陳艷梅 王 川 劉亭亭 糜自豪 孫樂樂 趙 晴 王 娜 李麗宸 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟南,250022

天皰瘡(pemphigus)是由抗橋粒芯糖蛋白(desmogleins,Dsg)IgG抗體介導的自身免疫性疾病,主要類型有尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris,PV)和落葉型天皰瘡(pemphigus foliaceus,PF)。目前天皰瘡的發(fā)病機制尚未被完全闡釋清楚,但是產(chǎn)生自身致病性抗體的B淋巴細胞無疑在其中起到了關鍵作用,除此之外,B淋巴細胞還可導致促炎細胞因子的過度產(chǎn)生以及具有抗原遞呈作用,從而將先天免疫與適應性免疫聯(lián)系起來[1]。B淋巴細胞的激活與分化受到多種因素的調(diào)控,其中外源性和內(nèi)源性的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)配體,如脂多糖和HMGB1,都可以通過TLR4/MD2信號轉(zhuǎn)導激活B細胞[2,3];低氧條件下,趨化因子受體4型(C-X-C chemokine receptor type 4 ,CXCR4)通過核因子樣蛋白2(NRF2)和低氧誘導因子(HIF)-1α協(xié)同促進B細胞活性[4],說明CXCR4和TLR4對B細胞的發(fā)育及激活具有重要作用。CXCR4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)B細胞上呈高表達[5],TLR4在天皰瘡患者皮損部位表達增加[6],TLR4+CXCR4+漿細胞在SLE患者外周循環(huán)中增多并且推動系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎的發(fā)生[7]。由上可知,作為可能調(diào)控自身抗體產(chǎn)生的關鍵因素,TLR4和CXCR4在天皰瘡病理機制的作用知之甚少,本研究旨在探索TLR4和CXCR4在天皰瘡皮損及外周漿細胞中的表達,分析其在天皰瘡發(fā)病中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2021年6～12月山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院皮膚科收治的未經(jīng)免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療的,經(jīng)臨床表現(xiàn)、組織病理學、免疫病理學、特異性抗體檢測診斷的15例天皰瘡患者作為病例組,其中男8例,女7例,平均年齡(43.6±13.7)歲,另選取13名排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染等疾病的正常人作為對照組,其中男9名,女 4名,平均年齡(45.1±8.5)歲。天皰瘡患者和健康對照臨床和人口學特征見表1。

表1 天皰瘡患者和健康對照臨床和人口學特征

1.2 研究方法

1.2.1 流式細胞檢測 收取的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用含10%胎牛血清(FBS)的完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞至2×106/mL。取常用規(guī)格的流式管,每管加入1000 μL細胞懸液(2×106個細胞)。將之室溫條件下300 g離心5 min,收集細胞沉淀棄上清。將細胞以20% FBS的PBS緩沖液重懸,按照抗體說明書的要求在細胞懸液中加入FITC-抗Lin(CD3/14/16/19/20)抗體、PerCP-抗CD27抗體、BV650-抗CD138抗體、APC-抗CD38抗體、BV421-抗CD184(CXCR4)抗體和PE-抗CD284(TLR4)抗體(抗體均購自于BD公司),室溫條件下避光孵育15 min。然后按照上述條件進行離心,利用PBS緩沖液重懸細胞,離心收集細胞。細胞經(jīng)洗滌后用500 μL PBS重懸,然后進行流式細胞儀(BD FACSAriaTMFusion)上機分析。

