轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺葉色及生長變異分析

曹 俐 楊蘊力 李天芳 姜 靜*

（1.林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林業(yè)科學研究所，哈爾濱 150081）

Golden2-like（GLK）轉(zhuǎn)錄因子是GARP 轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，1926 年GLK 轉(zhuǎn)錄因子首次在黃化玉米（Zea mays）植株中被發(fā)現(xiàn)并命名［1］。GLK 轉(zhuǎn)錄因子通常包含2 個保守結(jié)構(gòu)域，即Myb-DNA 結(jié)構(gòu)域（DBD）和C-末端的GCT box［2］。GLK在植物葉綠體的形成和發(fā)育中起著重要作用，并參與植物細胞分化、果實品質(zhì)和葉片衰老等生物學進程以及各種防御過程（包括生物和非生物脅迫）［3-6］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGLK1和AtGLK2基因冗余調(diào)控葉綠體的發(fā)育［7］；在番茄（Solanum lycopersicum）中，GLK過表達增強了葉綠體發(fā)育和果實光合作用相關(guān)基因的表達，這些變異導致成熟果實中碳水化合物和類胡蘿卜素提高［8］。在玉米中，ZmGLK1被認為在C4 植物組織葉肉細胞葉綠體發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［2］。趙崢畑等［9］在連翹（Forsythia suspensa）基因組中鑒定出44 個FsGLK基因，其中FsGLK19 可能是黃葉型連翹呈色及響應(yīng)光照度的關(guān)鍵基因。在林木中，銀中楊（Populus alba×P.berolinensis）PaGLK過表達株系葉片顏色較對照株系更深，葉綠素含量增加，凈光合速率降低［10］。白樺（Betula platyphylla）BpGLK過表達株系葉綠素a/b 與野生型無顯著差異，葉色表現(xiàn)為深綠色［11］。上述研究表明，GLK基因參與植物葉綠體的發(fā)育，是創(chuàng)制黃葉植物的首選基因。

彩葉植物是指在整個生長季節(jié)或生長季節(jié)的某一階段全部或部分葉片較穩(wěn)定地呈現(xiàn)非綠色的植物［12］，具有獨特的觀賞價值，可以豐富園林景觀色彩，提高園林綠化景觀效果，提升城市綠化建設(shè)品位［13］，能夠符合人們對園林綠化審美的要求，被廣泛應(yīng)用于園林造景。常見的彩葉喬木樹種有紅葉李（Prunus cerasifera）、紅楓（Acer palmatum‘Atropurpureum’）、金 葉 國 槐（Sophora japonica‘Jinye’）、金 葉 皂 莢（Gleditsia triacanthos‘sunburst’）、黃金香柳（Melaleuca bracteata）等。彩葉植物呈現(xiàn)的顏色主要取決于葉綠素類、類胡蘿卜素類、類黃酮類這3 類色素的含量和比例。例如，金葉復(fù)葉槭（Acer negundo‘Aurea’）葉片顏色和葉片中的葉綠素、花色苷及類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)出時序變化［14］；金葉銀杏（Ginkgo biloba）葉總黃酮的含量及黃酮合成的能力均高于雄株和雌株［15］。目前有關(guān)彩葉植物葉片呈現(xiàn)的生理特性的研究較多，大多數(shù)從色素與葉色參數(shù)［16］、可溶性糖、相關(guān)酶類的關(guān)系等進行研究，為研究彩葉植物的呈色機理、分子機制及選育優(yōu)良品種、園林綠化配置提供理論基礎(chǔ)。

