楊 鋒劉廣龍*王艷卿

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院口腔科,山東 滕州 277599;2.滕州市中心人民醫(yī)院手術(shù)室,山東 滕州 277599)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔常見的惡性腫瘤之一,具有高發(fā)病率、高惡性度和不良預(yù)后的特點(diǎn)[1-2]。 雖然在手術(shù)和放化療方面有很大進(jìn)步,但OSCC 患者的總生存率并無明顯提高[3]。 癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是OSCC 進(jìn)展過程中的致命因素[4]。 長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)在惡性腫瘤(包括OSCC)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[5-6]。 FGD5 反義RNA1(FGD5 antisense RNA 1, FGD5-AS1) 是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的LncRNA,在喉鱗狀細(xì)胞癌[7]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]、乳腺癌[9]等多種癌癥中呈高表達(dá)。 最近發(fā)現(xiàn),FGD5-AS1 表達(dá)在OSCC 組織和細(xì)胞中異常上調(diào),敲低FGD5-AS1 可 抑 制OSCC 細(xì) 胞 惡 性 行 為[10]。 但FGD5-AS1 在OSCC 中的作用機(jī)制尚未完全明確。

研究顯示,miR-129-5p 的表達(dá)水平在OSCC 組織中下調(diào)[11];且高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)與miR-129-5p 存在結(jié)合位點(diǎn),miR-129-5p 可通過靶向負(fù)調(diào)節(jié)HMGB1 表達(dá)抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[12]。 HMGB1 已被證實(shí)在OSCC 中呈高表達(dá),與OSCC 的易感性和惡性進(jìn)展有關(guān)[13-14]。 然而,FGD5-AS1 在OSCC 中的作用是否與miR-129-5p 和HMGB1 有關(guān)還未可知。 因此,本研究旨在探討FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并分析潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

人口腔黏膜細(xì)胞(human oral keratinocytes,HOK)和OSCC 細(xì)胞(SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27)均購自美國ATCC 公司。

1.1.2 臨床樣本

2018 年1 月～2021 年1 月,從滕州市中心人民醫(yī)院口腔科獲得30 例OSCC 患者的腫瘤組織及鄰近的正常組織。 30 例OSCC 患者包括26 例男性,4例女性,年齡32 ～76 歲;TNM 分期:Ⅰ期3 例,Ⅱ期8 例,Ⅲ期9 例,Ⅳ期10 例;病理分化高17 例,病理分化低或中13 例。 納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理診斷結(jié)果為OSCC 患者;術(shù)前未接受抗腫瘤治療。 排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前接受抗腫瘤治療或放療、化療的患者;患有其它類型腫瘤的患者;患有免疫系統(tǒng)疾病的患者;有嚴(yán)重的心臟、肺部等系統(tǒng)性疾病的患者;資料不完整的患者。 本實(shí)驗(yàn)獲得本院科研倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。 此外,每個(gè)參與者在研究前都簽署了書面知情同意書。 組織樣本立即在-80℃冰箱冷凍。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只SPF 級(jí)雄性BALB/c 裸鼠取自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(魯)2019-0001],體重19 ～22 g,6 周齡,飼養(yǎng)于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房?jī)?nèi)[SYXK(魯)2021-0030]。

所有小鼠都被飼養(yǎng)在18 ～22℃、濕度20%、光照/黑暗周期12 h/12 h 的特定無病原體條件下。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(H20220513),符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

FGD5-AS1 小干擾RNA/過表達(dá)載體(si-FGD5-AS1/pc-FGD5-AS1) 及相應(yīng)對(duì)照(si-NC/pcDNA)、miR-129-5p 模擬物/抑制物(miR-129-5p mimics/inhibitor)及相應(yīng)對(duì)照(NC mimics/inhibitor)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司(批號(hào): 20181019、20180511);Lipofectamine 3000 購自山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司(批號(hào):20190322);RevertAid 第一鏈互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA)合成試劑盒購自北京百諾威生物科技有限公司(批號(hào):20170605);SYBR Green PCR 試劑盒購自北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司(批號(hào):20150627);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)購自武漢菲恩生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司(批號(hào):20140520);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司(批號(hào):20170825);HMGB1 抗體購自Abcam 公司(批號(hào):20201123)。 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國BD 公司);ABI 7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司);Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 TANRIC 數(shù)據(jù)庫分析