1.2.2 免疫組織化學染色 對10%福爾馬林固定和石蠟包埋的活檢標本進行免疫組織化學染色。對每個標本,切5微米厚的連續(xù)切片,在75℃孵育60 min。切片在二甲苯中脫蠟,通過100%、95%和75%的分級酒精水合,用蒸餾水洗滌,然后進行過氧化物酶阻斷和蛋白質(zhì)阻斷,切片5% BSA封閉液處理60 min, 主要抗體為小鼠抗人TLR-4單克隆抗體(分類號ab22048,英國劍橋Abcam)和兔抗人CXCR-4單克隆抗體(Abcam;ab124824),將針對TLR4、CXCR4的抗體分別稀釋至1∶200和1∶500。在4℃與一抗孵育一夜后,PBS洗滌后利用第二抗體增強劑和二抗孵育30 min。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)輔助顯影。最后,切片放置于蘇木素中孵育,并通過乙醇和二甲苯脫水,封片后利用多光譜病理分析系統(tǒng)進行分析觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS Statistics軟件進行分析,進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計之前檢驗兩組之間符合正態(tài)分布,兩組之間差異性比較采用“兩獨立樣本t檢驗”方法,相關性分析采用“斯皮爾曼相關分析”方法,P<0.05時即證明兩組存在統(tǒng)計學差異。作圖用Prism軟件和Adobe illustrator軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 天皰瘡患者皮損部位和健康對照TLR4、CXCR4表達水平分析 免疫組織化學染色結(jié)果顯示,天皰瘡患者皮損部位TLR4、CXCR4表達水平明顯高于對照組皮膚組織(圖1)。就表達部位而言,對照組TLR4主要表達于皮膚組織表皮基底層(圖1a),而天皰瘡患者皮損部位TLR4主要表達于表皮基底層和基底層上,甚至表皮淺層(圖1a);對照組CXCR4主要表達于皮膚組織表皮基底層(圖1b),而天皰瘡患者皮損部位CXCR4主要表達于表皮基底層和基底層上(圖1b)。

1a:天皰瘡患者皮損部位TLR4表達水平明顯高于對照組皮膚組織;1b:天皰瘡患者皮損部位CXCR4表達水平明顯高于對照組皮膚組織

2.2 天皰瘡患者與健康對照外周循環(huán)中TLR4+CXCR4+漿細胞比例分析 我們先以Lin-CD27+進行圈門,然后收集CD38+CD138+漿細胞。分析顯示,與健康人相比(1.38±0.89),天皰瘡患者外周血PBMC中漿細胞(Lin-CD27+CD38+CD138+)的表達比例(3.26±1.90)增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2a、2b);然后我們在此基礎上,進一步收集TLR4+CXCR4+雙陽細胞,發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者漿細胞中TLR4+CXCR4+雙陽細胞表達比例(14.23±8.69)與健康對照(6.74±2.95)相比增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2c、2d。

2a、2b:天皰瘡患者外周血PBMC中漿細胞(Lin-CD27+CD38+CD138+)的表達比例增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);2c、2d:天皰瘡患者漿細胞中TLR4+CXCR4+雙陽細胞表達比例增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

3 討論

天皰瘡是一種自身抗體導致的皮膚疾病,可在患者血清檢測出Dsg1和Dsg3特異性自身抗體IgG,這些抗體由B淋巴細胞產(chǎn)生,是引起棘層細胞松解、皮膚、黏膜出現(xiàn)水皰的關鍵因素。B淋巴細胞的發(fā)育、分化與激活受多種因素的調(diào)控,例如B細胞激活因子(BAFF)、CD40-CD40L、B細胞表面受體信號等[8]。

TLRs是一類天然免疫受體,可直接識別結(jié)合病原相關分子模式,引起一系列信號轉(zhuǎn)導,進而導致炎性介質(zhì)的釋放,并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)[9]。TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關蛋白,幾乎分布于所有的細胞系,主要表達在參與宿主防御功能的細胞上,如淋巴細胞。隨著研究的不斷深入,TLR4越來越多的生物學功能被發(fā)現(xiàn),主要包括可誘導免疫炎性因子的合成和釋放,引發(fā)炎癥反應;促進免疫細胞膜表面表達相關免疫分子,加速免疫細胞的成熟和功能化,誘發(fā)特異性免疫;引發(fā)胞內(nèi)殺菌機制并協(xié)助機體對病毒的清除;與其它TLRs分子協(xié)同作用,相互影響對病原相關分子模式的識別[10,11]。TLR4被證明是所有TLRs中最復雜的信號排列,激活MAL-MYD88通路來誘導NF-κB信號或者激活TRAM-TRIF通路來誘導IRF3信號[12]。一旦激活,TLR4可以上調(diào)炎性細胞因子和趨化因子,并參與一系列細胞內(nèi)信號通路,以調(diào)節(jié)宿主炎癥反應的性質(zhì)、幅度或持續(xù)時間[13]。最近的研究表明,TLR4信號通路的過度激活與SLE和系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎炎的發(fā)生發(fā)展密切相關[14]。 伴侶分子(Gp96)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中TLR4信號的增加可以誘導狼瘡樣自身免疫性腎炎[15],說明TLR4信號的增加本身就是誘發(fā)自身免疫性疾病的充分和有效的觸發(fā)因素。此外,TLR4基因缺陷的小鼠表現(xiàn)出邊緣帶B細胞和參與狼瘡疾病發(fā)展的細胞因子均顯著減少[16]。Sun等發(fā)現(xiàn),天皰瘡患者皮損部位TLR4表達顯著增加[6]。