裂葉樺（Betula pendula‘Dalecarlica’）是歐洲白樺的一個品種，樹干潔白，枝條下垂，極具觀賞價值，可以作為園林綠化樹種［17］，由于其葉片多裂近年來成為科學研究的對象。作者所在研究團隊前期采用農(nóng)桿菌介導的莖段轉(zhuǎn)化法獲得8 個BpGLK基因抑制表達裂葉樺株系，其中5個株系葉片表現(xiàn)為黃綠色，3個株系表現(xiàn)為綠色［18］。為了了解轉(zhuǎn)Bp-GLK基因裂葉樺在生長期內(nèi)葉色的變異規(guī)律，以及葉片黃化后是否會對苗木的生長產(chǎn)生影響，試驗以轉(zhuǎn)BpGLK基因裂葉樺及野生型裂葉樺為材料，分析葉色參數(shù)和葉綠素含量的時序變化，探討葉綠素含量的降低對植株株高生長的影響，為后期轉(zhuǎn)基因裂葉樺在園林綠化中的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為2 年生轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺（RE1～RE8），野生型裂葉樺WT，每個株系30 株，種植于東北林業(yè)大學白樺育種基地。

主要質(zhì)粒載體以pFGC5941 載體構(gòu)建抑制表達載體p35S：：GLK-RNAi，由東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因裂葉樺分子檢測

為了檢測外源基因GLK和抗性基因Bar是否穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因植株DNA 基因組中，選取參試株系新鮮葉片利用植物DNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取葉片總DNA，以p35S：：GLK-RNAi 質(zhì)粒為陽性對照，以無菌水和WT 株系為陰性對照，以pFGC5941_CIS_F 和pFGC5941_CIS_R 為正向引物，以pFGC5941_Anti_F和pFGC5941_Anti_R 為反向引物，Bar-F 和Bar-R（見表1）進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系及程序參照楊蘊力［18］方法，反應(yīng)結(jié)束后，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

分別提取參試株系葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA 稀釋10 倍后作為定量qRT-PCR 的模板，以18S rRNA 為內(nèi)參基因，以q-glk-F 和q-glk-R（見表2）作為引物進行qRT-PCR分析，反應(yīng)體系及程序參考楊蘊力［18］方法。將得到的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法進行分析。

表2 qRT-PCR擴增引物序列Table 2 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 葉色調(diào)查

選取長勢相近的參試株系，每個株系調(diào)查10株，從2021年5月15日開始，每隔30 d采用分光色差儀（CR-400，日本）測定其L*值及b*值。

1.2.3 葉片葉綠素相對含量的測定

采用KONICA MINOLTA 便攜式葉綠素測定儀（SPAD-502 PLUS，日本）測定轉(zhuǎn)基因株系及對照株系功能葉（從頂芽數(shù)起的生長狀態(tài)一致的第4葉）的葉綠素相對含量（SPAD 值）。2021 年5 月15日為第1 個測量日期，9 月15 日結(jié)束，每30 d 對參試株系進行測定，每個株系分別調(diào)查10株。

1.2.4 葉綠素含量測定

選取轉(zhuǎn)基因株系及對照株系從頂芽數(shù)的第4片功能葉，每個株系選取3 個單株，將取的葉片樣品剪成細絲稱取0.200 0 g，放入裝有25 mL浸提液（V（丙酮）∶V（無水乙醇）=2∶1）的三角瓶中，室溫條件下暗處理24 h后，提取液分別于470、645、663 nm波長下測定吸光度，重復(fù)3次。葉綠素濃度按公式計算：

式中：A663、A645、A470分別為對應(yīng)波長下的吸光值；Ca、Cb、Ca+b和Cx，c分別為葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量濃度（mg·L-1）；ω為色素質(zhì)量分數(shù)（mg·g-1）；V為提取液總體積（mL）；mF為所取葉片鮮質(zhì)量（g）［19］。

1.2.5 苗高生長測定

用塔尺測量參試株系苗高，2021年5月1日為第1 個測量日期，10 月1 日結(jié)束，每15 d 對參試株系進行測定，每個株系分別調(diào)查15株。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用MATLAB Compiler Runtime 8.3 對苗高的生長規(guī)律進行Logistic 方程擬合。采用SPSS 27.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用雙因素方差分析不同株系的葉色參數(shù)及光合色素含量，當方差分析結(jié)果顯著時，采用Duncan法進行多重比較。并利用Origin 2021作圖。所有統(tǒng)計分析的顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺的分子檢測