采用癌癥非編碼RNA 圖譜(TANRIC)來獲取和分析FGD5-AS1 在OSCC 中的表達(dá)水平。 利用來自癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)的大規(guī)模RNA-seq 數(shù)據(jù)集來探索LncRNAs 的功能( http:/ /bioinformatics.mdanderson.org/main/TANRIC: Overview)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HOK 細(xì)胞和OSCC 細(xì)胞(SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27)用添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,在37℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)FGD5-AS1 和miR-129-5p 表達(dá)水平

組織和細(xì)胞的RNA 提取采用TRIzol 試劑。 利用RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒將RNA 反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。 用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI 7300 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。GAPDH 和U6 作為內(nèi)部對(duì)照,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。 引物如下:FGD5-AS1,正向 5 ’-TTTGCTGTTTGATATTGG-3’, 反 向 5 ’-TGTTTTGAGTTGTCTTCG-3’;miR-129-5p,正向5’-ACCCAGTGCGATTTGTCA-3 ’, 反 向 5 ’-ACTGTACTGGAAGATGGACC-3’; U6, 正 向 5’-GCCAGCTCCTACATCTCAGC-3 ’, 反 向 5 ’-AGCCTGACTTGCTAGTGGATTAT-3’;GAPDH,正向5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3 ’, 反 向 5 ’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

CAL-27 細(xì)胞分為Control 組(正常培養(yǎng),不轉(zhuǎn)染)、si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-FGD5-AS1 組(轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1)、si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組(共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1 和NC inhibitor)和si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組(共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1 和miR-129-5p inhibitor),轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行。 轉(zhuǎn)染48 h 后,收集細(xì)胞。

1.3.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

CCK-8 法:轉(zhuǎn)染后的CAL-27 細(xì)胞置于96 孔板中。 在培養(yǎng)24、48、72 和96 h 后用CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力。 最后,通過酶標(biāo)儀記錄450 nm 處的光密度(OD)值。 以O(shè)D 值代表細(xì)胞增殖活力(簡(jiǎn)稱細(xì)胞活力)。 克隆形成實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞以每孔300 個(gè)細(xì)胞的密度接種到6 孔板中,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。當(dāng)克隆體肉眼可見時(shí),培養(yǎng)終止。 棄去培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,結(jié)晶紫染色15 min。 在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)(＞50 個(gè)細(xì)胞)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組CAL-27 細(xì)胞重懸于100μL 結(jié)合緩沖液中,分別與5 μL FITC-Annexin V 染色液和5 μL PI染色液一起孵育10 min,使用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡。

1.3.7 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將各組CAL-27 細(xì)胞接種于6 孔板,培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%以上的板后,用無菌移液管劃傷單層細(xì)胞,觀察劃痕并拍照。 然后,將CAL-27 細(xì)胞在無血清DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再次觀察劃痕并拍照。 使用Image J 軟件計(jì)算劃痕愈合率。 劃痕愈合率=(0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度×100%。

1.3.8 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將各組CAL-27 細(xì)胞重懸在無血清培養(yǎng)基中,取200 μL 細(xì)胞懸液(2×104個(gè)細(xì)胞)加入到預(yù)涂有基質(zhì)膠的上室,下室加入600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。 孵育24 h 后,將附著在膜下表面的細(xì)胞分別用甲醇和結(jié)晶紫固定和著色。 在顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行入侵細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FGD5-AS1 與miR-129-5p 的靶向關(guān)系

將 WT-FGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 克 隆 到pmirGLO 雙熒光素酶載體中,構(gòu)建pmirGLO-WTFGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 重組載體。 將pmirGLOWT-FGD5-AS1/MUT-FGD5-AS1 載體分別與miR-129-5p mimic 或NC mimic 共轉(zhuǎn)染至CAL-27 細(xì)胞。采用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行評(píng)估。

1.3.10 Western blot 檢測(cè)HMGB1 蛋白水平

從OSCC 組織和細(xì)胞中提取總蛋白。 蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶封閉膜1 h。隨后,將膜與抗HMGB1、β-actin 的一抗4℃下孵育過夜,再與二抗孵育1 h。 顯影,使用ImageJ 軟件計(jì)算HMGB1 蛋白表達(dá),β-actin 為內(nèi)參。

