觸效能的變化稱為突觸可塑性[27],常見的突觸刺激包括學(xué)習(xí)記憶、環(huán)境變化和腦損傷[28]。 突觸可塑性改變時,突觸前后的神經(jīng)傳輸和膜轉(zhuǎn)運情況均改變,相關(guān)蛋白合成或激活,細胞骨架重塑,突觸可塑性在神經(jīng)元層面上表現(xiàn)為突觸發(fā)生和棘突生長[28],在電位上表現(xiàn)為長時程增強(long-term potential,LTP)和長時程抑制(long-term depression,LTD)兩種。 LTP和LTD 的誘導(dǎo),表達和相互作用依賴相關(guān)突觸蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯和樹突骨架的重塑[29]。 按照突觸效能變化的持續(xù)時間突觸可塑性可分為短期突觸可塑性(持續(xù)幾毫秒至幾分鐘)和長期突觸可塑性(持續(xù)超過幾十分鐘)[27]。 突觸效能變化的第一階段細胞內(nèi)僅對現(xiàn)有的蛋白進行修飾,第二階段轉(zhuǎn)錄并合成新的蛋白[30]。

記憶是重要的神經(jīng)活動,包括短期記憶和長期記憶兩種,短期記憶立即形成,長期記憶形成緩慢但是相對短期記憶更穩(wěn)固,需要合成相關(guān)mRNA 和蛋白質(zhì)[31]。 記憶在海馬區(qū)中的形成,在大腦皮層中的鞏固,在記憶形成的不同階段突觸可塑性發(fā)揮的作用表現(xiàn)為時空特異性[32]。 研究發(fā)現(xiàn)與青年的對照組小鼠相比老年小鼠突觸可塑性明顯下降,樹突的棘突數(shù)目減少,生物反應(yīng)路徑分析(ingenuity pathway analysis, IPA)結(jié)果表明CREB 在該突觸可塑性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置,相比青年對照組小鼠,老年小鼠CREB 的表達明顯下調(diào)[33]。 由反義寡核苷酸,RNA 干擾和基因突變等導(dǎo)致CREB 表達下調(diào)時,將導(dǎo)致記憶缺陷,影響回憶功能。 相反,CREB表達增加時,記憶增強[34]。

CREB 通過調(diào)節(jié)突觸可塑性調(diào)節(jié)記憶,主要影響長期記憶。 研究發(fā)現(xiàn)抑制海馬CA1 區(qū)CREB 轉(zhuǎn)錄因子家族基因后,與對照組相比小鼠短期記憶無明顯差異,長期記憶和空間記憶受損[31]。 CREB 已被證明是參與小鼠、大鼠、海兔、果蠅等多種動物長期記憶的重要轉(zhuǎn)錄因子[18],CREB 對突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)影響離子流,CREB 激活后調(diào)控電壓門控Na+-K+通道的開放,鈉離子流增加,鉀離子流減少。 (2)影響遞質(zhì)釋放,CREB 激活后突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)的釋放增加,突觸效能增加[35]。 (3)影響神經(jīng)元興奮性,研究發(fā)現(xiàn)相比野生型細胞相同強度的電脈沖在CREB 過表達細胞引發(fā)更高的動作電位及更低的動作電位后超極化,CREB 激活后海馬區(qū)謝氏側(cè)支神經(jīng)元L-LTP 增加[36],神經(jīng)元興奮性增加,海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生L-LTP 所需要的刺激閾值降低[18]。 (4)影響樹突的棘突形成,抑制CREB 后棘突數(shù)目減少[18]。 (5)影響與可塑性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進而調(diào)控相關(guān)生理過程[18]。 CREB 通過調(diào)節(jié)固有神經(jīng)元的興奮性的影響神經(jīng)元進入記憶軌跡的可能性,增加IEG 的表達,促進記憶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,實現(xiàn)對記憶的分配與調(diào)控[34,37]。 當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時,CREB 參與皮層的軀體感覺和運動通路的重新投射,增加軸突數(shù)目和神經(jīng)元棘突數(shù)目,誘導(dǎo)回路中新連接的形成,在腦卒中恢復(fù)中發(fā)揮重要作用[38]。

4 CREB 與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)CREB 不僅調(diào)控許多神經(jīng)可塑性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,還調(diào)控AD 相關(guān)蛋白的表達。 受CREB調(diào)控的淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1B,AIDA-1)主要分布在突觸后密度區(qū)域(post synaptic density,PSD)。 AIDA-1 基因的轉(zhuǎn)錄受CREB 調(diào)控[39],是遲發(fā)型AD 的候選風(fēng)險基因[40]。一方面,AIDA-1 通過下調(diào)γ-分泌酶降低Aβ 分泌,降低Aβ 含量[39],另一方面,AIDA-1 是突觸后密度蛋白(discs large MAGUK scaffold protein 4,PSD95)/N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)復(fù)合物的結(jié)合蛋白,在NMDAR 介導(dǎo)的突觸傳輸和可塑性中必不可少,AIDA-1 失活導(dǎo)致海馬依賴的突觸傳輸缺陷,AIDA-1 基因敲除小鼠活動性增加,前脈沖抑制,出現(xiàn)刻板行為[40]。