分別以轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺株系的葉片總DNA為模板進行PCR 檢測，結(jié)果顯示：8 個轉(zhuǎn)基因株系均能檢測到與陽性質(zhì)粒大小一致的目的條帶，而水對照和WT 中沒有檢測出條帶（圖1），說明GLK基因及Bar基因整合于轉(zhuǎn)基因裂葉樺基因組中。

圖1 BpGLK抑制表達轉(zhuǎn)基因株系PCR擴增電泳圖譜A.正向PCR 檢測；B.反向PCR 檢測；C.Bar 基因PCR 檢測；M.DNA Maker DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照（ddH2O）；3.WT 株系；4～11.轉(zhuǎn)基因株系RE1～RE8Fig.1 Electrophoresis pattern of PCR amplification of BpGLK suppressed expression transgenic linesA.PCR for forward fragment；B.PCR for reverse fragment；C.PCR for Bar；M.DNA Maker DL2000；1.Positive plasmid；2.Negative contro（lddH2O）；3.WT line；4-11.Transgenic lines RE1-RE8

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示：8個抑制表達株系中BpGLK基因表達量均顯著低于WT 株系（圖2），8個轉(zhuǎn)基因株系均值較WT 株系下調(diào)64%。對各株系BpGLK基因相對表達量進一步分析，8個株系中BpGLK的表達水平不盡相同，葉色為黃綠色的RE1～RE5 株系的BpGLK相對表達量均值較WT 株系低80%，而葉色為綠色的RE6～RE8 株系均值僅較WT株系低43%。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株BpGLK相對表達量不同小寫字母表示同一時間下不同株系間相對表達量差異顯著（P＜0.05）Fig.2 Relative expression levels of BpGLK in transgenic plantletsDifferent lowercase letters indicate significant difference in relative expression among different lines at the same time（P＜0.05）

2.2 轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺的葉色變異分析

CIELab 表色系統(tǒng)中L*值是衡量葉色明暗程度的指標，L*值越大，葉片越亮，b*值表示葉片的藍黃屬性，+表示偏黃，-表示偏藍［20］。對不同發(fā)育期各參試株系的葉色參數(shù)L*值分析結(jié)果表明，在8個轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺株系中，RE1～RE5株系在4個測定時期都顯著高于WT 株系及RE6～RE8 株系（P＜0.05），而RE6～RE8株系在5 月15日高于或顯著高于WT株系，在6月15日低于或顯著低于WT株系，在7 月15 日和9 月15 日與WT 株系間的差異未達到顯著水平。各株系的L*值在6月15日達到最大，此時RE1～RE5株系的L*值均值較WT株系均值高9.39%、較RE6～RE8株系均值高15.09%（表3）。

4 個發(fā)育時期內(nèi)測定的b*值結(jié)果顯示：RE1～RE5 株系在4 個測定時期中b*值均顯著高于WT 株系及RE6～RE8 株系（P＜0.05）（表3）。RE6～RE8 株系在5 月15 日、7 月15 日均高于WT 株系，但未達到顯著水平，RE6 株系的b*值在6 月15 日低于WT 株系，RE7株系的b*值則在4 個時期均高于WT 株系，而RE8株系的b*值在6 月15日和9月15日2個時間點均低于或顯著低于WT株系（表3）。

表3 參試株系葉片L*值、b*值時序變化Table 3 Temporal variation of L*value and b*value in tested lines

圖3 參試株系的葉色Fig.3 Leaf color comparison of the tested lines

2.3 轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺的葉綠素相對含量變異分析

對4個時期的葉綠素相對含量進行測定，結(jié)果表明，RE1～RE5株系的SPAD 均值在4個時期均低于或顯著低于WT 株系，在9 月15 日時RE1～RE5株系的SPAD 均值較WT 株系低32.59%。在RE6～RE8 株系中，RE6 的SPAD 均值在前2 個時期均低于WT 株系，但未達到顯著水平；RE7 株系的SPAD 均 值 在5 月15 日和7 月15 日高于WT 株系，在6 月15 日顯著低于WT 株系；RE8 株系的SPAD均值僅在7月15日高于WT株系（表4）。