趨化因子是細胞因子超家族中一類具有趨向細胞定向移動的蛋白多肽,分為CXC、CX3C、CC、C等4類,作用于T細胞[17]和B細胞[18]。CXCR4是趨化因子CXCL12[chemokine (C-X-C motif)ligand 12,CXCL12]的受體,在體內(nèi)包括T細胞和B細胞的多種細胞上廣泛表達,屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族,是由352個氨基酸編碼的高度保守的G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜蛋白受體,與HIV感染、癌癥、造血干細胞的增殖、分化、歸巢有關。CXCL12是CXCR4的唯一配體,CXCL12/CXCR4參與B細胞和骨髓細胞的生成[19],整合蛋白的激活與趨化作用[17],CXCL12/CXCR4通路能夠促進樹突細胞的成熟,并參與表皮樹突細胞及朗格漢斯細胞向真皮遷移,從而啟動相應的免疫應答[20-22],是一對與自身免疫反應和炎癥反應有關的受體和配體。CXCR4在多種狼瘡鼠模型中高表達,特別是在B細胞和漿細胞等細胞上的表達水平上調(diào)[23];CXCL12 在狼瘡小鼠多種器官中的水平也升高[24];一些研究指出,CXCR4在幾種自身免疫性疾病的炎癥條件下,如多發(fā)性硬化癥和類風濕性關節(jié)炎中發(fā)揮了白細胞趨化作用[25]。此外,在大皰性類天皰瘡中,CXCL12與B細胞上CXCR4的結(jié)合通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc而導致B細胞分化和自身抗體的產(chǎn)生[1];CXCL12和CXCR4在大皰性類天皰瘡皮損中呈陽性表達[26]。

Ma等進一步發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血中,TLR4+CXCR4+漿細胞比例顯著升高。通過將系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠體內(nèi)TLR4+CXCR4+漿細胞轉(zhuǎn)移至Rag2缺陷的小鼠中,促進了Rag2缺陷小鼠自身抗體的產(chǎn)生及腎小球性腎炎的發(fā)展,證實了TLR4+CXCR4+漿細胞在SLE發(fā)展中的關鍵作用[7]。本文的研究結(jié)果與上述研究相一致,我們發(fā)現(xiàn)不僅TLR4、CXCR4在天皰瘡患者皮損部位表達水平顯著增高,而且TLR4和CXCR4在天皰瘡患者外周血單核細胞中數(shù)量顯著增多。既往研究表明,TLR4-/-小鼠表現(xiàn)出Th1、IFNγ和Th17相關IL-17A和IL-6細胞因子產(chǎn)生的顯著減少,抗dsDNA和抗RNP自身抗體水平均顯著降低。TLR4-/-小鼠腎損傷減輕,腎小球免疫球蛋白和補體沉積減少[27];相反,TLR4過表達導致自身免疫性腎小球腎炎[15];同樣地,在SLE中,CXCR4/CXCL12軸在致病PC遷移到炎癥器官(如腎臟)中起著重要作用[23]。

眾所周知,不同的自身免疫性疾病的病理機制存在較大區(qū)別。但天皰瘡患者和類天皰瘡患者皮損部位TLR4表達顯著增加[7];表達增加后的TLR4可以上調(diào)炎癥細胞因子和趨化因子[13]。在類天皰瘡中,CXCL12可趨化表達CXCR4的T淋巴細胞,引起T淋巴細胞浸潤,導致皰液形成[26],CXCL12/CXCR4軸通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc而導致B細胞分化和自身抗體的產(chǎn)生[1]。由此推之,TLR4和CXCR4可能在天皰瘡中驅(qū)動B細胞的趨化和分化,從而促進自身抗體的產(chǎn)生,在天皰瘡發(fā)病機制中起重要作用。