1.3.11 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(sh-NC)、sh-FGD5-AS1、miR-129-5p inhibitor 或 sh-FGD5-AS1 與 miR-129-5p inhibitor 共轉(zhuǎn)染的CAL-27 細(xì)胞(5×106)皮下注射至BALB/c 裸鼠(n=5),記為sh-NC 組、sh-FGD5-AS1組、miR-129-5p inhibitor 組和sh-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組。 每周記錄移植瘤的寬度和長度,計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積=(長×寬2)/2。 5 周后處死小鼠,取腫瘤稱重。 將腫瘤組織一部分固定后制備石蠟切片,切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后進(jìn)行Ki67、HMGB1 免疫組化染色,另一部分進(jìn)行勻漿檢測(cè)FGD5-AS1 和miR-129-5p 表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TANRIC 數(shù)據(jù)庫分析FGD5-AS1、miR-129-5p在OSCC 中的表達(dá)

TANRIC 平臺(tái)數(shù)據(jù)挖掘顯示,在OSCC 腫瘤組織中FGD5-AS1 的表達(dá)水平是正常組織的4 倍,見表1。 288 份OSCC RNA-seq 樣本中,FGD5-AS1 表達(dá)與OSCC 患者G 級(jí)較差相關(guān),見表2。

表1 TANRIC 平臺(tái)獲得的人類OSCC 組織和正常組織中FGD5-AS1的表達(dá)水平(±s)Table 1Expression level of FGD5-AS1 in human OSCC tissues and normal tissues obtained from TANRIC platform

組織Organization n FGD5-AS1正常組織 Normal tissue 38 0.36±0.12腫瘤組織 Tumor tissue 297 1.29±0.35 t/16.239 P /0.000

表2 不同分級(jí)OSCC組織中FGD5-AS1的表達(dá)水平(±s)Table2 Expression level of FGD5-AS1 in OSCC tissues of different grades

表2 不同分級(jí)OSCC組織中FGD5-AS1的表達(dá)水平(±s)Table2 Expression level of FGD5-AS1 in OSCC tissues of different grades

注:與G1 比較,*P＜0.05。Note.Compared with G1,*P＜0.05.

級(jí)別 Classification n FGD5-AS1 G1 43 0.79±0.18 G2 178 0.98±0.25*G3 62 1.32±0.41*G4 5 1.51±0.43*

2.2 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 中的表達(dá)

與正常組織相比,腫瘤組織中FGD5-AS1 表達(dá)顯著增加,miR-129-5p 表達(dá)顯著減少(P＜0.05),見表3。 與人口腔黏膜細(xì)胞HOK 相比,OSCC 細(xì)胞系SCC-9、HSC-4、SCC-25、CAL-27 中FGD5-AS1 表達(dá)明顯升高,miR-129-5p 表達(dá)顯著降低(P＜0.05),且CAL-27 細(xì)胞中FGD5-AS1 表達(dá)水平最高、miR-129-5p 表達(dá)最低,因此選擇CAL-27 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見表4。

表3 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 組織中的表達(dá)水平(±s,n=30)Table 3 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC tissues

表3 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC 組織中的表達(dá)水平(±s,n=30)Table 3 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC tissues

組織 Organization FGD5-AS1 miR-129-5p正常組織 Normal tissue 2.13±0.34 2.43±0.31腫瘤組織 Tumor tissue 4.78±0.59 0.89±0.12 t 21.315 25.375 P 0.000 0.000

表4 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平(±s,n=6)Table 4 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC cell line

表4 FGD5-AS1、miR-129-5p 在OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)水平(±s,n=6)Table 4 Expression level of FGD5-AS1 and miR-129-5p in OSCC cell line

注:與HOK 比較,*P＜0.05。Note.Compared with HOK,*P＜0.05.

細(xì)胞系 Cell line FGD5-AS1 miR-129-5p HOK 1.00±0.03 1.03±0.08 SCC-9 2.46±0.12* 0.45±0.04*HSC-4 3.47±0.23* 0.42±0.06*SCC-25 4.35±0.29* 0.39±0.05*CAL-27 5.12±0.34* 0.35±0.03*

2.3 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖的影響

si-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞中的FGD5-AS1 表達(dá)量、OD 值(48 h、72 h、96 h)、克隆細(xì)胞數(shù)顯著低于Control 組和si-NC 組(P＜0.05),見表5 和圖1。

圖1 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)的影響Figure 1 Effect of interfering with FGD5-AS1 on the number of OSCC cell clones

表5 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of FGD5-AS1 interference on OSCC cell proliferation

表5 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of FGD5-AS1 interference on OSCC cell proliferation

注:與Control 組比較,*P＜0.05;與si-NC 組比較,#P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.