表4 參試株系葉綠素相對含量（SPAD值）時序變異Table 4 Temporal variation of relative chlorophyll content（SPAD）in the tested lines

2.4 轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺的葉綠素含量測定

為了解BpGLK基因的低量表達對裂葉樺葉片光合色素含量產(chǎn)生怎樣的影響，在6月、7月及9月中旬分別測定轉(zhuǎn)基因株系及WT株系葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。結(jié)果表明，RE1～RE5株系的葉綠素a 含量、葉綠素b 含量及總?cè)~綠素含量均顯著低于WT 株系且低于RE6～8 株系（表5～6），但RE1～RE5株系的葉綠素a與b比值卻顯著高于WT 株 系 和RE6～RE8 株 系（表5）。7 月 中 旬，RE1～RE6的類胡蘿卜素含量顯著低于WT株系，而RE7～RE8卻高于WT株系，在9月中旬，只有RE2株系的類胡蘿卜素含量高于WT株系，RE6和RE8株系的類胡蘿卜素含量顯著低于其他株系（P＜0.05）（表6）。

表5 參試株系葉片葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分數(shù)的比較Table 5 Comparison of Chlorophyll a and Chlorophyll b mass fractions in the leaves of the tested lines

表6 參試株系葉片總?cè)~綠素、類胡蘿卜素質(zhì)量分數(shù)的比較Table 6 Comparison of total Chlorophyll and Carotenoids mass fractions in the leaves of the tested lines

2.5 轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺生長變異分析

2.5.1 轉(zhuǎn)基因裂葉樺苗高生長模型建立與擬合

轉(zhuǎn)基因裂葉樺苗高測量從5月1日開始，至10月初封頂結(jié)束，測定時間為150 d。若2021 年1 月1 日起記為第1 天，則苗高開始測量的時間為第121 天（2021 年5 月1 日），測量結(jié)束時為第271 天。用4參數(shù)Logistic 方程式分別對參試株系苗高的平均值進行擬合，并繪制出生長曲線（圖4）。各生長模型方程的擬合系數(shù)（R2）均高于0.98，說明生長曲線擬合效果較好，可以用于后續(xù)分析。

圖4 轉(zhuǎn)基因株系樹高邏輯斯蒂擬合曲線Fig.4 Logistic fit curve of tree height of transgenic lines

由表7 可知，部分轉(zhuǎn)基因株系與WT 株系的苗高生長（即停止生長后的實測值）差異顯著（P＜0.05），RE4 和RE6 株系苗高生長顯著高于WT 株系及其他轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)基因株系苗高均值高于WT 株系的5.16%，RE5～RE8 株系的苗高速生點處生長速度均高于WT 株系，其中RE8 株系的最高，為2.260 cm·d-1。

表7 轉(zhuǎn)基因裂葉樺苗高的Logistic模型Table 7 Logistic model of seedling height in transgenic birch

2.5.2 轉(zhuǎn)基因裂葉樺速生期生長參數(shù)變異

轉(zhuǎn)基因裂葉樺苗高從5 月初開始生長，10 月初封頂，生長期約為150 d。轉(zhuǎn)基因株系與WT 株系從開始到進入速生期以及速生期結(jié)束的時間基本一致。由表8 可以得出，轉(zhuǎn)基因株系（除RE1 和RE3）在速生期內(nèi)苗高的平均生長量（GR）均高于WT 株系，其均值較WT 株系高10.80%。RE5～RE8株系的苗高日生長量均值（GD）高于WT 株系，RE1～RE4 株系（RE3 除外）的速生持續(xù)時長長于WT 株系，RE4 株系的速生持續(xù)時間較長，因此轉(zhuǎn)基因株系（RE3 除外）的封頂苗木實測值與WT 差異不顯著或顯著高于WT株系。