AD 患者表現(xiàn)出嚴重的認知和記憶惡化[41],突觸可塑性損傷, 神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs),胞外淀粉樣蛋白(βamyloid,Aβ)沉積和神經(jīng)元大量死亡,海馬CA1 和CA3 區(qū)椎體神經(jīng)元密度降低和神經(jīng)元樹突棘密度降低是AD 早期的重要病理表型之一,這些突觸異常是由可溶性Aβ 寡聚體(Aβ oligomers,AβOs)積聚和 過 度 磷 酸 化 的 微 管 相 關(guān) 蛋 白 tau( hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau,HPtau)引起[29]。 AβOs 與突觸后膜的NMDAR 結(jié)合,誘導(dǎo)谷氨酸興奮毒性,擾亂谷氨酸再攝取及表面AMPAR 的去除,導(dǎo)致線粒體損傷,氧化應(yīng)激和鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡,產(chǎn)生的突觸毒性最終導(dǎo)致細胞死亡[42]。 以Tg2576、PDAPP、APP/PS1、J20、3×Tg、5×FAD 為代表的AD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型表現(xiàn)出明顯的突觸可塑性損傷,LTP 受損[43]。 Tau 通過調(diào)控微管結(jié)合域與微管蛋白的結(jié)合調(diào)控微管動力學(xué),Tau 異常時抑制神經(jīng)元生長和軸突延伸,微管密度降低,HPtau 從微管上解離,形成神經(jīng)纖維纏結(jié),損害正常的樹突結(jié)構(gòu)[44]。 AD 患者腦內(nèi)CREB 和磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,P-CREB)的表達均下降[45],AD 常見動物模型APP/PS1 小鼠3 月齡P-CREB 明顯下調(diào)[46],3×Tg 小鼠CREB 和P-CREB表達明顯下降[47]。 Aβ 病理假說是AD 重要的病理假說之一,體外研究發(fā)現(xiàn)Aβ42誘導(dǎo)的神經(jīng)元PCREB 表達下降[45,47],AβOs 誘導(dǎo)的神經(jīng)元P-CREB表達下降[13]。 Aβ 通過下調(diào)NO/cGMP/cGK/CREB通路損傷突觸可塑性,影響學(xué)習(xí)記憶功能[48]。

CREB 與AD 聯(lián)系密切,且AD 表現(xiàn)的突觸可塑性損傷先于Aβ 沉積和NFTs 病理表型出現(xiàn),可能是可逆的[29],因此CREB 可能是AD 潛在的治療靶點之一。 某些磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制劑和乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)已被發(fā)現(xiàn)可通過維持或激活CREB的Ser-133 位點磷酸化改善認知功能。 PDE 的主要功能是水解cAMP 和cGMP。 部分PDE 抑制劑通過促進抑制PDE,提高cAMP 和cGMP 的含量,激活CREB 進而改善長期記憶缺陷和認知障礙[49]。PDE4 抑制劑羅利普蘭在APP/PS1 小鼠中通過激活cAMP/PKA/CREB 通路,改善LTP 缺陷,改善條件性學(xué)習(xí)和長期空間學(xué)習(xí)記憶[50]。 在高脂飲食和低劑量四氮唑誘導(dǎo)的SD 大鼠糖尿病認知缺陷模型中,羅利普蘭可改善長期的空間記憶,提高P-CREB和突觸相關(guān)蛋白BDNF、ARC 的表達[53]。 研究發(fā)現(xiàn)衰老后PDE5 抑制劑(PDE5 inhibitors,PDE5Is)的活性和表達增加[48]。 以米羅那非為代表的PDE5Is 通過激活cGMP/PKG/CREB 通路增加LTP,減少細胞凋亡,HPtau 和Aβ 表型,改善認知功能[48,52]。 除PDE 抑制劑外,阿司匹林已被證明可與PPARα 結(jié)合,在5×FAD 小鼠中通過激活PPARα/CREB 通路激活鈣離子內(nèi)流,加強下游BDNF,PSD95 和NR2A的表達,增加棘突的數(shù)目和密度[5]。 組胺H3 受體(H3 receptor,H3R)抑制劑塞普酰胺可通過激活CREB 介導(dǎo)的自噬途徑和溶酶體途徑,減少APP/PS1 小鼠缺血性損傷和神經(jīng)元損傷,改善認知功能,在原代細胞模型可明顯改善Aβ 病理表型[53]。 三環(huán)類抗抑郁藥地昔帕明在AD 大鼠中通過上調(diào)PCREB 改善認知障礙[42]。 糖皮質(zhì)激素受體抑制劑米非司酮可改善3×Tg 小鼠的認知缺陷,減少營養(yǎng)不良的神經(jīng)突數(shù)目,改善Aβ 和HPtau 病理表型,并上調(diào)CREB 和P-CREB 的表達[47]。

5 結(jié)果和展望

現(xiàn)有的抗AD 藥物包括AChEI(多奈哌齊、利伐斯的明、加蘭他敏),NMDAR 抑制劑(美金剛)和基于Aβ 病理表型的藥物阿杜那單抗。 以上藥物可緩解AD 癥狀,已被批準上市,但目前沒有藥物可徹底延緩AD 的發(fā)病進程。 現(xiàn)有的AD 治療措施不足,AD 發(fā)生發(fā)展機制依舊不明,發(fā)現(xiàn)更多有潛力的AD靶點,并針對特定的靶點進行藥物研發(fā),是AD 治療的研究方向之一。 CREB 是與突觸可塑性密切相關(guān)的蛋白,AD 患者CREB 表達和活性均抑制,表現(xiàn)出明顯的記憶缺失,認知缺陷和突觸可塑性損傷。 本文總結(jié)CREB 的結(jié)構(gòu)與功能,歸納了CREB 通過調(diào)節(jié)突觸可塑性對記憶的調(diào)節(jié)作用及CREB 激活對認知障礙的改善作用。 在一定范圍內(nèi)通過調(diào)節(jié)CREB實現(xiàn)對突觸可塑性的調(diào)節(jié),在避免興奮毒性的前提下改善突觸間信息傳遞,CREB 的直接或間接激活劑或許是AD 潛在的治療措施。