組別Groups FGD5-AS1 OD 值(450 nm)OD value (450 nm)24 h 48 h 72 h 96 h克隆細(xì)胞數(shù)(n)Number of cloned cells Control 組Control group 1.00±0.06 0.46±0.03 0.75±0.09 1.16±0.13 1.40±0.25 489.52±56.23 si-NC 組si-NC group 0.99±0.05 0.49±0.05 0.78±0.11 1.14±0.15 1.42±0.23 488.94±56.12 si-FGD5-AS1 組si-FGD5-AS1 group 0.21±0.02*# 0.47±0.06 0.53±0.08*# 0.67±0.12*# 0.75±0.16*# 245.61±37.45*#

2.4 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲的影響

與Control 組和si-NC 組比較,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞凋亡率明顯上升,劃痕愈合率明顯降低,侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05),見表6 和圖2。

圖2 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移的影響Figure 2 Interference of FGD5-AS1 on apoptosis, invasion and migration of OSCC cells

表6 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲的影響(±s,n=6)Table 6 Effect of FGD5-AS1 interference on apoptosis, migration and invasion of OSCC cells

表6 干擾FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲的影響(±s,n=6)Table 6 Effect of FGD5-AS1 interference on apoptosis, migration and invasion of OSCC cells

注:與Control 組比較,*P＜0.05;與si-NC 組比較,#P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.

組別Groups凋亡率(%)Apoptosis rate劃痕愈合率(%)Scratch healing rate侵襲細(xì)胞數(shù)(n)Number of invasive cells Control 組Control group 3.74±0.13 83.45±9.21 89.26±10.15 si-NC 組si-NC group 3.72±0.17 84.16±9.34 88.47±10.24 si-FGD5-AS1 組si-FGD5-AS1 group 8.69±0.35*# 37.58±2.57*# 28.76±1.89*#

2.5 FGD5-AS1 靶向調(diào)控miR-129-5p 表達(dá)

Starbase 軟件預(yù)測(cè)顯示FGD5-AS1 與miR-129-5p 可能存在相互作用關(guān)系,具體的結(jié)合位點(diǎn)如圖3A 所示。 與NC mimics+WT-FGD5-AS1 組比較,miR-129-5p mimics+WT-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(P＜0.05),而NC mimics+MUT-FGD5-AS1組與miR-129-5p mimics+MUT-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化(P＞0.05),見圖3B。 與si-NC 組比較,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞中miR-129-5p 表達(dá)升高(P＜0.05);與pcDNA 組比較,pc-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞中miR-129-5p 表達(dá)降低(P＜0.05),見圖3C。

注:A:FGD5-AS1 與miR-129-5p 的結(jié)合位點(diǎn);B:驗(yàn)證FGD5-AS1 與miR-129-5p 靶向關(guān)系的雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果,與NC mimics+WTFGD5-AS1 組相比,*P＜0.05;C:FGD5-AS1 靶向調(diào)控miR-129-5p 表達(dá),與si-NC 組相比,*P＜0.05;與pcDNA 組相比,#P＜0.05。圖3 FGD5-AS1 靶向調(diào)控miR-129-5p 表達(dá)Note.A, Binding site of FGD5-AS1 and miR-129-5p.B, Results of dual luciferase activity detection to verify the targeting relationship between FGD5-AS1 and miR-129-5p.Compared with NC mimics+WT-FGD5-AS1 group,*P＜0.05.C, FGD5-AS1 targeted miR-129-5p expression.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Compared with pcDNA group,#P＜0.05.Figure 3 FGD5-AS1 targeted regulation of miR-129-5p expression

2.6 抑制miR-129-5p 可逆轉(zhuǎn)si-FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞的影響

與si-FGD5-AS1 組和si-FGD5-AS1+NC inhibitor組相比,si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組CAL-27 細(xì)胞中miR-129-5p 表達(dá)顯著降低,48 h、72 h 和96 h 的OD 值顯著升高,克隆細(xì)胞數(shù)明顯增多,細(xì)胞凋亡率明顯下降,劃痕愈合率顯著增加,侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05),見圖4 和表7。