表8 參試株系速生期生長參數(shù)Table 8 Comparison of growth parameters of transgenic lines in the fast growth period

3 討論

裂葉樺葉緣具有分裂明顯的裂片，樹干潔白，枝條下垂［21］，在園林綠化中極具應(yīng)用推廣價值。以其為受體獲得的轉(zhuǎn)基因裂葉樺，在2年生時葉色表現(xiàn)為黃綠色，可以滿足園林綠化中對彩葉樹種的需求。GLK 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，目前的研究已經(jīng)證實了該轉(zhuǎn)錄因子在葉綠體發(fā)育、果實品質(zhì)、生物及非生物脅迫、植物衰老和激素等方面都有作用。GLK基因在擬南芥和苔蘚中表現(xiàn)出基因冗余，在擬南芥中，GLK基因能夠調(diào)控長角果果色和葉片發(fā)育，并且該基因過表達可以影響擬南芥根部葉綠體的發(fā)育［22-23］，ZmGLK1和ZmG2基因過表達水稻在田間條件下葉綠素、葉黃素含量及光合作用相關(guān)的蛋白復(fù)合體等均明顯提高［24］，水稻中GLKs可以與光合相關(guān)基因的啟動子結(jié)合，進而上調(diào)光合基因的表達，促進葉綠體的發(fā)育，提高水稻的光合作用和產(chǎn)量［25］。本試驗中裂葉樺BpGLK抑制表達，葉色為黃綠色的RE1～RE5株系在生長期內(nèi)葉片亮度L*值和葉片黃色程度的b*值均顯著高于WT 株系。葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝和能量代謝主要依靠光合作用來完成，只有進行光合作用的植物才能生長發(fā)育［26］。葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，葉綠素含量作為葉片重要的功能性狀，對植物的固碳和釋氧能力有顯著影響［27］。但葉綠素的合成受到多種酶和多個基因的調(diào)控，在水稻低葉綠素含量突變體中雖然葉綠素含量降低，但葉綠體的發(fā)育未受到影響，在高光強下，突變體沒有受到光抑制，光反應(yīng)電子傳遞未受到影響［28］，凈光合速率高于野生型［29］，谷子黃葉突變體光合色素含量下降，但在強光下光合速率明顯增加，氣孔導度、光能利用效率和轉(zhuǎn)化效率顯著增加，其產(chǎn)量相關(guān)性狀也顯著提高［30］。以上研究表明，適當降低葉綠素含量，不僅有利于減少光抑制，而且還有利于氮素在光合系統(tǒng)內(nèi)的分配，從而提高光合氮素利用效率［31-32］。GLK基因缺失及抑制表達可以使植物葉片變現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，并在大田中穩(wěn)定表現(xiàn)［10-11，33］。本試驗中，BpGLK抑制表達獲得的8 個轉(zhuǎn)基因株系中，RE1～RE5 株系的葉綠素相對含量，葉綠素a，葉綠素b 及總?cè)~綠素含量均低于或顯著低于WT株系，并且在生長封頂后，這些株系苗高均與WT株系差異不顯著或顯著高于WT株系（RE3株系除外），表明BpGLK抑制表達，對植物的生長不會產(chǎn)生不利影響，這與劉佳琦等［34］對轉(zhuǎn)BpGLK白樺的調(diào)查結(jié)果一致。因此，GLK基因可以作為選育黃葉樹種的候選基因，獲得的黃色樹種可以為園林綠化提供黃葉樹木資源。

4 結(jié)論

2 年生的轉(zhuǎn)BpGLK裂葉樺外源基因穩(wěn)定存在且GLK基因下調(diào)表達，同時，BpGLK基因抑制表達，并未影響裂葉樺株高生長，其中RE4株系停止生長時的苗高顯著高于WT株系，且葉色能夠穩(wěn)定表現(xiàn)為黃綠色，后期可以作為園林造景的優(yōu)選樹種。