圖4 抑制miR-129-5p 可逆轉(zhuǎn)si-FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響Figure 4 Inhibition of miR-129-5p can reverse the proliferation, apoptosis, invasion and migration of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

表7 抑制miR-129-5p 可逆轉(zhuǎn)si-FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞的影響(±s,n=6)Table 7 Inhibition of miR-129-5p can reverse the effect of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

表7 抑制miR-129-5p 可逆轉(zhuǎn)si-FGD5-AS1 對(duì)OSCC 細(xì)胞的影響(±s,n=6)Table 7 Inhibition of miR-129-5p can reverse the effect of si-FGD5-AS1 on OSCC cells

注:與si-FGD5-AS1 組相比,*P＜0.05;與si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組相比,#P＜0.05。Note.Compared with si-FGD5-AS1 group,*P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1+NC inhibitor group,#P＜0.05.

組別Groups miR-129-5p OD 值(450 nm)OD value (450 nm)24 h 48 h 72 h 96 h克隆細(xì)胞數(shù)(n)Number of cloned cells凋亡率(%)Apoptosis rate劃痕愈合率(%)Scratch healing rate侵襲細(xì)胞數(shù)(n)Number of invasive cells si-FGD5-AS1 3.38±0.32 0.48±0.04 0.55±0.10 0.69±0.14 0.78±0.17 245.74±38.21 8.57±0.29 36.75±2.63 29.46±2.04 si-FGD5-AS1+NC inhibitor 3.36±0.34 0.49±0.03 0.54±0.09 0.68±0.13 0.76±0.18 246.15±38.67 8.61±0.32 36.94±2.59 28.85±1.96 si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 1.21±0.15*# 0.51±0.07 0.81±0.16*# 1.21±0.16*# 1.45±0.27*# 497.89±86.52*# 4.03±0.11*# 84.24±5.62*# 91.26±7.38*#

2.7 FGD5-AS1 通過miR-129-5p 調(diào)控HMGB1 蛋白表達(dá)

與Control 組和si-NC 組相比,si-FGD5-AS1 組CAL-27 細(xì)胞中HMGB1 蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05); 與 si-FGD5-AS1 組 和 si-FGD5-AS1 + NC inhibitor 組相比,si-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor組CAL-27 細(xì)胞中HMGB1 蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),見圖5。

注:與Control 組相比,*P ＜0.05;與si-NC 組相比,#P ＜0.05;與si-FGD5-AS1 組相比,&P ＜0.05;與si-FGD5-AS1+NC inhibitor 組相比,△P＜0.05。圖5 各組OSCC 細(xì)胞中HMGB1 蛋白表達(dá)Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with si-NC group,#P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1 group,&P＜0.05.Compared with si-FGD5-AS1+NC inhibitor group,△P＜0.05.Figure 5 HMGB1 protein expression in OSCC cells of each group

2.8 FGD5-AS1 通過靶向miR-129-5p/HMGB1 促進(jìn)體內(nèi)OSCC 進(jìn)展

結(jié)果如圖6 所示,與sh-NC 組相比,sh-FGD5-AS1 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達(dá)及Ki67、HMGB1 陽性細(xì)胞比例顯著降低,miR-129-5p表達(dá)顯著升高(P＜0.05),而miR-129-5p inhibitor 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達(dá)及Ki67、HMGB1 陽性細(xì)胞比例顯著升高,miR-129-5p 表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與sh-FGD5-AS1 組相比,sh-FGD5-AS1+miR-129-5p inhibitor 組和miR-129-5p inhibitor 組腫瘤重量和腫瘤體積、FGD5-AS1 表達(dá)及Ki67、HMGB1 陽性細(xì)胞比例顯著升高,miR-129-5p表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

注:A、B:移植瘤組織中FGD5-AS1 和miR-129-5p 相對(duì)表達(dá)水平;C:不同組皮下腫瘤的代表性圖像;D:腫瘤重量比較;E:腫瘤體積比較;F:免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織中Ki67、HMGB1 陽性表達(dá)。 與sh-NC 組相比,*P＜0.05;與sh-FGD5-AS1 組相比,#P＜0.05。圖6 FGD5-AS1 通過靶向miR-129-5p/HMGB1 促進(jìn)體內(nèi)OSCC 進(jìn)展Note.A/B, Relative expression levels of FGD5-AS1 and miR-129-5p in transplanted tumor tissues.C, Representative images of subcutaneous tumors in different groups.D, Tumor weight comparison.E, Tumor volume comparison.F, Positive expressions of Ki67 and HMGB1 in tumor tissues were detected by immunohistochemical method.Compared with sh-NC group,*P＜0.05.Compared with sh-FGD5-AS1 group,#P＜0.05.Figure 6 FGD5-AS1 promotes OSCC progression in vivo by targeting miR-129-5p/HMGB1

3 討論

LncRNA 已被報(bào)道與OSCC 有關(guān)[15-16]。 有報(bào)道顯示FGD5-AS1 為OSCC 的潛在診斷生物標(biāo)志物,FGD5-AS1 的敲低可抑制OSCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。 本研究通過TANRIC 平臺(tái)的數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn),FGD5-AS1 在OSCC 中呈高表達(dá),且與預(yù)后不良相關(guān)[10]。 此外,本研究還發(fā)現(xiàn),OSCC 組織樣本和細(xì)胞系中FGD5-AS1 表達(dá)升高,敲低FGD5-AS1 后,CAL-27 細(xì)胞增殖活力、遷移和侵襲能力均受到抑制,細(xì)胞凋亡增加,這與以往的研究結(jié)果一致,提示FGD5-AS1 可能在OSCC 中起促癌基因作用[10]。

LncRNA 可以海綿吸附調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá),進(jìn)而調(diào)控癌癥進(jìn)展[17]。 miR-129-5p 可作為抑癌因子阻礙胃癌、肺癌、乳腺癌等發(fā)展[18-20]。 在本研究中,miR-129-5p 在OSCC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)均下降,這與Supic 等[14]的研究結(jié)果一致,說明miR-129-5p在OSCC 中發(fā)揮抑癌作用。 研究證實(shí),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FGD5-AS1 通過調(diào)控miR-129-5p 刺激Wnt/βcatenin 信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲[21]。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 與FGD5-AS1 的表達(dá)趨勢(shì)相反,Starbase 軟件預(yù)測(cè)miR-129-5p 可能是FGD5-AS1的靶基因。 本研究通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和過表達(dá)/敲低FGD5-AS1 實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FGD5-AS1 和miR-129-5p 的負(fù)向調(diào)控關(guān)系。 此外,抑制miR-129-5p 可減弱敲低FGD5-AS1 的腫瘤抑制作用,提示敲低FGD5-AS1 可能通過上調(diào)miR-129-5p 表達(dá),抑制OSCC 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)和查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),HMGB1 是miR-129-5p 的靶基因[12],Western blot 證實(shí)干擾FGD5-AS1 在上調(diào)miR-129-5p 表達(dá)的同時(shí)可抑制HMGB1 蛋白表達(dá)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證FGD5-AS1/miR-129-5p/HMGB1 軸在OSCC 中的作用,本研究建立了體內(nèi)異種移植瘤模型,發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)GD5-AS1 可通過調(diào)控miR-129-5p/HMGB1 軸來減弱OSCC 細(xì)胞的腫瘤發(fā)生,與體外結(jié)果一致,提示FGD5-AS1 通 過 調(diào) 控 miR-129-5p/HMGB1 促 進(jìn)OSCC 進(jìn)展。 但尚需設(shè)計(jì)HMGB1 過表達(dá)以確定FGD5-AS1/miR-129-5p 在異種移植模型OSCC 中的作用。

綜上所述,FGD5-AS1 在OSCC 中表達(dá)上調(diào),干擾FGD5-AS1 可通過靶向負(fù)調(diào)控miR-129-5p 表達(dá),抑制OSCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)凋亡。 本研究為FGD5-AS1 在OSCC 中的機(jī)制研究提供新依據(jù),有望為OSCC 患者提供一種潛在的治療策略。然而,miR-129-5p 下游的靶點(diǎn)眾多,FGD5-AS1/miR-129-5p 能否通過其他靶基因參與OSCC 進(jìn)展尚需進(jìn)一步探究。 此外,本研究?jī)H使用一種細(xì)胞系進(jìn)行FGD5-AS1 功能研究,后期將通過其他OSCC 細(xì)胞來進(jìn)一步驗(yàn)證FGD5-AS1 的致癌作用。